Summary
Dit protocol beschrijft zowel in vivo-als ex vivo-methoden om hyaloïde vaten volledig te visualiseren en karakteriseren, een model van vasculaire regressie in muis ogen, met behulp van optische coherentie tomografie en fundus fluoresceïne angiografie voor de Live Imaging en ex vivo isolatie en daaropvolgende vlakke houder van hyaloïde voor kwantitatieve analyse.
Abstract
In het oog voeden de embryonale hyaloïde vaten de ontwikkelende lens en het netvlies en regressie wanneer de retinale bloedvaten zich ontwikkelen. Aanhoudende of mislukte regressie van hyaloïde vaten kan worden gezien bij ziekten zoals persistent hyperplastische primair glasvocht (PHPV), wat leidt tot een belemmerd lichtpad en een verminderde visuele functie. Inzicht in de onderliggende mechanismen van de hyaloïde bloedvat regressie kan leiden tot nieuwe moleculaire inzichten in het vasculaire regressie proces en potentiële nieuwe manieren om ziekten met aanhoudende hyaloïde vaten te beheersen. Hier beschrijven we de procedures voor het beeldvormende mellitus in levende muizen met optische coherentie tomografie (OCT) en fundus fluoresceïne angiografie (FFA) en een gedetailleerd technisch protocol van isolerende en platte mellitus ex vivo voor kwantitatieve analyse. Low-density lipoproteïne receptor-gerelateerde proteïne 5 (LRP5) Knockout muizen werden gebruikt als een experimenteel model van aanhoudende hyaloïde vaten, ter illustratie van de technieken. Samen kunnen deze technieken een grondige beoordeling van hyaloïde vaten mogelijk maken als een experimenteel model van vasculaire regressie en studies over het mechanisme van aanhoudende hyaloïde vaten.
Introduction
De bloedtoevoer in het oog is essentieel om de normale ontwikkeling van het netvlies en de omringende oculaire weefsels te waarborgen en een goede visuele functie uit te rusten. Er zijn drie vasculaire bedden in het oog: de retinale vasculatuur, de choroid en een voorbijgaande embryonale circulatie netwerk van hyaloïde vaten. De ontwikkeling van de oculaire vasculatuur vereist ruimtelijke en temporele coördinatie in de gehele embryogenese en weefsel rijping. Onder de drie vasculaire bedden is de mellitus vasculatuur het eerste functionele bloedtoevoer systeem dat voeding en zuurstof levert aan de nieuw gevormde embryonale lens en het ontwikkelende netvlies. Hyaloïde vaten regressie op hetzelfde moment dat de retina vasculaturen ontwikkelen en volwassen1. De regressie van hyaloïde vasculatuur is cruciaal om een duidelijk visueel traject voor de ontwikkeling van visuele functie mogelijk te maken; Vandaar, dit vasculaire regressie proces is net zo belangrijk als de groei van retinale vasculatuur. Verminderde hyaloïde regressie kan leiden tot oogziekten. Bovendien biedt de regressie van hyaloïde vaten een modelsysteem om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regulering van vasculaire regressie, wat gevolgen kan hebben voor de angiogene regulatie in andere organen ook.
De hyaloïde vasculatuur, afgeleid van de hyaloïde slagader (ha), bestaat uit Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa linzen (TVL) en pupil membraan (PM). Het biedt voeding aan de ontwikkelende retina, de primaire glasvocht, en de lens tijdens de embryonale ontwikkeling2. Als gevolg van de HA worden de VHP takken door het glasvocht naar de lens. De TVL cups het achterste oppervlak van de lens capsule, en anastomosen aan de PM, die aansluit op de voorste Ciliaire slagaders, die het voorste oppervlak van de lens2,3, resulterend in de vorming van een netwerk van schepen in de PM 3 , 4 , 5. interessant is dat er geen aderen in de hyaloïde vasculatuur zijn, en het systeem maakt gebruik van choroïdale aderen om veneuze drainage te bereiken.
In het menselijk embryo is de hyaloïde vasculatuur bijna voltooid bij ongeveer de negende week van de dracht en begint te regeren wanneer de eerste retinale vaten verschijnen, tijdens de vierde maand van de dracht2. Beginnend met atrofie van de VHP, regressie van de capillaire netwerken van de TVL, de PM, en ten slotte, de ha treedt vervolgens op2,3. Ondertussen trekt het primaire glasvocht in en de secundaire glasvocht begint te vormen, samengesteld uit de extracellulaire matrix componenten, waaronder collageenvezels. Door de zesde maand van de dracht wordt het primaire glasvocht gereduceerd tot een klein transparant kanaal dat zich uitstrekt van de oogzenuw schijf naar de lens, het Cloquet's kanaal of het hyaloïde kanaal, en het secundaire glasvocht wordt het hoofdbestanddeel van het posterieure segment 2 , 3. de hyaloïde circulatie verdwijnt meestal op 35 tot 36 weken van de dracht, net voor de geboorte3.
In tegenstelling tot mensen, bij wie hyaloïde vasculatuur volledig achteruit is bij de geboorte, begint het hyaloïde vasculaire systeem van de muis na de geboorte te vervallen. Naarmate het netvlies van de muis wordt geboren, worden avasculaire en retinale bloedvaten postnataal ontwikkeld, hyaloïde vaten komen gelijktijdig uit postnatale dag (P) 4 en zijn meestal volledig achteruit gaan door P216 (Figuur 1). De PM verdwijnt eerst tussen P10 en P12, en de VHP verdwijnt tussen P12 en P16, terwijl een klein aantal TVL-en ha-cellen zelfs bij P16 blijft, en door P21 de mellitus-vasculaire systeem regressie is bijna voltooid6. In de tussentijd begint retinale vasculatuur na de geboorte te ontwikkelen. De oppervlakkige laag van vasculaire plexus strekt zich volledig uit tot de perifere Retina bij P7-P8, de diepe laag (gelegen in de buitenste plexiforme laag) ontwikkelt van P7 – P12, en ten slotte ontwikkelt de tussenliggende plexus in de binnenste plexiforme laag tussen P12 en P157 . Naarmate de retinale vasculatuur zich ontwikkelt, vervangt deze geleidelijk de functie van gelijktijdig regressiehoudende hyaloïde vaten, waardoor voeding en zuurstof aan het ontwikkelende oog worden verstrekt. Het postnatale optreden van hyaloïde bloedvat regressie in muizen biedt een gemakkelijk toegankelijk experimenteel model om de hyaloïde vasculatuur te observeren en te bestuderen, evenals de moleculaire basis voor vasculaire regressie processen onder zowel fysiologische als pathologische condities8.
Falen van hyaloïde regressie kan worden gezien bij ziekten zoals PHPV, wat een zeldzame aangeboren ontwikkelings anomalie van het oog is, resulterend uit een mislukte of onvolledige regressie van de embryologische, primaire glasvocht en hyaloïde vasculatuur9. De mechanismen die het regressie proces van hyaloïde vasculatuur reguleren zijn ingewikkeld en breed bestudeerd. Een belangrijk moleculair traject essentieel voor de normale regressie van hyaloïde vaten is de Wnt signalering traject10, als genetische mutaties in dit traject beïnvloeden zowel WNT ligand en receptoren zijn gekoppeld met phpv bij de mens9. Experimentele studies identificeerden een WNT ligand, Wnt7b, die wordt geproduceerd door macrofagen rond hyaloïde vaten in de ontwikkelende ogen te bemiddel dit regressie proces. Wnt7b activeert WNT-signalering door binding met de receptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in aangrenzende endotheliale cellen om cel apoptosis te initiëren, wat leidt tot de regressie van hyaloïde vaten10. Dientengevolge, Wnt7b-deficiënte muizen tonen een persistentie van hyaloïde schepen10. Evenzo bindt een niet-conventionele WNT ligand, NorriN (gecodeerd door het NDP -gen), ook aan FZD4/LRP5 om de mellitus-bloedvat regressie tijdens de ontwikkeling te induceren. NDPy/-, Lrp5-/-, en Fzd4-/- muizen alle weergeven uitgesteld mellitus vessel regressie, ondersteuning van een cruciale regelgevende rol van WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Bovendien, een andere WNT coreceptor LRP6 overlapt met LRP5 in hun functie op het moduleren van de Wnt signalering traject in mellitus vasculaire endotheliale cellen17. Andere factoren die ook kunnen bijdragen aan de hyaloïde regressie omvatten de hypoxie-induciblefactor 18,19, vasculaire endotheliale groeifactor 20,21, collageen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, en botmorfogenetisch eiwit-426. In dit artikel gebruiken we Lrp5-/- muizen als een model van hardnekkige hyaloïde vaten om de technieken van het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde vasculatuur door zowel in vivo als ex vivo-methoden aan te tonen.
De visualisatie van mellitus vasculatuur in vivo en ex vivo is essentieel voor het bestuderen van de mechanismen van mellitus-bloedvat regressie. De huidige methoden voor het observeren van hyaloïde vasculatuur richten zich vooral op het visualiseren en analyseren van de VHP en ha, door middel van Oct-en FFA-beelden, oogdwars secties en de mellitus-vlakke bevestiging. OCT en FFA zijn krachtige in vivo beeldvormings hulpmiddelen, waardoor longitudinale observatie in levende dieren mogelijk wordt nadat ze hun ogen hebben geopend. Bovendien biedt geïsoleerde hyaloïde platte steun een visualisatie van de gehele mellitus-vasculatuur en een middel om een nauwkeurige kwantificering van de vaartuig nummers te bereiken. Toch kan de delicate en fragiele aard van de hyaloïde schepen en de daaruit voortvloeiende technische moeilijkheden van zijn isolement het gebruik ervan in oogonderzoek enigszins10,17,27hebben beperkt. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van de visualisatie van hyaloïde vaten, waarbij zowel in vivo levende retinale beeldvorming als ex vivo geïsoleerde hyaloïde platte steun wordt gecombineerd om de haalbaarheid van deze technieken te verbeteren. Dit protocol is aangepast met aanpassing en uitbreiding van eerdere publicaties over de in vivo-methode van Live fundus en OCT Imaging28 en de ex vivo-methode van geïsoleerde hyaloïde platte Mount11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de verklaring van de vereniging voor onderzoek in visie en oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek voor dierproeven, volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health ( NIH) met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de verordeningen die zijn uiteengezet door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) in het Boston Children's Hospital. Lrp5-/- muizen (stock nr. 005823; Jackson Laboratory) en zijn wild-type (WT) Control C57BL/6J muizen (stock nr. 000664; Jackson Laboratory) werden gebruikt voor deze studie.
1. deel I: in vivo beeldvorming van hyaloïde vaten met behulp van een knaagdier retinale beeld systeem
- Bereiding van de muizen anesthesie en pupilverwijding
- Selecteer de muizen.
- Gebruik muizen die ouder zijn dan P12 (nadat ze hun ogen hebben geopend) voor retinale beeldvorming; beide geslachten zijn geschikt.
- Zoals gewenst, beeld gemuteerde muizen met vertraagde hyaloïde regressie (en hun WT-besturingselementen) tijdens de volwassenheid. WT muizen ouder dan 3 weken vertonen mogelijk niet veel detecteerbare overgebleven hyaloïde vaten, vandaar P12-P21 is ideaal voor Imaging resterend zichtbaar WT mellitus.
- Bereid een mengsel van ketamine/xylazine voor anesthesie.
- Neem 2,3 mL ketamine stockoplossing (100 mg/mL) en 0,7 mL xylazine stockoplossing (20 mg/mL) en Voeg 20 mL steriele zout (0,9% natriumchloride) toe om een werkende oplossing van een ketamine/xylazine mengsel (10 mg/mL ketamine en 0,6 mg/mL xylazine) te maken.
- Anesthetiseer de muizen door intraperitoneaal injecteren van ketamine/xylazine mengsel in een volume van 8x het lichaamsgewicht van de muis (bijv. een 20 g muis heeft 160 μL ketamine/xylazine werkoplossing mengsel nodig om een werk dosis van ketamine te bereiken [80 mg/kg lichaamsgewicht] en xylazine [4,8 mg/kg lichaamsgewicht] mengsel).
- Breng één druppel pupil-verwijderende geneesmiddel oplossing (Zie tabel van de materialen) aan elk oog om de leerlingen van de muis onmiddellijk na de anesthesie te verwijden.
- Beoordeel het niveau van anesthesie door pedaal reflex (Firm hindledematen teen pinch). Wacht tot de muis voldoende verdoofd is (geen pedaal reflex) en de leerlingen zijn veel verwijd.
- Selecteer de muizen.
- Optische coherentie tomografie beeldvorming van hyaloïde vaten
- Hydrateer de cornea's van de muis met kunstmatige tranen en plaats de muis vervolgens op de positionerings fase.
- Neem voorzichtig contact op met het hoornvlies van de muis met de lens van de LGO-sonde. Stel de muis en sonde zo in dat de oogzenuw hoofd zich in het midden van het gezichtsveld van het fundus-beeld bevindt, om de LGO-Imaging te begeleiden.
Opmerking: voor meer informatie over de algemene opzet van een knaagdier retinale beeld systeem (Zie tabel van de materialen) en het aanpassen van de positie van de muis, zie Gong et al.28. - Pas de focus aan om de optimale beelden van OCT te bereiken.
- Pas de hoek van de aangegeven lijn in de LGO-beeldvormings software aan (Zie tabel met materialen) om hardnekkige hyaloïde vaten te onthullen en neem vervolgens afbeeldingen.
- F UNDUS f luorescein een heel ngiography beeldvorming van hyaloïde vaten
- Bereid een fluoresceïne oplossing voor: Voeg 9 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan 1 ml fluoresceïne vloeistof (stam concentratie: 100 mg/ml). De concentratie van de uiteindelijke werkoplossing is 10 mg/mL.
- Intraperitoneaal injecteert de werkoplossing van fluoresceïne (5 μL/g lichaamsgewicht).
- Hydrateer het hoornvlies van de muis met kunstmatige tranen en plaats de muis vervolgens op de positionerings fase.
- Positioneer de lens van de micron IV retinale beeld Microscoop om direct zacht contact te maken met de muis cornea. Pas de uitlijning enigszins aan om de oogzenuw hoofd in het midden van het weergaveveld te positioneren.
- Verander de Microscoop filter in een groen fluorescerende kanaal.
- Focus op hardnekkige hyaloïde vaten om beelden te maken.
- Neem meerdere afbeeldingen na 1 min, 3 min, 5 min en 10 min (niet meer dan 10 min) na de injectie om het beste tijdpunt (signaal-naar-achtergrond verhouding) voor het observeren van hyaloïde vaten te bepalen. Voltooi de FFA-procedure binnen 10 minuten, waarna de fluoresceïne kan te diffuter worden en schepen onzichtbaar maken.
- Herstel van de muizen van anesthesie
- Na de procedures, houd de muizen op een warme verwarming pad.
- Wacht tot de muizen weer mobiel zijn om ze terug te brengen naar de muis kooi.
2. deel II: ex vivo visualisatie van hyaloïde vaten
- Voorbereiding van vaste muis ogen
- Selecteer muizen van de juiste leeftijd.
Opmerking: neonatale muizen worden meestal geofferd bij P8 voor hyaloïde dissectie. Beide geslachten zijn geschikt. Mutante muizen met een vertraagde hyaloïde regressie (en hun respectieve WT-Controls) kunnen tijdens de volwassenheid worden ontleed en geanalyseerd. - De muizen euthaniëren door blootstelling aan CO2.
- Enucleate de ogen van de muis door stompe dissectie.
- Open de oogleden breed met een microchirurgie tang om toegang tot de oogbol toe te staan. Plaats gebogen microchirurgie Tang onder de aardbol in de baan om de oogzenuw te grijpen zonder knijpen in de oogbol. Trek voorzichtig aan en verwijder de oogbol met de Tang.
- Als alternatief, ontleden de oogbol met behulp van een microchirurgie schaar om zorgvuldig parallel aan de wereldbol te snijden van de vier zijden naar de achterkant van de baan en het scheiden van de aardbol van omringende bindweefsels.
- Dompel de ogen onder in 4% Paraformaldehyde in de PBS-buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor fixatie.
- Breng de vaste oogbollen over naar de ijskoude PBS-buffer.
Opmerking: de oogbollen kunnen maximaal 1 week in PBS bij 4 °C worden bewaard.
- Selecteer muizen van de juiste leeftijd.
- Inbedding van hyaloïde vaten met gelatine injectie
- Bereid een gelatine oplossing van 5% (w/v).
- Weeg 50 mg gelatine af.
- Los de gelatine op in 1 mL gedistilleerd water.
- Inbroed de gelatine oplossing in een waterbad van 37 °C tot deze volledig is opgelost. Houd de oplossing in 37 °C water tot het gebruik.
Opmerking: een grotere partij oplossing kan worden bereid en opgeslagen bij 4 °C als aliquots. Elke keer voor gebruik moet de oplossing worden opgewarmd in een waterbad van 37 °C om een duidelijke consistentie te bereiken.
- Injecteer onder een dissectie Microscoop 50 μL gelatine oplossing in het glasvocht lichaam bij de limbus; Herhaal de injectie 3x op verschillende plaatsen om in totaal vier injecties te maken, gelijkmatig verdeeld over de limbus (Figuur 2a).
- Inincubeer de oogbollen in een koelkast van 4 °C of op ijs gedurende 30 minuten om de geïnjecteerde gelatine in de glasachtige ruimte te stollen.
- Bereid een gelatine oplossing van 5% (w/v).
- Dissectie en isolatie van hyaloïde vaten
Opmerking: Zie afbeelding 2B-E.- Plaats de oogbollen in een Petri schaaltje met PBS om het weefsel niet te laten drogen. Maak een incisie met microchirurgie schaar bij de limbus en verwijder het hoornvlies.
- Knip en verwijder de oogzenuw.
- Onder een dissectie Microscoop, gebruik twee paren van de tang om af te pellen en gooi de Sclera, choroid, en retinale pigment epitheel (RPE) lagen en verwijder de Iris.
- Injecteer, met de optiek-zenuw kant van het netvlies naar boven gericht en de lens naar beneden, 50 μL PBS net onder de retina Cup om accumulatie van de PBS-buffer tussen het gelatiniseerde glasachtige lichaam en het netvlies mogelijk te maken.
- Verwijder voorzichtig de retina Cup en het tril lichaam uit het glasachtige lichaam met een microchirurgie Tang.
- Gebruik een pipet voor het overbrengen van de gelatine beker met het hyaloïde weefsel ondergedompeld in PBS naar een Microscoop-dia
- Draai de rest van het weefsel (lens/hyaloid) over, zodat de lens zijde omhoog wordt gericht.
- Til de lens op en maak de verbinding tussen de lens/TVL en VHP zachtjes los en snijd vervolgens de HA met een microchirurgie-schaar om de lens-TVL te verwijderen. Houd het VHP-onderdeel van de mellitus Cup voor de platte houder.
- Vlakke montage en kleuring van hyaloïde vaten
- Spoel de mellitus Cup voorzichtig af met PBS op de Slide om alle dissectie puin te verwijderen.
- Zorg ervoor dat de mellitus Cup op de glijbaan in adequate PBS-oplossing drijft.
- Voorzichtig regelen en aanpassen van de positie van de gelatiniseerde mellitus Cup met microchirurgie Tang, met de rand van de beker naar beneden op de glijbaan, om een optimale verschijning te bereiken na het smelten.
- Plaats de glijbaan met de hyaloïde beker ondergedompeld in PBS op een schuif warmer bij 37 °C, wacht tot de gelatine smelt en de hyaloïde afvlakt en verwijder de glijbaan wanneer deze nauwelijks droog is (niet te droog zijn).
- Optionele Immunostain de hyaloïde vaten
- Maak blokkerende en penetrerende buffer (bijv. 5% boviene serumalbumine [BSA] en 0,1% Triton X-100 in PBS-buffer). Voeg 50 μL blokkerende buffer toe aan een vlak gemonteerde hyaloïde isolatie en inincubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng 50 μL primair antilichaam (bijv. CD31) (1:100 verdunning in blokkerende buffer) aan op een vlakke houder van de hyaloïde isolatie en inbroed het vervolgens in een natte doos bij 4 °C 's nachts.
- Zachtjes spoelen 3x, voor 5 min elke keer, met PBS.
- Breng 50 μL secundair antilichaam aan (bijv. geit anti-konijn secundair antilichaam-Alexa 488, 1:100 verdunning) op de hyaloïde platte houder en inbroed deze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Zachtjes spoelen 3x, voor 5 min elke keer, met PBS.
- Voeg een druppel anti-fade-afdekmedium toe met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) om de kernen in de hyaloïde vaten te vlekken.
- Plaats een dekslip voorzichtig op de mellitus om de platte bevestiging te voltooien.
- Beeldvorming en kwantificering van vlak gemonteerde hyaloïde vaten
- Afbeelding de DAPI-kleuring van hyaloïde vaten met een fluorescerende Microscoop en zorg ervoor dat de centrale HA zichtbaar is (sluit de monsters uit zonder de HA).
- Identificeer de rechtstreeks uit de HA afgeleide scheeps takken en meet het aantal vaten voor kwantificering handmatig.
- Visualisatie van hyaloïde vaten in de dwarsdoorsnede van de ogen
- Sluit vaste oogbollen in een optimale snijtemperatuur verbinding in een geschikte weefsel mal, en Vries vervolgens de ingesloten ogen op droogijs of bewaar ze in een vriezer van-20 °C.
- Gebruik een cryostaat microtoom om een dwarsdoorsnede van de ingesloten ogen te maken in delen van 12 μm dikte bij-20 °C.
- Verzamel de oogdwars doorsneden op een Microscoop schuif kamertemperatuur door zachtjes aanraken van de weefsel secties, die zal zich houden aan de glijbaan.
- Lucht-droog om de weefsel secties te dehydra teren voor ~ 30 min, die vervolgens kunnen worden opgeslagen in een-20 °C vriezer tot klaar voor kleuring.
- Spoel de Slide 1x met PBS om de resterende optimale snijtemperatuur verbinding op de glijbaan te verwijderen.
- Optionele Dompel de dia in een geschikte fixatieve buffer (bv. 4% Paraformaldehyde in PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor extra fixatie, indien nodig.
- Permeabiliseer het weefsel met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid de isolectine-IB4 kleurings buffer voor de bloedvat kleuring.
- Los en reconstitueer isolectin-IB4 (500 μg) poeder met 50 mL PBS in een centrifugebuis van 50 mL.
- Voeg langzaam 50 μL van 1 M CaCl2 oplossing, druppel voor druppel, toe aan de 50 ml PBS/isolectine-IB4 mengsel. Deze stap moet langzaam worden uitgevoerd om neerslag te voorkomen. De uiteindelijke concentratie van CaCl2 is 1 μM. De aanwezigheid van CA2 + is vereist voor isolectine-IB4 kleuring.
- Breng 30 μL isolectine-IB4 kleuring buffer aan op de oogkruisingen op de glijbaan en inbroed deze in een natte doos bij 4 °C 's nachts.
- Spoel 3x, voor 5 min elke keer, met PBS.
- Voeg een druppel anti-fade-bevestigings medium met DAPI toe om de kernen in de secties te vlekken.
- Plaats een dekslip voorzichtig op de weefsel secties om de platte bevestiging te voltooien.
- Controleer het weefsel onder een microscoop om de aanwezigheid van hyaloïde vaten in de oogecup te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo beeldvorming van hyaloïde vaten in levende muizen
Figuur 3 A onthult transversale beelden van Oct-afbeeldingen voor de retina en hyaloïde weefsels in 3 maanden oude WT en Lrp5-/-muizen, een diermodel met aanhoudende hyaloïde. De WT oog toont de afwezigheid van mellitus weefsel, terwijl de Lrp5-/-Eye toont twee hardnekkige hyaloïde vaten afgeleid van de oogzenuw hoofd. Figuur 3 B geeft FFA-beelden van hardnekkige hyaloïde vaten (groen) in het fluorescerende veld in 6-weekse Lrp5-/- muizen. De WT-muis toont geen overblijfsel van hyaloïde vaten, en de Lrp5-/-Mouse toont acht takken van hyaloïde vaten in het glasachtige lichaam.
Ex vivo visualisatie van hyaloïde vaten
Figuur 4 A, B toont geïsoleerde hyaloïde vaten zoals gevisualiseerd in platte bevestigingen, waar vasculaire cellen en geassocieerde macrofagen werden bevlekt door hun kernen met DAPI-kleuring (blauw). De HA is in het midden van elke afbeelding, en hyaloïde schepen worden onthuld door de DAPI-afgeleide discontinue lijnen. Elke lijn vertegenwoordigt één vat van VHP. In Lrp5-/-muizen werden bij P8 in platte bevestigingen hogere aantallen overgebleven hyaloïde vaten waargenomen (Figuur 4A). De WT-muizen hadden gemiddeld 12 takken van hyaloïde vaten in P8, terwijl de Lrp5-/- pup's die op de leeftijd waren afgestemd, ongeveer 25 takken van hyaloïde vaten vertoonden, wat een significant verminderde regressie van hyaloïde vasculatuur vertoonde (Figuur 4 B). Bovendien, vertraagde en onvolledige Retina vasculaire ontwikkeling, een ander kenmerk vaak geassocieerd met aanhoudende hyaloïde vaten, werd ook waargenomen in de Lrp5-/- pups (Figuur 4C, D). Figuur 5 toont de overgebleven hyaloïde vaten in dwarsdoorsneden van Lrp5-/-ogen bij P8, terwijl de WT-ogen geen hyaloïde vaten vertonen.
Figuur 1 : Schematisch diagram met de ontwikkelings regressie van hyaloïde vasculatuur in muis ogen. Hyaloïde vaten en takken, waaronder VHP, TVL en PM, zijn afgeleid van de HA, en bezetten veel van de ruimte tussen de lens en het onrijpe netvlies bij de geboorte (P0). Hyaloïde involutie bij muizen begint met de regressie van PM capillairen al in P4. Bij P8 zijn PM-, VHP-en TVL-lagen voortdurend regressief, samen met de volledige vorming van de oppervlakkige laag van de retinale vaten. Door P12 is de involutie van de PM-laag compleet, terwijl de atrofie van VHP en TVL nog steeds in uitvoering is. Ondertussen begint een diepe laag retinale vaten te vormen tijdens P7-P12. Met P16 is de regressie van het hyaloïde systeem deels voltooid (met de resterende TVL-vaten en de HA-links) en blijft de tussenlaag van retinale vasculaire plexus zich ontwikkelen. De retinale vasculatuur is volledig volwassen door P21 en neemt de rol over van voedende retinale weefsels uit de hyaloïde vaten, die nu meestal worden teruggedraaid. Bij P21 toont het glasvocht, bij afwezigheid van hyaloïde vaten, een duidelijk visueel traject. Onderbroken rode lijnen vertegenwoordigen de regressierende schepen. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica vasculosa linzen; PM = pupil membraan; HA = hyaloïde slagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Schematisch diagram van de sequentiële procedure van de isolatie van het vaartuig van de hyaloïde voor ex vivo vlakke montage visualisatie. A) injectie van gelatine in het enucleated Eye door middel van vier injectie punten (rode stippen) bij de limbus, om het glasvocht lichaam te stollen. B) verwijdering van het hoornvlies en de oogzenuw, zorgvuldige dissectie van de Iris en afpellen van het Sclera-choroid-RPE-complex. C) de overgebleven retinale beker met de lens omdraaien om de retina zijde naar boven te brengen; vervolgens, het injecteren van PBS tussen het netvlies en het glasachtige lichaam om ze te scheiden, gevolgd door het afpellen van de retinale laag. D) de rest van het weefsel ondersteboven omdraaien, met de lens met de omringende hyaloïde. De lens lichtjes optillen om de aansluiting van TVL en VHP los te maken. E) snijden op de ha tussen de TVL en de VHP en het verwijderen van de lens en de TVL. Vlakke VHP-laag. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica vasculosa linzen; PM = pupil membraan; HA = hyaloïde slagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : In vivo beeldvorming van hyaloïde vaten met optische coherentie tomografie (OCT) en een fundus fluorescentie angiografie (FFA). A: representatieve Oct-beelden van WT en Lrp5-/-muizen bij een 3-maands-oud tonen aanhoudende hyaloïde vaten in de glasvocht ruimte in Lrp5-/-ogen. B: representatieve FFA-beelden van WT en Lrp5-/-muizen op 6 weken oud. Muizen werden geïnjecteerd met 1mg fluoresceïne natrium in 0,1 ml zoutoplossing per muis na anesthesie, en beelden werden genomen 5 min na injectie, gericht op hyaloïde vaten in Lrp5-/-muizen of glasvocht lichaam in WT (bij afwezigheid van hyaloïde vaten). Aanhoudende hyaloïde vaten werden gevisualiseerd in Lrp5-/-maar niet WT ogen. Rode pijlen duiden op hyaloïde vaten. Beide schaal staven: 100 μm (a). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Visualisatie van vertraagde hyaloïde bloedvat regressie en vertraagde retinale vasculatuur ontwikkeling in Lrp5-/-muizen. A) representatieve beelden van vlakke, met DAPI (blauw) gebladerde vaartuigen in WT en Lrp5-/-Eyes bij P8. Pijlen (wit) geven de hyaloïde slagader aan. B) kwantificering van het aantal hyaloïde vaten vertakkingen uit de hyaloïde slagader in WT en Lrp5-/-Eyes. C) representatief vlak-gemonteerd netvlies bevlekt met isolectine-IB4 (rood) voor de vasculatuur in WT en Lrp5-/-ogen bij P8. Witte onderbroken lijnen geven de retina rand aan. Gele lijnen geven de rand van het gevasculariseerde gebied aan. D) kwantificering van de vasculaire dekking van de oppervlakkige retinale vasculaire plexus in WT en Lrp5-/-ogen. n = 8 – 12/groep. De schaalbalken in de deelvensters A en C = 1 mm. de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. tweezijdige Student t-toets werd gebruikt voor statistische analyse. * *P < 0,01. Dit cijfer wordt gewijzigd met toestemming van Wang et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Visualisatie van hyaloïde vaten in dwarsdoorsneden van Lrp5-/-ogen. Representatieve beelden van dwarsdoorsneden van ogen geïsoleerd uit WT en Lrp5-/-muizen bij P8. De ogen werden enucleated en ingebed in een optimale snijtemperatuur, en secties werden gesneden met behulp van cryostat. De dwarsdoorsneden werden gekleurd met DAPI (blauw) om de kernen en isolectine-IB4 (rood) te tonen om de bloedvaten te laten zien. Witte pijlen duiden op hyaloïde vaten. De schaalbalk = 500 μm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Technieken voor het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde schepen zijn intuïtieve en noodzakelijke procedures om de mellitus-bloedvat regressie in diermodellen te observeren, om studies mogelijk te maken over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vasculaire regressie tijdens de ontwikkeling. Terwijl de in vivo retinale beeldvorming de longitudinale observatie van hyaloïde regressie in hetzelfde dier toestaat, kan de toegang tot een knaagdier fundus Imaging System voor OCT en FFA een beperkende factor zijn. Bovendien is in vivo beeldvorming in levende muizen niet haalbaar voordat ze hun ogen openen. Daarom is deze methodologie niet toepasbaar tijdens de oogontwikkeling in de neonatale fase. Aan de andere kant, terwijl Imaging cross secties van geïsoleerde ogen kunnen worden gebruikt voor elke leeftijd van de muis en heeft een lage technische barrière, het is niet kwantitatief wanneer er slechts een paar zichtbare hyaloïde vaten, en de kans op het verkrijgen van een ideaalbeeld hangt grotendeels af van de hoek van het snijden (Figuur 5). Ter vergelijking, de isolatie van hyaloïde vaten voor flat Mount visualisatie maakt de volledige beeldvorming van de hele mellitus vaartuig en nauwkeurige kwantificering, maar technische uitdagingen kunnen bestaan als gevolg van de delicate en fragiele aard van de hyaloïde vaten. We hopen dat het protocol dat in dit document wordt beschreven, deze uitdagingen helpt overwinnen.
Een aantal kritische stappen in de mellitus isolatie protocol omvatten de injectie van de gelatine oplossing, het verwijderen van het netvlies, en de laatste platte montage. De technische moeilijkheid van het hanteren van hyaloïde vasculatuur ligt in de delicate natuur, de bijna vloeibare-achtige toestand van glasvocht waar hyaloïde vaten zich bevinden, en de nauwe verbinding met de aangrenzende lens en het netvlies. Het injecteren van gelatine oplossing intravitecht is de sleutel tot het stollen van het glasachtige lichaam met hyaloïde vaten en daarmee hun textuur steviger maken voor gemakkelijker dissectie en handling. Gelatine is een Geleermiddel dat transparante elastische thermoreverbaar gels vormt. Door het injecteren van de vloeibare vorm van gelatine (bij kamertemperatuur of bij 37 °C) in de glasachtige ruimte en het afkoelen tot een lagere temperatuur (4 °C), transformeert het glasachtige lichaam in een stevigere gelcup. Het uitvoeren van meerdere gelatine injecties in het oog zorgt voor de volledige dispersie van een voldoende hoeveelheid van de gelatine in de vitreeuze ruimte, een uniforme en ronde gelatiniseerde hyaloïde weefsel beker vormen. Een andere technische moeilijkheid ligt in het verwijderen van het netvlies zonder beschadiging van hyaloïde weefsel. In tegenstelling tot de choroid, die relatief gemakkelijk te onderscheiden is, is het gelatiniseerde glasachtige lichaam dat hyaloïde vaten bevat een uitdaging om van het nabijgelegen netvlies te scheiden zonder de hyaloïde te beschadigen. We ontdekten dat het injecteren van PBS in de ruimte tussen het glasachtige lichaam en het netvlies een vloeistof buffer laag genereerde, waardoor het veel gemakkelijker is om deze twee weefsels te scheiden. Dit is enigszins vergelijkbaar met de hydrodissection-techniek die bij cataractchirurgie wordt gebruikt om de capsule en de cataract schors te scheiden. De uiteindelijke vlakke montage is de laatste technisch moeilijke stap van het protocol. Opwarming van de gelatiniseerde hyaloïde weefsel in een PBS druppel op een Slide warmer zet het terug naar een meer vloeistof-achtige vorm om gemakkelijker vlakke montage. De juiste opstelling en oriëntatie van de mellitus gel Cup is nog steeds essentieel om de gelijkmatige afvlakking na het smelten en drogen te garanderen.
Het Protocol van het isoleren van hyaloïde vaten kan op verschillende manieren verder worden gewijzigd. De concentratie van gelatine oplossing die we gebruikten is 5%, maar hogere of lagere concentraties kunnen ook werken, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker om een steviger of zachtere textuur voor de behandeling te bereiken. De DAPI-kleuring van cellulaire kernen kan ook worden gewijzigd met isolectine-IB4 of andere endotheelcel of macrofaag markeringen, om vasculaire endotheliale cellen beter te onderscheiden van macrofagen. Een woord van voorzichtigheid: de vlakke gemonteerde hyaloïde vaten zijn zeer delicaat en worden slechts losjes aan de glijbaan gehecht; Vandaar dat de hyaloïde glaasjes zeer voorzichtig en voorzichtig moeten worden behandeld als spoelen nodig is tijdens de kleuring. Dit isolatie protocol heeft ook zijn beperkingen, met inbegrip van de complexiteit van het uitvoeren van de boete dissectie en de moeilijkheid van de lange termijn bewaring van de monsters als gevolg van de aard van het fragiele weefsel. Niettemin is het isoleren en plat monteren van hyaloïde vaten nog steeds de meest uitgebreide en intuïtieve manier om hyaloïde vasculatuur te bestuderen, om oculaire en angiogenese studies te bevorderen10,17,27, 29,30,31.
De mellitus-vasculatuur biedt een uitstekend experimenteel model voor het bestuderen van groei en regressie van ontwikkelings schepen, relevant voor onderzoeksvelden in de oogheelkunde, angiogenese en geprogrammeerde celdood, waarmee dit papier is bedoeld om te helpen. Toekomstige wijzigingen van het isolatie protocol kunnen gericht zijn op het verbeteren van de haalbaarheid van een technische dissectie procedure. In het algemeen is de gecombineerde in vivo imaging en ex vivo isolatie van hyaloïde vaten een voordelige methode om de volledige beoordeling en karakterisering van hyaloïde vaten in muizen mogelijk te maken als een bruikbaar model van vasculaire regressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01 EY024963 en EY028100) aan J.C. Z.W. werd gesteund door een Knights Templar Eye Foundation Career starter subsidie. De hyaloïde isolatie procedure beschreven in deze studie werd aangepast met modificatie van protocollen royaal gedeeld door drs. Richard lang, Toshihide Kurihara, en Lois Smith, aan wie de auteurs zijn dankbaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
- Fruttiger, M.
- Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
