Summary
Dieses Protokoll beschreibt sowohl in vivo- als auch ex vivo-Methoden zur vollständigen Visualisierung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen, einem Modell der vaskulären Regression in Mausaugen, unter Verwendung von optischer Kohärenztomographie und Fundusfluorescein-Angiographie für die Live-Bildgebung und ex vivo Isolation und anschließende flache Montage von Hyaloid für die quantitative Analyse.
Abstract
Im Auge nähren die embryonalen Hyaloidgefäße die sich entwickelnde Linse und Netzhaut und treten zurück, wenn sich die Netzhautgefäße entwickeln. Eine anhaltende oder fehlgeschlagene Regression von Hyaloidgefäßen kann bei Krankheiten wie persistenten hyperplastischen Primärglaskörpern (PHPV) beobachtet werden, was zu einem verstopften Lichtpfad und einer beeinträchtigten Sehfunktion führt. Das Verständnis der Mechanismen, die der Regression des Hyaloidgefäßes zugrunde liegen, kann zu neuen molekularen Erkenntnissen über den vaskulären Regressionsprozess und potenziellen neuen Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten mit persistenten Hyaloidgefäßen führen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Abbildung von Hyaloid bei lebenden Mäusen mit optischer Kohärenztomographie (OCT) und Fundusfluorescein-Angiographie (FFA) und einem detaillierten technischen Protokoll der Isolierung und Flachmontage von Hyaloid ex vivo für die quantitative Analyse. Low-Density Lipoprotein-Rezeptor-bezogene Protein 5 (LRP5) Knockout-Mäuse wurden als experimentelles Modell von persistenten Hyaloid-Gefäßen verwendet, um die Techniken zu veranschaulichen. Zusammen können diese Techniken eine gründliche Bewertung von Hyaloidgefäßen als experimentelles Modell der vaskulären Regression und Studien über den Mechanismus persistenter Hyaloidgefäße erleichtern.
Introduction
Die Blutversorgung im Auge ist wichtig, um die normale Entwicklung der Netzhaut und des umgebenden Augengewebes zu gewährleisten und eine angemessene Sehfunktion zu gewährleisten. Es gibt drei Gefäßbetten im Auge: die Netzhautvaskulatur, die Aderhaut und ein vorübergehendes embryonales Kreislaufnetz von Hyaloidgefäßen. Die Entwicklung der okulären Vaskulatur erfordert räumliche und zeitliche Koordination während der Embryogenese und Gewebereifung. Unter den drei Gefäßbetten ist die Hyaloid-Vaskulatur das erste funktionelle Blutversorgungssystem, das der neu gebildeten embryonalen Linse und der sich entwickelnden Netzhaut Nahrung und Sauerstoff liefert. Hyaloidgefäße treten gleichzeitig zurück, dass sich die Netzhautvaskulaturen entwickeln und reifen1. Die Regression der hyaloiden Vaskulatur ist entscheidend, um einen klaren visuellen Weg für die Entwicklung der visuellen Funktion zu ermöglichen; Daher ist dieser vaskuläre Regressionsprozess ebenso wichtig wie das Wachstum der Netzhautvaskulatur. Beeinträchtigte Hyaloid-Regression kann zu Augenerkrankungen führen. Darüber hinaus bietet die Regression von Hyaloidgefäßen ein Modellsystem zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die an der Regulation der gefäßregression beteiligt sind, was Auswirkungen auf die angiogene Regulation auch in anderen Organen haben kann.
Die hyaloide Vaskulatur, abgeleitet von der Hyaloidarterie (HA), besteht aus Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa lentis (TVL) und Pupillenmembran (PM). Es versorgt die sich entwickelnde Netzhaut, den primären Glaskörper und die Linse während der embryonalen Entwicklung2. VHP, das aus dem HA entsteht, zweigt sich vordergründ durch den Glaskörper zur Linse. Der TVL bechert die hintere Oberfläche der Linsenkapsel und Anastomosen zum PM, der sich mit den vorderen Ziliararterien verbindet und die vordere Oberfläche der Linse2,3bedeckt, was zur Bildung eines Netzes von Gefäßen in der PM führt. 3 , 4 , 5. Interessanterweise gibt es keine Venen in der Hyaloid-Vaskulatur, und das System nutzt Adernvenen, um venöse Drainage zu erreichen.
Im menschlichen Embryo ist die Hyaloid-Vaskulatur etwa in der neunten Schwangerschaftswoche nahezu vollständig und beginnt sich zu regressieren, wenn die ersten Netzhautgefäße während des vierten Schwangerschaftsmonats2erscheinen. Beginnend mit der Atrophie des VHP, Regression der Kapillarnetze des TVL, der PM, und schließlich tritt die HA später2,3. In der Zwischenzeit beginnt sich der primäre Glaskörper zurückzieht und der sekundäre Glaskörper beginnt sich zu bilden, bestehend aus den extrazellulären Matrixkomponenten, einschließlich Kollagenfasern. Bis zum sechsten Monat der Trächtigkeit wird der primäre Glaskörper auf einen kleinen transparenten Kanal reduziert, der sich von der Sehnervenscheibe bis zur Linse erstreckt, der als Cloquet-Kanal oder Hyaloidkanal bezeichnet wird, und der sekundäre Glaskörper wird zum Hauptbestandteil des hinteren Segments 2 , 3. Die Hyaloidzirkulation verschwindet meist bei 35 bis 36 Wochen Schwangerschaft, kurz vor der Geburt3.
Im Gegensatz zum Menschen, bei dem die Hyaloid-Vaskulatur bei der Geburt vollständig zurückgeht, beginnt das hyaloide Gefäßsystem der Maus nach der Geburt zurückzufallen. Da die Mausnetzhaut avaskulär geboren wird und netzhautgefäße sich postnatal entwickeln, treten Hyaloidgefäße gleichzeitig vom postnatalen Tag (P) 4 zurück und werden meist vollständig durch P216 (Abbildung 1) zurückgeleitet. Die PM verschwindet zuerst zwischen P10 und P12, und die VHP verschwindet zwischen P12 und P16, während eine kleine Anzahl von TVL- und HA-Zellen sogar bei P16 verbleiben und durch P21 die Hyaloid-Gefäßsystemregression fast vollständigist 6. In der Zwischenzeit beginnt sich die Netzhautvaskulatur nach der Geburt zu entwickeln. Die oberflächliche Schicht des Gefäßplexus erstreckt sich vollständig auf die periphere Netzhaut bei P7–P8, die tiefe Schicht (in der äußeren Plexiformschicht) entwickelt sich aus P7–P12, und schließlich entwickelt sich der Zwischenplexus in der inneren Plexiformschicht zwischen P12 und P157 . Während sich die Netzhautvaskulatur entwickelt, ersetzt sie nach und nach die Funktion der gleichzeitig zurückgehenden Hyaloidgefäße und versorgt das sich entwickelnde Auge mit Nahrung und Sauerstoff. Das postnatale Auftreten der hyaloiden Gefäßregression bei Mäusen bietet ein leicht zugängliches experimentelles Modell zur Beobachtung und Untersuchung der Hyaloidvaskulatur sowie der molekularen Grundlage für vaskuläre Regressionsprozesse sowohl unter physiologischen als auch pathologische Bedingungen8.
Das Versagen der Hyaloid-Regression kann bei Krankheiten wie PHPV beobachtet werden, die eine seltene angeborene Entwicklungsanomalie des Auges ist, die aus einer fehlgeschlagenen oder unvollständigen Regression der embryonalen, primären Glaskörper- und Hyaloidvaskulatur9resultiert. Die Mechanismen, die den Regressionsprozess der Hyaloidvaskulatur regulieren, sind kompliziert und breit untersucht. Ein wichtiger molekularer Pfad, der für die normale Regression von Hyaloidgefäßen unerlässlich ist, ist der Wnt-Signalweg10, da genetische Mutationen in diesem Signalweg, die sowohl Wnt-Ligand als auch Rezeptoren betreffen, mit PHPV beim Menschen in Verbindung gebracht wurden9. Experimentelle Studien identifizierten einen Wnt-Ligand, Wnt7b, der durch Makrophagen um Hyaloidgefäße im sich entwickelnden Auge produziert wird, um diesen Regressionsprozess zu vermitteln. Wnt7b aktiviert Die Wnt-Signalisierung durch Bindung mit den Rezeptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in benachbarten Endothelzellen, um zellapoptose zu initiieren, was zur Regression der Hyaloidgefäße10führt. Als Ergebnis zeigen Wnt7b-Mangelmäuseeine Persistenz von Hyaloidgefäßen10. In ähnlicher Weise bindet ein nicht konventionelles Wnt-Ligand, Norrin (durch das Ndp-Gen kodiert), ebenfalls an FZD4/LRP5, um die Hyaloidgefäßregression während der Entwicklung zu induzieren. Ndpy/-, Lrp5-/-und Fzd4-/- Mäuse zeigen alle verschobene Hyaloidgefäßregression, die eine kritische regulatorische Rolle der Wnt-Signalisierung11,12unterstützt 13,14,15,16. Darüber hinaus überschneidet sich ein anderer Wnt-Corezeptor LRP6 mit LRP5 in seiner Funktion zur Modulation des Wnt-Signalwegs in hyaloiden vaskulären Endothelzellen17. Andere Faktoren, die auch zur Hyaloid-Regression beitragen können, sind der Hypoxie-induzierbare Faktor18,19, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor20,21, Kollagen-1822, 23, Arf24, Angiopoietin-225, und Knochen morphogenetisches Protein-426. In diesem Beitrag verwenden wir Lrp5-/- Mäuse als Modell persistenter Hyaloidgefäße, um die Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung der hyaloiden Vaskulatur durch in vivo- und ex vivo-Methoden zu demonstrieren.
Die Visualisierung der hyaloiden Vaskulatur in vivo und ex vivo ist für die Untersuchung der Mechanismen der Hyaloidgefäßregression von wesentlicher Bedeutung. Aktuelle Methoden zur Beobachtung der Hyaloid-Vaskulatur konzentrieren sich hauptsächlich auf die Visualisierung und Analyse von VHP und HA, durch OCT- und FFA-Bilder, Augenquerschnitte und die hyaloide Flachhalterung. OCT und FFA sind leistungsstarke In-vivo-Bildgebungswerkzeuge, die eine Längsbeobachtung bei lebenden Tieren ermöglichen, nachdem sie ihre Augen geöffnet haben. Darüber hinaus bietet die isolierte hyaloide Flachmontage die Visualisierung der gesamten hyaloiden Vaskulatur und ein Mittel, um eine genaue Quantifizierung der Gefäßzahlen zu erreichen. Doch die empfindliche und zerbrechliche Natur der Hyaloidgefäße und die daraus resultierenden technischen Schwierigkeiten seiner Isolierung können seine Verwendung in der Augenforschung etwas eingeschränkt haben10,17,27. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung von Hyaloidgefäßen zur Verfügung, das sowohl in vivo live retinale Bildgebung als auch ex vivo isolierte hyaloide Flachmontage kombiniert, um die Durchführbarkeit dieser Techniken zu verbessern. Dieses Protokoll wurde mit Modifikation und Erweiterung von früheren Veröffentlichungen über die In-vivo-Methode des Live-Fundus und der OCT-Bildgebung28 und die ex vivo-Methode der isolierten hyaloiden Flachhalterung11angepasst.
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Protocol
Alle Tiere wurden gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sichtforschung für Tierversuche gemäß den Richtlinien der Nationalen Gesundheitsinstitute ( NIH) in Bezug auf die Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und die Vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) im Boston Children es Hospital festgelegten Vorschriften. Lrp5-/- Mäuse (Bestands-Nr. 005823; Jackson Laboratory) und seine Wildtyp -(WT) Kontrolle C57BL/6J-Mäuse (Bestands-Nr. 000664; Jackson Laboratory) wurden für diese Studie verwendet.
1. Teil I: In-vivo-Bildgebung von Hyaloidgefäßen mit einem Nagetier-Retina-Bildgebungssystem
- Vorbereitung der Mäuseanästhesie und Pupillendilatation
- Wählen Sie die Mäuse aus.
- Verwenden Sie Mäuse, die älter als P12 sind (nachdem sie ihre Augen geöffnet haben) für die Netzhautbildgebung; beide Geschlechter sind geeignet.
- Wie gewünscht, Bild mutierte Mäuse mit verzögerter Hyaloid-Regression (und ihre WT-Kontrollen) während des gesamten Erwachsenenalters. WT-Mäuse, die älter als 3 Wochen sind, weisen möglicherweise nicht viel nachweisbare verbleibende Hyaloidgefäße auf, daher ist P12–P21 ideal für die Abbildung des sichtbaren WT-Hyaloids.
- Bereiten Sie eine Ketamin/Xylazin-Mischung für die Anästhesie vor.
- Nehmen Sie 2,3 ml Ketamin-Stammlösung (100 mg/ml) und 0,7 ml Xylazin-Stammlösung (20 mg/ml) und fügen Sie 20 ml steriles Saline (0,9 % Natriumchlorid) hinzu, um eine Arbeitslösung eines Ketamin/Xylazin-Gemischs (10 mg/ml Ketamin und 0,6 mg/ml Xylazin) herzustellen.
- Anästhesisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneally injizierenKetamin/Xylazin-Gemisch in einem Volumen von 8x des Körpergewichts der Maus (z.B. eine 20 g Maus benötigt 160 l Ketamin/Xylazin Arbeitslösung Gemisch, um eine Arbeitsdosis von Ketamin zu erreichen [80 mg/kg Körpergewicht] und Xylazin [4,8 mg/kg Körpergewicht]).
- Wenden Sie einen Tropfen pupilldilatierender Medikamentenlösung (siehe Materialtabelle)auf jedes Auge an, um die Schüler der Maus unmittelbar nach der Anästhesie zu erweitern.
- Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Hinterlimb-Zehen-Pinch). Warten Sie, bis die Maus ausreichend beästhebt ist (kein Pedalreflex) und ihre Pupillen sind weit verbreitet.
- Wählen Sie die Mäuse aus.
- Optische Kohärenztomographie von Hyaloidgefäßen
- Befeuchten Sie die Hornhäuten der Maus mit künstlichen Tränen, und legen Sie die Maus dann auf die Positionierbühne.
- Berühren Sie vorsichtig die Hornhaut der Maus mit der Linse der OCT-Sonde. Passen Sie die Maus und die Sonde so an, dass sich der Sehnervenkopf in der Mitte des Gesichtsfeldes im Fundusbild befindet, um die OCT-Bildgebung zu steuern.
HINWEIS: Weitere Informationen über die allgemeine Einrichtung eines Nagetier-Retina-Bildgebungssystems (siehe Materialtabelle)und die Einstellung der Position der Maus finden Sie unter Gong et al.28. - Passen Sie den Fokus an, um die optimalen Bilder von OCT zu erzielen.
- Passen Sie den Winkel der angegebenen Linie in der OCT-Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle) an, um persistente Hyaloidgefäße zu enthüllen und dann Bilder zu machen.
- F undus f luorescein a ngiographie Abbildung von Hyaloidgefäßen
- Eine Fluoresceinlösung vorbereiten: 9 ml sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zu 1 ml Fluoresceinlösung hinzufügen (Lagerkonzentration: 100 mg/ml). Die Konzentration der Endarbeitslösung beträgt 10 mg/ml.
- Intraperitoneal injizieren Sie die Fluorescein-Arbeitslösung (5 l/g Körpergewicht).
- Befeuchten Sie die Hornhaut der Maus mit künstlichen Tränen, und legen Sie die Maus dann auf die Positionierbühne.
- Positionieren Sie die Linse des Retinal-Bildgebungsmikroskops Micron IV, um direkten sanften Kontakt mit der Maushornhaut herzustellen. Passen Sie die Ausrichtung leicht an, um den Sehnervenkopf in der Mitte des Ansichtsfeldes zu positionieren.
- Ändern Sie den Mikroskopfilter in einen grünen Fluoreszenzkanal.
- Konzentrieren Sie sich auf persistente Hyaloidgefäße, um Bilder zu machen.
- Nehmen Sie mehrere Bilder nach 1 min, 3 min, 5 min und 10 min (nicht mehr als 10 min) nach der Injektion auf, um den besten Zeitpunkt (Signal-Hintergrund-Verhältnis) für die Beobachtung von Hyaloidgefäßen zu bestimmen. Schließen Sie das FFA-Verfahren innerhalb von 10 min ab, danach kann das Fluorescein zu diffus werden und Gefäße unsichtbar machen.
- Rückgewinnung der Mäuse aus der Anästhesie
- Halten Sie die Mäuse nach den Eingriffen auf einem warmen Heizkissen.
- Warten Sie, bis die Mäuse wieder mobil sind, um sie in den Mauskäfig zurückzubekommen.
2. Teil II: Ex-vivo-Visualisierung von Hyaloidgefäßen
- Vorbereitung fester Mausaugen
- Wählen Sie Mäuse des richtigen Alters aus.
HINWEIS: Neonatale Mäuse werden in der Regel bei P8 für Hyaloid-Sektion geopfert. Beide Geschlechter sind geeignet. Mutante Mäuse mit einer verzögerten Hyaloid-Regression (und ihren jeweiligen WT-Kontrollen) können während des gesamten Erwachsenenalters seziert und analysiert werden. - Euthanisieren Sie die Mäusedurch Die Exposition gegenüber CO2 .
- Enukleieren Sie die Augen der Maus durch stumpfe Sezierung.
- Öffnen Sie die Augenlider breit mit MikrochirurgieZangen, um den Zugang zum Augapfel zu ermöglichen. Platzieren Sie gekrümmte Mikrochirurgiezangen unter dem Globus in der Umlaufbahn, um den Sehnerv zu erfassen, ohne den Augapfel zu drücken. Ziehen und entfernen Sie den Augapfel vorsichtig mit der Zange.
- Alternativ können Sie den Augapfel sezieren, indem Sie eine mikrochirurgische Schere verwenden, um vorsichtig parallel zum Globus von den vier Seiten zur Rückseite des Orbits zu schneiden und den Globus von umgebenden Bindegeweben zu trennen.
- Tauchen Sie die Augen in 4% Paraformaldehyd in PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur zur Fixierung ein.
- Übertragen Sie die fixierten Augäpfel in den eiskalten PBS-Puffer.
HINWEIS: Die Augäpfel können bis zu 1 Woche lang in PBS bei 4 °C gelagert werden.
- Wählen Sie Mäuse des richtigen Alters aus.
- Einbettung von Hyaloidgefäßen mit Gelatineinjektion
- Bereiten Sie eine 5% (w/v) Gelatinelösung vor.
- Wiegen Sie 50 mg Gelatine ab.
- Die Gelatine in 1 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Die Gelatinelösung in einem 37 °C-Wasserbad inkubieren, bis sie vollständig gelöst ist. Bewahren Sie die Lösung in 37 °C Wasser auf, bis sie verwendet wird.
HINWEIS: Eine größere Charge der Lösung kann bei 4 °C als Aliquots vorbereitet und gelagert werden. Jedes Mal vor dem Gebrauch muss die Lösung im 37 °C-Wasserbad erwärmt werden, um eine klare Konsistenz zu erreichen.
- Injizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop 50 l Gelatinelösung in den Glaskörper am Limbus; Wiederholen Sie die Injektion 3x an verschiedenen Stellen, um insgesamt vier Injektionen zu machen, gleichmäßig um den Limbus verteilt (Abbildung2A).
- Die Augäpfel in einem 4 °C-Kühlschrank oder auf Eis 30 min bebrüten, um die injizierte Gelatine im Glaskörperraum zu erstarren.
- Bereiten Sie eine 5% (w/v) Gelatinelösung vor.
- Zerlegung und Isolierung von Hyaloidgefäßen
HINWEIS: Siehe Abbildung 2B-E.- Legen Sie die Augäpfel in eine Petrischale, die PBS enthält, um das Gewebe vor dem Trocknen zu bewahren. Machen Sie einen Schnitt mit mikrochirurgischer Schere am Limbus und entfernen Sie die Hornhaut.
- Schnippen und entfernen Sie den Sehnerv.
- Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop zwei Zangenpaare, um die Sklera-, Aderhaut- und Retinalpigmentepithel (RPE)-Schichten abzuziehen und zu entsorgen und die Iris zu entfernen.
- Mit der Seh-Nerven-Seite der Netzhaut nach oben und der Linsenseite nach unten, injizieren Sie 50 l PBS direkt unter der Netzhauttasse, um eine Ansammlung des PBS-Puffers zwischen dem gelatinierten Glaskörper und der Netzhaut zu ermöglichen.
- Abziehen und entfernen Sie den Netzhautbecher und den Ziliarkörper mit Mikrochirurgie-Zangen aus dem Glaskörper.
- Übertragen Sie mit einer Transferpipette den Gelatinenbecher mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidgewebe auf ein Mikroskopschlitten.
- Drehen Sie den Rest des Gewebes (Linse/Hyaloid) um, so dass die Linsenseite nach oben gerichtet ist.
- Heben Sie die Linse an und lockern Sie vorsichtig die Verbindung zwischen dem Objektiv/TVL und VHP, und schneiden Sie dann die HA mit einer Mikrochirurgie-Schere, um das Objektiv-TVL zu entfernen. Bewahren Sie den VHP-Teil des Hyaloidbechers für die flache Halterung auf.
- Flachmontage und Färbung von Hyaloidgefäßen
- Spülen Sie den Hyaloidbecher vorsichtig mit PBS auf der Rutsche ab, um alle Dissektionsreste zu entfernen.
- Stellen Sie sicher, dass die Hyaloid-Tasse in einer geeigneten PBS-Lösung auf der Rutsche schwebt.
- Ordnen Sie die Position des gelatinierten Hyaloidbechers vorsichtig an und passen Sie sie mit Mikrochirurgiezangen an, wobei der Rand des Bechers nach unten auf der Rutsche ausgerichtet ist, um nach dem Schmelzen ein optimales Aussehen zu erzielen.
- Legen Sie die Rutsche mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidbecher auf einen Gleitwärmer bei 37 °C, warten Sie, bis die Gelatine schmilzt und das Hyaloid abflacht, und entfernen Sie den Schlitten, wenn er kaum trocken ist (nicht übertrocknen).
- (Optional) Immunostain die Hyaloidgefäße
- Erstellen Sie blockierenden und durchdringenden Puffer (z. B. 5% Rinderserumalbumin [BSA] und 0,1% Triton X-100 im PBS-Puffer). Fügen Sie 50 L Blockierpuffer auf eine flach montierte Hyaloid-Isolierung und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 30 min.
- 50 L Primärantikörper (z. B. CD31) (1:100 Verdünnung im Sperrpuffer) auf eine flache Halterung der Hyaloidisolation auftragen und dann über Nacht in einer Nassbox bei 4 °C inkubieren.
- 3x vorsichtig abspülen, jeweils 5 min, mit PBS.
- 50 L Sekundärantikörper (z. B. Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper-Alexa 488, 1:100 Verdünnung) auf die hyaloide Flachhalterung auftragen und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
- 3x vorsichtig abspülen, jeweils 5 min, mit PBS.
- Fügen Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) hinzu, um die Kerne in den Hyaloidgefäßen zu färben.
- Legen Sie vorsichtig einen Deckelrutsch auf das Hyaloid, um die flache Halterung zu vervollständigen.
- Abbildung und Quantifizierung flach montierter Hyaloidgefäße
- Stellen Sie die DAPI-Färbung von Hyaloidgefäßen mit einem Fluoreszenzmikroskop auf und stellen Sie sicher, dass die zentrale HA sichtbar ist (ausgenommen die Proben ohne HA).
- Identifizieren Sie die direkt von der HA abgeleiteten Schiffszweige und zählen Sie die Anzahl der Schiffszweige für die Quantifizierung manuell.
- Visualisierung von Hyaloidgefäßen im Augenquerschnitt
- Fixe Augäpfel in eine optimale Schnitttemperaturverbindung in eine geeignete Gewebeform einbetten und dann die eingebetteten Augen auf Trockeneis einfrieren oder in einem Gefrierschrank von -20 °C aufbewahren.
- Verwenden Sie ein Kryostat-Mikrotom, um einen Querschnitt der eingebetteten Augen in Abschnitte mit einer Dicke von 12 m bei -20 °C zu machen.
- Sammeln Sie die Augenquerschnitte auf ein Mikroskop schieben Raumtemperatur durch sanfte saugen die Gewebeabschnitte, die auf der Folie haften.
- Lufttrocken, um die Gewebeabschnitte für 30 min zu dehydrieren, die dann in einem -20 °C Gefrierschrank gelagert werden können, bis sie zur Färbung bereit sind.
- Spülen Sie den Schlitten 1x mit PBS, um die verbleibende optimale Schnitttemperaturverbindung auf dem Schlitten zu entfernen.
- (Optional) Tauchen Sie das Dia in einen geeigneten Fixierpuffer (z. B. 4% Paraformaldehyd in PBS) für 15 min bei Raumtemperatur ein, um bei Bedarf eine zusätzliche Fixierung zu erhalten.
- Permeabilisieren Sie das Gewebe mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie Isolectin-IB4 Färbung Puffer für Blutgefäßfärbung.
- Isolectin-IB4-Pulver mit 50 ml PBS in einem 50 ml Zentrifugenrohr auflösen und rekonstituieren.
- Langsam 50 l von 1 M CaCl2 Lösung, Tropfen für Tropfen, in die 50 ml PBS/Isolectin-IB4-Mischung geben. Dieser Schritt muss langsam durchgeführt werden, um Niederschläge zu vermeiden. Die Endkonzentration von CaCl2 beträgt 1 m. Das Vorhandensein von Ca2+ ist für die Isolectin-IB4-Färbung erforderlich.
- Tragen Sie 30 L Isolectin-IB4-Färbepuffer auf die Augenquerschnitte auf dem Dia auf und inkubieren Sie ihn in einer Nassbox bei 4 °C über Nacht.
- Spülen Sie 3x, für 5 min jedes Mal, mit PBS.
- Fügen Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI hinzu, um die Kerne in den Abschnitten zu färben.
- Legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Gewebeabschnitte, um die flache Halterung zu vervollständigen.
- Überprüfen Sie das Gewebe unter dem Mikroskop, um das Vorhandensein von Hyaloidgefäßen in der Augentasse zu visualisieren.
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Representative Results
In-vivo-Bildgebung von Hyaloidgefäßen bei lebenden Mäusen
Abbildung 3 A zeigt Querschnittsansichten von OCT-Bildern für die Netzhaut und hyaloide Gewebe in 3 Monate alten WT und Lrp5-/-Mäusen, einem Tiermodell mit persistentem Hyaloid. Das WT-Auge zeigt das Fehlen von Hyaloidgewebe, während das Lrp5-/-Auge zwei persistente Hyaloidgefäße zeigt, die vom Sehnervenkopf abgeleitet sind. Abbildung 3 B zeigt FFA-Bilder persistenter Hyaloidgefäße (grün) im Fluoreszenzfeld in 6 Wochen alten Lrp5-Mäusen. Die WT-Maus zeigt kein Überbleibsel von Hyaloidgefäßen, und die Lrp5-/-Maus zeigt acht Zweige von Hyaloidgefäßen im Glaskörper.
Ex-vivo-Visualisierung von Hyaloidgefäßen
Abbildung 4 A,B zeigt isolierte Hyaloidgefäße, wie sie in flachen Halterungen visualisiert werden, wo Gefäßzellen und zugehörige Makrophagen durch ihre Kerne mit DAPI-Färbung (blau) gefärbt wurden. Die HA befindet sich in der Mitte jedes Bildes, und Hyaloidgefäße werden durch die von DAPI abgeleiteten diskontinuierlichen Linien aufgedeckt. Jede Linie stellt ein Schiff von VHP dar. In Lrp5-/-Mäusen wurden bei P8 in flachen Halterungen eine höhere Anzahl verbleibender Hyaloidgefäße beobachtet (Abbildung 4A). Die WT-Mäuse hatten durchschnittlich 12 Zweige hyaloider Gefäße bei P8, während die altersgerechten Lrp5-/- Welpen etwa 25 Zweige von Hyaloidgefäßen zeigten, was eine signifikant beeinträchtigte Regression der Hyaloidvaskulatur zeigte (Abbildung4 B). Darüber hinaus wurde auch eine verzögerte und unvollständige retinale Gefäßentwicklung, eine weitere Eigenschaft, die oft mit persistenten Hyaloidgefäßen in Verbindung gebracht wird, in den Lrp5-/- Welpen beobachtet (Abbildung 4C,D). Abbildung 5 zeigt die verbleibenden Hyaloidgefäße in Querschnitten von Lrp5-/-Augen bei P8, während die WT-Augen keine Hyaloidgefäße zeigen.
Abbildung 1 : Schematisches Diagramm, das die Entwicklungsregression der Hyaloidvaskulatur in Mausaugen darstellt. Hyaloidgefäße und -zweige, einschließlich VHP, TVL und PM, werden von der HA abgeleitet und nehmen einen großen Teil des Raumes zwischen der Linse und der unreifen Netzhaut bei der Geburt (P0) ein. Hyaloid-Involution bei Mäusen beginnt mit der Regression von PM-Kapillaren bereits in P4. Bei P8, PM, VHP und TVL treten die Schichten kontinuierlich zurück und treten mit der vollständigen Bildung der oberflächlichen Schicht der Netzhautgefäße zusammen. Mit P12 ist die Involution der PM-Schicht abgeschlossen, während die Atrophie von VHP und TVL noch im Gange ist. In der Zwischenzeit beginnt sich während P7–P12 eine tiefe Schicht von Netzhautgefäßen zu bilden. Durch P16 ist die Regression des Hyaloidsystems teilweise abgeschlossen (mit den verbleibenden TVL-Gefäßen und dem HA links), und die Zwischenschicht des retinalen Gefäßplexus entwickelt sich weiter. Die Netzhautvaskulatur ist durch P21 voll ausgereift und übernimmt die Rolle der nährenden Netzhautgewebe aus den Hyaloidgefäßen, die jetzt meist zurückgefallen sind. Bei P21 zeigt der Glaskörper in Ermangelung von Hyaloidgefäßen einen klaren Sichtweg. Gestrichelte rote Linien stellen die rückschrittigen Gefäße dar. VHP = vasa hyaloidea propria; TVL = tunica vasculosa lentis; PM = Pupillenmembran; HA = Hyaloidarterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Schematische darstellung des sequenziellen Verfahrens der Hyaloidgefäßisolierung für ex vivo Flachmontage Visualisierung. (A) Injektion von Gelatine in das enukleierte Auge durch vier Injektionspunkte (rote Punkte) am Limbus, um den Glaskörper zu verfestigen. (B) Entfernung der Hornhaut und des Sehnervs, sorgfältige Zerlegung der Iris und Abschälen des Sklera-Choroid-RPE-Komplexes. (C) Kippen der verbleibenden Netzhautbecher mit der Linse, um die Netzhautseite nach oben zu stellen; dann, Injektion von PBS zwischen der Netzhaut und dem Glaskörper, um sie zu trennen, gefolgt von Peeling von der Netzhautschicht. (D) Den Rest des Gewebes wieder auf den Kopf stellen und die Linse mit dem umgebenden Hyaloid enthalten. Heben Sie die Linse leicht an, um die Verbindung von TVL und VHP zu lösen. (E) Schneiden am HA zwischen dem TVL und dem VHP, und das Entfernen der Linse und TVL. Flachmontage-VHP-Schicht. VHP = vasa hyaloidea propria; TVL = tunica vasculosa lentis; PM = Pupillenmembran; HA = Hyaloidarterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : In-vivo-Bildgebung von Hyaloidgefäßen mit optischer Kohärenztomographie (OCT) und Fundus fluoreszenzangiographie (FFA). A: Repräsentative OCT-Bilder von WT und Lrp5-/-Mäuse im Alter von 3 Monaten, die persistente Hyaloidgefäße im Glaskörperraum in Lrp5-/-Augen zeigen. B: Repräsentative FFA-Bilder von WT und Lrp5-/-Mäuse im Alter von 6 Wochen. Mäuse wurden nach der Anästhesie mit 1mg Fluorescein-Natrium in 0,1ml-Saline pro Maus injiziert, und bilderwurden 5 min nach der Injektion aufgenommen, fokussiert auf Hyaloidgefäße in Lrp5-/-Mäuse oder Glaskörper in WT (in Abwesenheit von Hyaloidgefäßen). Persistente Hyaloidgefäße wurden in Lrp5 visualisiert -/-aber nicht in WT-Augen. Rote Pfeile zeigen Hyaloidgefäße an. Beide Skalenstäbe: 100 m (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Visualisierung der verzögerten Hyaloidgefäßregression und verzögerten Entwicklung der Netzhautvaskulatur bei Lrp5-/-Mäusen. (A) Repräsentative Bilder von flach montierten Hyaloidgefäßen, die mit DAPI (blau) in WT und Lrp5-/-Augen bei P8 gefärbt sind. Pfeile (weiß) zeigen die Hyaloidarterie an. (B) Quantifizierung der Anzahl der Hyaloidgefäße, die von der Hyaloidarterie in WT und Lrp5-/-Augen verzweigen. (C) Repräsentative flach montierte Netzhaut, die mit Isolectin-IB4 (rot) für die Vaskulatur bei WT und Lrp5-/-Augen bei P8 gefärbt ist. Weiße gestrichelte Linien zeigen die Netzhautkante an. Gelbe Linien zeigen die vaskularisierte Flächenkante an. (D) Quantifizierung der vaskulären Abdeckung des oberflächlichen retinalen Gefäßplexus in WT und Lrp5-/-Augen. n = 8–12/Gruppe. Die Skalenbalken in den Paneelen A und C = 1 mm. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. **P < 0,01. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Wang et al.27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Visualisierung von Hyaloidgefäßen in Querschnitten von Lrp5-/-Augen. Repräsentative Bilder von Querschnitten von Augen, die von WT und Lrp5 isoliert sind -/-Mäuse bei P8. Die Augen wurden enukleiert und in eine optimale Schnitttemperatur eingebettet, und Abschnitte wurden mit Kryostat geschnitten. Die Querschnitte wurden mit DAPI (blau) befleckt, um die Kerne und Isolectin-IB4 (rot) zu zeigen, um die Blutgefäße zu zeigen. Weiße Pfeile zeigen Hyaloidgefäße an. Der Maßstabsbalken = 500 m. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Chen et al.16angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen sind intuitive und notwendige Verfahren zur Beobachtung der Hyaloidgefäßregression in Tiermodellen, um Studien über die Mechanismen zu ermöglichen, die der gefäßregression während der Entwicklung zugrunde liegen. Während die in vivo retinale Bildgebung die Längsbeobachtung der Hyaloidregression bei demselben Tier ermöglicht, kann der Zugang zu einem Nagetier-Fundus-Bildgebungssystem für OCT und FFA ein begrenzender Faktor sein. Darüber hinaus ist in vivo Bildgebung bei lebenden Mäusen nicht möglich, bevor sie ihre Augen öffnen. Daher ist diese Methode während der Augenentwicklung im neonatalen Stadium nicht anwendbar. Auf der anderen Seite, während bildgebende Querschnitte von isolierten Augen für jedes Alter der Maus verwendet werden können und hat eine niedrige technische Barriere, es ist nicht quantitativ, wenn es nur wenige sichtbare Hyaloidgefäße, und die Chance, ein ideales Bild zu erhalten hängt weitgehend von der Schnittwinkel (Abbildung 5). Im Vergleich dazu ermöglicht die Isolierung von Hyaloidgefäßen zur Flachmontagevisualisierung die vollständige Abbildung des gesamten Hyaloidgefäßes und eine genaue Quantifizierung, doch aufgrund der empfindlichen und zerbrechlichen Natur von Hyaloidgefäßen können technische Herausforderungen bestehen. Wir hoffen, dass das in diesem Dokument beschriebene Protokoll dazu beiträgt, diese Herausforderungen zu bewältigen.
Mehrere kritische Schritte im Hyaloid-Isolationsprotokoll umfassen die Injektion der Gelatinelösung, die Entfernung der Netzhaut und die endgültige flache Montage. Die technische Schwierigkeit des Umgangs mit hyaloider Vaskulatur liegt in ihrer empfindlichen Natur, dem fast flüssigen Zustand des Glaskörpers, in dem hyaloide Gefäße liegen, und in seiner engen Verbindung mit der angrenzenden Linse und der Netzhaut. Die intravitdann injizierende Gelatinelösung ist der Schlüssel zur Erstarrung des Glaskörpers, der Hyaloidgefäße enthält, und dadurch ihre Textur fester für eine einfachere Zerlegung und Handhabung zu machen. Gelatine ist ein Geliermittel, das transparente elastische thermoreversible Gele bildet. Durch Injektion der flüssigen Form von Gelatine (bei Raumtemperatur oder bei 37 °C) in den Glaskörperraum und Abkühlen auf eine niedrigere Temperatur (4 °C) verwandelt sich der Glaskörper in einen strafferen Gelbecher. Die Durchführung mehrerer Gelatineinjektionen in das Auge ermöglicht die vollständige Dispersion einer ausreichenden Menge der Gelatine in den Glaskörperraum, um einen gleichmäßigen und runden gelatinierten Hyaloid-Gewebebecher zu bilden. Eine weitere technische Schwierigkeit liegt in der Entfernung der Netzhaut, ohne Hyaloidgewebe zu schädigen. Im Gegensatz zur Aderhaut, die relativ leicht voneinander zu sezieren ist, ist der gelatinierte Glaskörper, der Hyaloidgefäße enthält, schwierig, sich von der nahe gelegenen Netzhaut zu trennen, ohne das Hyaloid zu beschädigen. Wir fanden heraus, dass die Injektion von PBS in den Raum zwischen dem Glaskörper und der Netzhaut eine flüssige Pufferschicht erzeugte, was es viel einfacher machte, diese beiden Gewebe zu trennen. Dies ist etwas ähnlich wie die Hydrodissektionstechnik, die in der Kataraktchirurgie verwendet wird, um die Kapsel und den Katarakt-Kortex zu trennen. Die abschließende Flachmontage ist der letzte technisch schwierige Schritt des Protokolls. Durch die Erwärmung des gelatinierten Hyaloidgewebes in einem PBS-Tröpfchen auf einem Diawärmer wird es wieder in eine flüssigere Form umgewandelt, um eine einfachere flache Montage zu ermöglichen. Die richtige Anordnung und Ausrichtung des Hyaloid-Gelbechers ist nach wie vor wichtig, um seine gleichmäßige Abflachung nach dem Schmelzen und Trocknen zu gewährleisten.
Das Protokoll zur Isolierung von Hyaloidgefäßen kann auf verschiedene Weise weiter modifiziert werden. Die Konzentration der von uns verwendeten Gelatinelösung beträgt 5%, aber höhere oder niedrigere Konzentrationen können auch funktionieren, abhängig von der Präferenz des Forschers, eine festere oder weichere Textur für die Handhabung zu erreichen. Die DAPI-Färbung von Zellkernen kann auch mit Isolectin-IB4 oder anderen Endothelzellen oder Makrophagenmarkern modifiziert werden, um vaskuläre Endothelzellen besser von Makrophagen zu unterscheiden. Ein Wort der Vorsicht: Die flach montierten Hyaloidgefäße sind sehr empfindlich und nur lose am Schlitten befestigt; Daher müssen die Hyaloid-Dias sehr schonend und sorgfältig gehandhabt werden, wenn während der Färbung eine Spülung erforderlich ist. Dieses Isolationsprotokoll hat auch seine Grenzen, einschließlich der Komplexität der Durchführung der feinsedierenden Sezieren und der Schwierigkeit der langfristigen Konservierung der Proben aufgrund der Art des zerbrechlichen Gewebes. Dennoch ist die Isolierung und flachmontage hyaloiden Gefäße immer noch die umfassendste und intuitivste Möglichkeit, hyaloide Vaskulatur zu studieren, augen- und Angiogenesestudien zu fördern10,17,27, 29,30,31.
Die hyaloide Vaskulatur bietet ein ausgezeichnetes experimentelles Modell zur Untersuchung des Entwicklungsgefäßwachstums und der Regression, relevant für Forschungsbereiche in der Augenheilkunde, Angiogenese und programmierten Zelltod, mit dem dieses Papier helfen soll. Künftige Änderungen des Isolationsprotokolls können darauf abzielen, die Durchführbarkeit eines technischen Sezierverfahrens zu verbessern. Insgesamt ist die kombinierte In-vivo-Bildgebung und Ex-vivo-Isolierung von Hyaloidgefäßen eine vorteilhafte Methode, um die vollständige Bewertung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen bei Mäusen als nützliches Modell der vaskulären Regression zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 und EY028100) an J.C. Z.W. unterstützt, das von einem Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant unterstützt wurde. Das in dieser Studie beschriebene Hyaloid-Isolationsverfahren wurde mit Änderungen an Protokolle angepasst, die von Drs. Richard Lang, Toshihide Kurihara und Lois Smith großzügig geteilt wurden, denen die Autoren dankbar sind.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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