Summary
Bu protokol hem in vivo hem de ex vivo metotları, hiyoid damarların, fare gözlerindeki vasküler regresyon modeli, canlı görüntüleme ve ex vivo için optik uyum tomografi ve fundus florcein anjiyografi kullanılarak tam olarak görselleştirilmesi ve karakterize edilmesini tanımlar. izolasyon ve nicel analiz için hyaloid sonraki düz montaj.
Abstract
Göz içinde, embriyonik hiyojenik damarlarda Retina damarların gelişmesinde gelişen objektif ve Retina ve gerileme besler. Hiyoid damarların kalıcı veya başarısız regresyon, kalıcı hiperplastik primer vitreus (PHPV) gibi hastalıklarda görülebilir, engel olan bir ışık yoluna ve görsel fonksiyona zarar verebilir. Hyaloid damar regresyon temel mekanizmaları anlamak vasküler regresyon sürecine yeni moleküler anlayışlar ve kalıcı hyaloid damarlarla hastalıkları yönetmek için potansiyel yeni yollar neden olabilir. Burada, optik uyum tomografi (OCT) ve fundus floresan anjiyografi (FFA) ile canlı farelerde görüntüleme hyaloidinin prosedürlerini ve nicel analiz için düz montaj hyaloid ex vivo ile izole edilen ayrıntılı bir teknik protokol açıklanmaktadır. Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ile ilgili protein 5 (LRP5) nakavt fareler deneysel kalıcı hyaloid damarların modeli olarak kullanılan, teknikleri göstermek için. Bu teknikler birlikte, vasküler regresyon deneysel bir model olarak hyalooid damarların kapsamlı bir değerlendirme ve kalıcı hyaloid damarların mekanizması üzerinde çalışmalar kolaylaştırabilir.
Introduction
Göz kan kaynağı Retina ve çevredeki oküler dokularda normal gelişimini sağlamak ve uygun bir görsel fonksiyon donatmak için esastır. Göz üç vasküler yatak vardır: Retina damar, koroid, ve hyaloid damarların geçici embriyonik dolaşım ağı. Oküler damar gelişimi, embriyogenit ve doku olgunlaşma boyunca uzamsal ve temporal koordinasyon gerektirir. Üç vasküler yatak arasında, hyaloid damarsal yeni oluşturulan embriyonik objektif ve gelişmekte olan Retina beslenme ve oksijen sağlamak için ilk fonksiyonel kan kaynağı sistemidir. Hyaloid damarların aynı zamanda Retina vasculatures geliştirmek ve olgun1gerileme. Hyaloid damarsal regresyon görsel fonksiyon gelişimi için net bir görsel yol sağlamak için önemli olan; Bu nedenle, bu vasküler regresyon süreci Retina damarının büyümesi kadar önemlidir. Bozulmuş hyaloid regresyon göz hastalıklarına yol açabilir. Ayrıca, hyaloid damarların regresyon vasküler regresyon düzenlenmesi dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model sistemi sağlar, hangi de diğer organlarda anjiyojenik düzenleme için etkileri olabilir.
Hyaloid vasküler (ha), hiyoid damarsal, Vasa hyaloidea propria (vhp), tunika vaskas lentis (TVL) ve Pupiller membran (PM) oluşur. Bu gelişen retinaya beslenme sağlar, primer vitreus, ve embriyonik gelişim sırasında objektif2. Objektif vitreus aracılığıyla ha, vhp dalları anteriora kaynaklanan. TVL bardak lens kapsülünün posterior yüzeyi, ve anterior siliyer arterlere bağlanan PM anastomozlar, objektif anterior yüzeyi kapsayan2,3, PM gemiler bir ağ oluşumu sonuçlanan 3 ' ü , 4 , 5. ilginçtir, hyaloid damar içinde hiçbir damarlar vardır, ve sistem venöz drenajı gerçekleştirmek için koroid damarları kullanır.
İnsan embriyo, hyaloid damar neredeyse gebelikte yaklaşık dokuzuncu hafta içinde tamamlanmış ve ilk Retina damarların ortaya çıktığında gerileme başlar, gebelik dördüncü ayında2. Vhp atrofisi ile başlayan, TVL kapiller ağları regresyon, PM, ve son olarak, ha sonradan oluşur2,3. Bu arada, primer vitreus geri çeker ve ikincil vitreus forma başlar, kollajen lifleri de dahil olmak üzere, ekstrasellüler matris bileşenleri oluşur. Gebelik altıncı ay, primer vitreus lens için optik sinir diski uzanan küçük bir şeffaf kanala azalır, Cloquet kanalı veya hyaloid kanal denilen, ve ikincil vitreus posterior segmentin ana bileşeni haline gelir 2 , 3. hyaloid sirkülasyon çoğunlukla 35 kadar kaybolur 36 gebelik hafta, sadece Doğum3önce.
Insanlardan farklı olarak, kim hyaloid damar tamamen Doğum geriledi, fare hyaloid vasküler sistem doğumdan sonra gerileme başlar. Fare retinası doğduğunda avasküler ve Retina damarlarının postnatal gün (P) 4 ' ten aynı anda, hyaloid damarların gerileme ve çoğunlukla tamamen P216 (Şekil 1) tarafından gerilmiş. PM ilk P10 ve P12 arasında kaybolur ve VHP P12 ve P16 arasında kaybolur, TVL ve HA hücrelerin az sayıda bile P16 kalır, ve P21 hyaloid vasküler sistem regresyon neredeyse tam6. Bu arada, Retina damar doğduktan sonra gelişmeye başlar. Vasküler pleksakın yüzeysel tabakası P7 – P8 periferik retinaya tam olarak uzanır, derin tabaka (Outer pleksiform katmanında bulunur) P7 – P12 ' den gelişir ve son olarak, iç pleksiform katmanındaki ara plekbe P12 ile P15 7 arasında gelişir. . Retina damar gelişimi geliştikçe, gelişen gözle beslenmeyi ve oksijeni sağlayan hyalüroid damarların giderek gerilmesi fonksiyonunun yerini alır. Fareler içinde hyaloid damar regresyon postnatal oluşumu gözlemlemek ve hyaloid damarsal çalışma, hem fizyolojik ve altında vasküler regresyon süreçleri yöneten moleküler temelinde bir kolay erişilebilir deneysel model sağlar patolojik koşullar8.
Hyalüroid regresyon yetmezliği, embriyolojik, primer vitreus ve hyaloid damarsal9' da başarısız veya tamamlanmamış bir regresyon kaynaklanan göz nadir konjenital gelişimsel anomali olan PHPV gibi hastalıklarda görülebilir. Hyalüroid damarsal regresyon sürecini düzenleyen mekanizmalar karmaşık ve geniş bir şekilde incelenmiştir. Hiyoid damarların normal regresyon için gerekli olan bir büyük moleküler yol WNT sinyalizasyon yolu10, bu yol hem WNT ligand ve reseptörleri etkileyen genetik mutasyonlar Insanlar PHPV ile bağlantılı olduğu gibi9. Deneysel çalışmalar bir WNT ligand, Wnt7b, bu regresyon süreci aracılık için gelişmekte olan göz hyaloid damarların etrafında makrofajlar tarafından üretilen tespit. Wnt7b reseptörleri ile bağlama tarafından WNT sinyalizasyon etkinleştirir frizzled4 (FZD4)/LRP5 hücre apoptozis başlatmak için bitişik endotel hücrelerde, hyaloid damarların regresyon önde gelen10. Sonuç olarak, Wnt7b-eksikliği fareler hyaloid damarların bir kalıcılık göstermek10. Benzer şekilde, geleneksel olmayan bir WNT ligand, Norrin ( NDP geni ile kodlanmış), aynı zamanda FZD4/LRP5, geliştirme sırasında hyaloid damar regresyon neden bağlanır. NDPy/-, Lrp5-/-, ve Fzd4-/- fareler tüm ekran ertelendi hyaloid damar regresyon, WNT sinyalizasyon kritik bir düzenleyici rolünü destekleyen11,12, 13,14,15,16. Dahası, başka bir WNT coreceptor LRP6 hyaloid vasküler endotel hücrelerde WNT sinyalizasyon yolu modüle üzerindeki işlevlerinde LRP5 ile çakışıyor17. Hyaloid regresyon için de katkı sağlayan diğer faktörler arasında hypoxia-indüklenebilir faktör18,19, vasküler endotel büyüme faktörü20,21, kollajen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, ve kemik morfogenetik protein-426. Bu yazıda, hiyoid damarların hem in vivo hem de ex vivo yöntemlerle değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi tekniklerini göstermek için Lrp5-/- Mice ' i kalıcı hyalüroid damar modeli olarak kullanıyoruz.
Hyaloid damarsal in vivo ve ex vivo görselleştirme Hiyoid damar regresyon mekanizmaları incelemek için gereklidir. Hyaloid damarsal gözlemlemek için geçerli yöntemler özellikle görselleştirme ve VHP ve HA analiz odaklanmak, OCT ve FFA görüntüleri aracılığıyla, göz çapraz bölümler, ve hyaloid düz montaj. OCT ve FFA güçlü içinde vivo görüntüleme araçları, onlar gözlerini açtıktan sonra canlı hayvanların boyuna gözlem sağlar. Dahası, izole hyaloid düz montaj tüm hyaloid damar ölçünün görselleştirilmesini ve gemi numaralarının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için bir araç sağlar. Henüz hyaloid damarların hassas ve kırılgan doğası ve izolasyonlarının ortaya çıkan teknik zorluklarının göz araştırmalarında kullanımı biraz10,17,27sınırlı olabilir. Bu yazıda, bu tekniklerin fizibilitesini geliştirmek için hem in vivo canlı retina görüntüleme hem de ex vivo izole hyaloid düz montajı birleştiren hyaloid damarların görselleştirmesinde ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu protokol, Live fundus ve OCT Imaging28 ' in In vivo yöntemi ve yalıtılmış hyaloid Flat Mount11' in ex vivo yöntemi ile önceki yayınlardan değişiklik ve genişleme ile adapte edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nin yönergelerine uygun olarak, hayvan deneyleri için oftalmik ve vizyon araştırmalarında hayvanların kullanımı için vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) beyanı uyarınca tedavi edildi ( NıH), Boston Çocuk Hastanesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıanuc) tarafından belirlenen düzenlemeler ve deneysel prosedürler için hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili. Lrp5-/- fareler (stok No. 005823; Jackson Laboratuvarı) ve vahşi tip (WT) kontrol C57BL/6J fareler (stok No. 000664; Jackson Laboratuvarı) Bu çalışmada kullanıldı.
1. Bölüm ı: Hiyoid damarların bir kemirgen Retina görüntüleme sistemi kullanarak In vivo görüntüleme
- Fareler anestezi ve öğrenci genişletmesi hazırlanması
- Fareler seçin.
- Retina görüntüleme için P12 'den eski (gözlerini açtıktan sonra) fareler kullanın; Her iki cinsiyeler de uygundur.
- İstenilen şekilde, erişkin boyunca gecikmeli hyaloid regresyon (ve WT kontrolleri) ile görüntü mutant fareler. WT fareler daha eski 3 hafta çok algılanabilir kalan hyaloid damarlarını sergiler olmayabilir, bu nedenle P12-P21 görünür WT hyaloid kalan görüntüleme için idealdir.
- Anestezi için bir ketamin/xylazine karışımı hazırlayın.
- 2,3 mL ketamin stok solüsyonu (100 mg/mL) ve 0,7 mL xylazine stok çözeltisi (20 mg/mL) alın ve bir ketamin/xylazine karışımı (10 mg/ml ketamin ve 0,6 mg/mL xylazine) çalışma çözümü yapmak için 20 mL steril tuz (% 0,9 sodyum klorür) ekleyin.
- İntraperitoneal tarafından fareler anestezize ketamin/xylazine karışımı 8X fare vücut ağırlığı bir hacminde enjekte (örneğin, bir 20 g fare ihtiyacı 160 μL ketamin/xylazine çalışma çözeltisi karışımı bir çalışma dozu elde etmek için ketamin [80 mg/kg vücut ağırlığı] ve xylazine [4,8 mg/kg vücut ağırlığı] karışımı).
- Bir damla uygulayın öğrenci-seyreltilme ilaç solüsyonu (bkz. malzeme tablosu) her göz için hemen anestezi aşağıdaki fare öğrencilerin dilate.
- Pedallı refleks ile anestezi seviyesini değerlendirmek (firma hindekstremite parmak tutam). Fare yeterli anestezize kadar bekleyin (hiçbir pedal refleks) ve öğrenciler yaygın olarak genişlemis.
- Fareler seçin.
- Hyaloid damarların optik kooyans tomografi görüntüleme
- Yapay gözyaşı ile fare korneas nemlendirin ve daha sonra konumlandırma aşamasında fareyi yerleştirin.
- Hafifçe OCT prob lens ile fare kornea temas. Optik sinir kafası fundus görüntüsünde görsel alanın merkezinde, böylece EKIM görüntüleme rehberlik fare ve prob ayarlayın.
Not: bir kemirgen Retina Görüntüleme sisteminin genel kurulumu hakkında daha fazla bilgi için (bkz. malzeme tablosu) ve farenin konumunu ayarlayarak, lütfen Gong ve al.28' e bakın. - OCT optimum görüntüleri elde etmek için odağı ayarlayın.
- EKIM görüntüleme yazılımında belirtilen çizginin açısını ayarlayın (bkz. malzeme tablosu) kalıcı hyaloid damarlarını ortaya çıkarmak ve sonra görüntü almak.
- F undus f luorescein bir ngiography hyaloid damarların görüntülenmesi
- Bir floresan solüsyonu hazırlayın: 1 mL floresan çözeltisine (stok konsantrasyonu: 100 mg/mL) 9 mL steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Son çalışma çözeltisi konsantrasyonu 10 mg/mL 'dir.
- İntraperitoneally Floresan çalışma çözeltisi enjekte (5 μL/g vücut ağırlığı).
- Yapay gözyaşı ile fare kornea nemlendirin ve daha sonra konumlandırma aşamasında fareyi yerleştirin.
- Fare kornea ile doğrudan nazik temas yapmak için micron IV Retina Görüntüleme mikroskop objektif konumlandırın. Optik sinir kafasını görünüm alanının ortasına yerleştirmek için hizalamayı hafifçe ayarlayın.
- Mikroskop filtresini yeşil floresan Kanala değiştirin.
- Görüntü almak için kalıcı hyaloid damarlara odaklanın.
- Hyalooid damarların gözlemlenmesi için en iyi zaman noktasını (sinyal-arka plan oranı) belirlemek için 1 dakika, 3 dakika, 5 dakika ve 10 dakika (10 dakikadan fazla değil) sonrası enjeksiyon sonrasında birden fazla görüntü alın. 10 dk içinde FFA prosedürü tamamlayın, sonra floresan çok dağınık hale gelebilir ve gemiler görünmez hale.
- Anesteziden fareler kurtarma
- Prosedürlerden sonra, fareleri sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.
- Fareler tekrar fare kafesi onları dönmek için mobil olana kadar bekleyin.
2. Bölüm II: hyaloid damarların ex vivo görselleştirme
- Sabit fare gözleri hazırlanması
- Sağ yaşta fareler seçin.
Not: neonatal fareler genellikle hyaloid diseksiyonu için P8 ' da feda edilir. Her iki cinsiyet de uygundur. Gecikmeli hyaloid regresyon (ve ilgili WT kontrolleri) ile mutant fareler disseke ve yetişkin boyunca analiz edilebilir. - CO2' ye maruz kaldıktan sonra fareler öthanize.
- Fare gözleri künt diseksiyon ile enucleate.
- Göz topuna erişim sağlamak için mikrocerrahi forseps ile geniş gözkapaklarını açın. Göz topu sıkma olmadan optik sinir kavramak için yörüngede dünya altında kavisli mikrocerrahi forseps yerleştirin. Yavaşça çekin ve forseps ile göz topu çıkarın.
- Alternatif olarak, dikkatle yörünge arkasına doğru dört taraftan Dünya paralel kesmek ve çevreleyen bağ dokularından dünya ayıran mikrocerrahi makas kullanarak göz incelemek.
- PBS arabelleğinde% 4 civarında formaldehite içinde, sabitleme için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gözlerini batırın.
- Sabit gözbebekleri buz-soğuk PBS tampona aktarın.
Not: göz topları 1 haftaya kadar 4 °C ' de PBS 'de depolanabilir.
- Sağ yaşta fareler seçin.
- Jelatin enjeksiyonu ile hyaloid damarların gömülmesi
- % 5 (w/v) jelatin çözeltisi hazırlayın.
- 50 mg jelatin tartın.
- Jelatin 1 mL distile su içinde çözülür.
- Jelatin solüsyonu 37 °C ' lik su banyosuna tamamen çözünene kadar inküyin. Solüsyonu 37 °C ' de suya tutun.
Not: daha büyük bir çözüm grubu, 4 °C ' de aliquots olarak hazırlanabilir ve depolanabilir. Kullanmadan önce her zaman, çözüm net bir tutarlılık elde etmek için 37 °C su banyosunda ısıtılması gerekir.
- Bir Diseksiyon mikroskobu altında, limbus 'ta vitreus gövdesine 50 μL jelatin çözeltisi enjekte; dört enjeksiyonları toplam yapmak için farklı sitelerde enjeksiyon 3x tekrarlayın, limbus etrafında eşit aralıklı (Şekil 2a).
- Gözbebekleri 4 °C ' lik bir buzdolabında veya buzda 30 dakika boyunca inküstir, vitreus alanında enjekte edilen jelatin.
- % 5 (w/v) jelatin çözeltisi hazırlayın.
- Hiyooid damarların diseksiyonu ve izolasyonu
Not: bkz. Şekil 2B-E.- Doku kurutma tutmak için PBS içeren bir petri tabak göz gözleri yerleştirin. Limbus mikrocerrahi makas ile bir kesi yapmak ve kornea çıkarın.
- Optik sinirleri kaldırın ve çıkarın.
- Bir diseksiyon mikroskop altında, soyma ve sklera, koroid ve retina pigment epiteli (RPE) katmanları atmak ve iris kaldırmak için iki çift forseps kullanın.
- Retina optik-sinir tarafı yukarı dönük ve objektif tarafı aşağı, enjekte 50 PTL PBS sadece Retina fincan altında jelatinleştirilmiş vitreus vücut ve retina arasında PBS tampon birikimi sağlamak için.
- Mikrocerrahi forseps ile vitreus gövdesinin Retina kupasını ve siliyer gövdesini yavaşça çıkartın ve çıkarın.
- Bir transfer pipet kullanarak, PBS içine daldırılmış hyaloid dokusu içeren jelatin bardağı mikroskop kaydırağa aktarın
- Doku geri kalanı çevirin (lens/hyaloid) üzerinde, objektif tarafı yukarı bakacak şekilde.
- Objektif kaldırın ve hafifçe lens/TVL ve VHP arasındaki bağlantıyı gevşetin ve sonra, lens-TVL kaldırmak için mikrocerrahi makas ile HA kesti. Düz montaj için hyaloid bardak VHP-parçası tutun.
- Hyaloid damarların düz montaj ve boyama
- Tüm diseksiyon enkaz kaldırmak için hafifçe slayt üzerinde PBS ile hyaloid fincan durulayın.
- Hiyoid bardak yeterli PBS çözüm slayt üzerinde yüzen emin olun.
- Erittikten sonra optimum görünüm elde etmek için, jelatinleştirilmiş hyalüroid kupasını mikrocerrahi forseps ile hafifçe yerleştirin ve kaydırağa bakan bardak kenarı ile ayarlayın.
- 37 ° c 'de bir slayt sıcak üzerine PBS batırılmış hyaloid fincan ile slayt yerleştirin, jelatin erimesi ve hyaloid düzleştirir kadar bekleyin, ve ancak kuru olduğunda slayt kaldırmak (aşırı kuru).
- Isteğe bağlı İmmunostain hyaloid damarlarda
- Engelleme ve penetran tampon yapın (örn.,% 5 Sığır serum albümin [BSA] ve 0,1% Triton X-100 PBS tampon). 50 μL 'i düz monte hyaloid izolasyona takın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inküyeyin.
- 50 μL primer antikor (örn. CD31) (blok tamponunun 1:100 seyreltme) ile hyaloid izolasyonuyla düz bir montaj üzerine uygulayın ve ardından bir gecede 4 °C ' de ıslak bir kutuda inküye edin.
- PBS ile her seferinde 5 dakika boyunca 3 kat hafifçe durulayın.
- 50 μL ikincil antikor (örneğin, keçi Anti-tavşan ikincil antikor-Alexa 488, 1:100 seyreltme) hyaloid düz montaj üzerine uygulayın ve oda sıcaklığında 1 h için inkük.
- PBS ile her seferinde 5 dakika boyunca 3 kat hafifçe durulayın.
- Hyaloid damarlarda çekirdekleri lekelemek için DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ile Anti-Fade montaj orta bir damla ekleyin.
- Düz montaj tamamlamak için hyaloid üzerine hafifçe bir lamel magazini yerleştirin.
- Düz monte hyaloid damarların görüntüleme ve ölçümü
- Bir floresan mikroskop ile hyaloid damarların DAPı boyama görüntü ve merkezi HA görünür olduğundan emin olun (HA olmadan örnekleri hariç).
- Doğrudan HA 'dan elde edilen damar dalları tanımlayın ve miktar için damar dalları sayısını manuel olarak saymak.
- Gözler çapraz bölümünde hyaloid damarların görselleştirme
- Uygun bir doku kalıp içinde optimum kesme sıcaklığı bileşik içine sabit gözbebekleri embed, ve daha sonra, Kuru buz üzerinde gömülü gözleri dondurmak veya bir-20 °C dondurucu onları saklamak.
- Bir kriyostat mikrotome kullanın-20 °C ' de 12 μm kalınlığında bölümlere içine gömülü gözler bir kesit yapmak.
- Slayt uygun doku bölümleri, hafifçe dokunarak bir mikroskop slayt oda sıcaklığına göz çapraz bölümlerini toplayın.
- Hava-kurutmak için doku bölümleri ~ 30 dakika, daha sonra bir-20 °C dondurucu içinde boyama için hazır kadar depolanabilir.
- Slayt üzerinde kalan en uygun kesme sıcaklığı bileşiği kaldırmak için PBS ile 1x slaytı durulayın.
- Isteğe bağlı Gerekirse, ek sabitleme için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (örneğin, PBS 'de% 4 civarında formaldehite) uygun bir fikreatif tampona kaydırın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS 'de% 0,1 Triton X-100 ile dokusu geçirgen.
- Kan damar boyama için ısolectın-ıB4 boyama tamponu hazırlayın.
- 50 mL Santrifüjlü tüpte 50 mL PBS ile ısolectın-ıB4 (500 μg) tozu eritin ve yeniden oluşturur.
- Yavaşça 50 mL PBS/ısolectın-ıB4 karışımı içine, damla tarafından damla 1 M CaCl2 çözeltisi 50 μL ekleyin. Bu adımın yağış önlemek için yavaş yapılması gerekir. CaCl2 ' nin son konsantrasyonu 1 μM ' dir. Isolectın-ıB4 boyama için CA2 + varlığı gereklidir.
- Slayt üzerindeki göz kesitlerinden 30 μL ısolectın-ıB4 boyama tamponu uygulayın ve gece 4 °C ' de ıslak bir kutuda kulkayın.
- PBS ile her seferinde 5 dakika boyunca 3 kat durulayın.
- Bölümler çekirdekleri leke DAPı ile Anti-Fade montaj orta bir damla ekleyin.
- Düz montajı tamamlamak için doku bölümlerine yavaşça bir lamel magazini yerleştirin.
- Vizör adaptörü içinde hyaloid damarların varlığını görselleştirmek için bir mikroskop altında doku kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı fareler içinde hyaloid damarların In vivo görüntüleme
Şekil 3 3 aylık WT ve Lrp5-/-fareler, kalıcı hyaloid ile bir hayvan modeli Retina ve hyaloid dokular için Oct görüntüleri çapraz kesit görünümleri ortaya çıkarır. WT gözü hyaloid dokusunun yokluğunda gösterir, ancak Lrp5-/-Eye optik sinir kafası türetilen iki kalıcı hyaloid damarlarını gösterir. Şekil 3 B 6 haftalık Lrp5-/- fareler floresan alanında kalıcı hyaloid damarların (yeşil) FFA görüntüleri görüntüler. WT fare hyaloid damarların hiçbir kalıntıları gösterir, ve Lrp5-/-Mouse vitreus vücutta hyaloid damarların sekiz dalları gösterir.
Hiyoid damarların ex vivo görselleştirme
Şekil 4 A, B , damar hücrelerinin ve ilişkili makrofajların DAPI boyama (mavi) ile çekirdekleri tarafından lekelenmiş olduğu düz bağlar içinde görselleştirilen olarak izole hyaloid damarlarını gösterir. HA her görüntünün merkezinde, ve hyaloid damarlarının DAPı-türeyen ardışık çizgiler tarafından ortaya çıkar. Her satır VHP bir gemi temsil eder. İçinde Lrp5-/-fareler, kalan hyaloid damarların daha fazla sayıda gözlenen düz bağlar içinde P8 (Şekil 4A). WT farelerinde ortalama 12 hyalüroid damar dalı var, ancak yaş eşleştirilen Lrp5-/- pups, hyaloid damarların 25 dalının etrafında ortaya çıktı B). Buna ek olarak, gecikmeli ve tamamlanmamış Retina vasküler gelişim, genellikle kalıcı hyaloid damarlarla ilişkili başka bir karakteristik, Lrp5-/- Pups (Şekil 4C, D) de gözlenmiştir. Şekil 5 ' te Lrp5-/-Eyes 'in çapraz kısımlarında kalan hyaloid damarlarını P8 olarak gösterir, ancak WT gözleri hyalooid damarları görüntülemez.
Şekil 1 : Fare gözlerindeki hyaloid damarsal gelişimsel regresyonu tasvir eden şematik diyagram. Hyaloid gemiler ve VHP, TVL ve PM de dahil olmak üzere dalları, HA türetilir ve Doğum (P0) lens ve olgunlaşmamış Retina arasındaki boşluk çoğunu işgal. Farelerde hyaloid bulaşma P4 gibi erken PM kapillaries regresyon ile başlar. P8, PM, vhp ve TVL katmanları sürekli olarak retina damarların yüzeysel tabakasının tam oluşumu ile rastlantı, gerileme vardır. P12 tarafından, PM tabakasının olmaması tamamlandı, ancak VHP ve TVL atrofisi hala devam ediyor. Bu arada P7 – P12 döneminde Retina damarların derin bir tabakası oluşturmaya başlar. P16 tarafından, hyaloid sisteminin regresyon kısmen tamamlanmış (kalan TVL gemiler ve HA sol ile), ve Retina vasküler pleksusların ara tabakası geliştirmeye devam ediyor. Retina damar P21 tarafından tamamen olgunlaşmış ve artık çoğunlukla gerilenmiş olan hyaloid damarlardan besleyerek Retina dokuların rolünü devralır. P21 at, vitreous, hyaloid damarların yokluğunda, net bir görsel yol gösterir. Kesik kırmızı çizgiler, gerilme damarlarını temsil eder. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunika vaskas lentis; PM = Pupiller membran; HA = hyaloid arter. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Eski vivo için hyaloid damar yalıtımının sıralı prosedürünü tasvir eden şematik diyagram düz montaj görselleştirme. (A) limbus 'ta dört enjekte noktası (kırmızı nokta) ile enükleated göz içine jelatin enjeksiyon, vitreus gövdesini sağlamlaştırmak için. (B) kornea ve optik sinir kaldırılması, İris dikkatli diseksiyon, ve Sclera-koroid-RPE kompleksi soyuluyor. (C) Retina tarafı yukarı yüz yapmak için objektif ile kalan Retina fincan saygısız; sonra, retinayı ve vitreus vücut arasında PBS enjekte onları ayırmak için, Retina tabaka soyularak izledi. (D) çevreleyen hyaloid ile objektif içeren tekrar doku geri kalanı, ters saygısız. TVL ve VHP bağlantısını gevşetmek için biraz objektif kaldırma. (E) TVL ve vhp arasındaki ha kesme ve objektif ve TVL kaldırılması. Düz montaj VHP katmanı. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunika vaskas lentis; PM = Pupiller membran; HA = hyaloid arter. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Optik uyum tomografi ile hyaloid damarların In vivo görüntüleme (OCT) ve fundus floresans anjiyografi (FFA). A: WT ve Lrp5-/-farelerin temsilci Oct görüntüleri 3 aylık olarak Lrp5-/-Eyes vitreus uzayda kalıcı hyaloid damarlarını gösteren. B: 6-hafta-eski WT ve Lrp5-/-fareler temsilcisi FFA görüntüleri. Fareler anestezi sonra fare başına 0.1 ml tuzlu 1 mg florcein sodyum ile enjekte edildi, ve görüntüleri enjekte sonra 5 dk alınmıştır, Lrp5-/-fareler veya vitreus vücutta Hiyoid damarlara odaklanan (hyaloid damarların yokluğunda). Kalıcı hyaloid damarlarda Lrp5-/-değil WT gözleri görüntüleşmiş. Kırmızı oklar hyaloid damarlarını gösterir. Her iki ölçek çubukları: 100 μm (A). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Lrp5-/-Mice gecikmeli hyaloid damar regresyon ve Gecikmeli Retina damar geliştirme görselleştirme. (A) WT ve Lrp5-/-Eyes 'te DAPI (mavi) ile lekelenmiş düz monte hyaloid damarların temsili görüntüleri P8. Oklar (beyaz) hyaloid arter gösterir. (B) WT ve Lrp5-/-Eyes hyaloid arter dallanma hyaloid damarların numaralarının ölçümü. (C) WT 'de damarsal ve Lrp5-/-Eyes için ısolectın-ıb4 (kırmızı) ile lekelenmiş düz montajlı Retina, P8. Beyaz kesikli çizgiler Retina kenarı gösterir. Sarı çizgiler vaskülarize alan kenarı gösterir. (D) WT ve Lrp5-/-Eyes yüzeyel Retina vasküler pleksusının vasküler kapsamının ölçülmesini. n = 8 – 12/grup. Panellerdeki ölçek çubukları A ve C = 1 mm. veri ortalama ± SEM olarak gösterilir. istatistiksel analizler için iki kuyruklu öğrencinin t-testi kullanılmıştır. * *P < 0,01. Bu rakam Wang ve al.27' den izin ile değiştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Lrp5-/-Eyes çapraz bölümlerde hyaloid damarların görselleştirme. MICE ve Lrp5-/-Mice ' at P8 ' dan izole edilen gözlerin çapraz bölümlerinin temsili görüntüleri. Gözler enükle ve optimum kesme sıcaklığında gömülü, ve bölümler cryostat kullanılarak kesildi. Çapraz bölümler, kan damarlarını göstermek için çekirdekleri ve ısolectın-ıB4 (kırmızı) göstermek için DAPı (mavi) ile lekelenmiş edildi. Beyaz oklar hyaloid damarlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakam Chen ve al.16' dan izin ile adapte edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hiyoid damarların değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi teknikleri, geliştirme sırasında vasküler regresyon temel mekanizmaları üzerinde çalışmalar sağlamak için, hayvansal modellerde hyaloid damar regresyon gözlemlemek için sezgisel ve gerekli prosedürler vardır. In vivo Retina Görüntüleme aynı hayvan içinde hyaloid regresyon uzunlamasına gözlem sağlar iken, OCT ve FFA için bir kemirgen fundus görüntüleme sistemine erişim sınırlayıcı bir faktör olabilir. Ayrıca, canlı fareler içinde vivo görüntüleme onların gözlerini açmadan önce uygulanabilir değildir. Bu nedenle, Bu metodoloji yenidoğan aşamada göz gelişimi sırasında uygulanabilir değildir. Öte yandan, izole gözleri görüntüleme çapraz bölümleri fare herhangi bir yaş için kullanılabilir ve düşük bir teknik bariyer varsa, sadece birkaç görünür hyaloid damarların olduğunda nicel değildir, ve ideal bir görüntü elde etme şansı büyük ölçüde bağlıdır açı (Şekil 5). Buna karşılık, düz montaj görselleştirme için hyaloid damarların yalıtım tüm hyaloid damar ve doğru ölçümleme tam görüntüleme sağlar, henüz teknik zorluklar hyaloid damarların hassas ve kırılgan doğası nedeniyle mevcut olabilir. Biz bu yazıda ayrıntılı protokol bu zorlukları aşmak yardımcı umuyoruz.
Hyaloid yalıtım protokolünde çeşitli kritik adımlar jelatin çözeltisi enjeksiyonu, Retina çıkarılması ve son düz montaj içerir. Hiyooid damar elleçleme teknik zorluk hassas doğası, hiyojen damarların bulunduğu vitreus neredeyse sıvı benzeri devlet ve bitişik objektif ve Retina ile yakın bağlantı yatıyor. Enjeksiyonu jelatin çözeltisi intravitreal Hiyoid damarların içeren vitreus vücudun katılaşma için anahtardır ve böylece, daha kolay diseksiyon ve taşıma için doku daha sıkı hale. Jelatin şeffaf elastik termoreversible jelleri oluşturan bir jelleşme ajanı. Jelatin sıvı şeklini (Oda sıcaklığında veya 37 °C ' de) vitreus alana enjekte ederek ve daha düşük bir sıcaklığa (4 °C) soğutarak, vitreus gövdesi daha sıkı bir jel bardağa dönüşür. Göz içine birden fazla jelatin enjeksiyonları gerçekleştirme vitreus uzaya jelatin yeterli miktarda tam dispersiyon sağlar, bir üniforma ve yuvarlak jelatinleştirilmiş hyaloid doku fincan oluşturmak için. Başka bir teknik zorluk hyaloid doku zarar vermeden Retina çıkarılması yatıyor. Ayırt etmek nispeten kolay olan koroid aksine, hyaloid damarlarını içeren jelatinleştirilmiş vitreus vücut hyaloid zarar vermeden yakındaki Retina ayırmak için zordur. Biz vitreus vücut ve Retina arasındaki uzaya enjekte PBS bu iki doku ayırmak için çok daha kolay hale, bir sıvı tampon katmanı oluşturulan bulundu. Bu, kapsül ve katarakt korteks ayırmak için Katarakt Cerrahisi kullanılan hidrodiseksiyon tekniği biraz benzer. Son düz montaj protokolün son teknik olarak zor adımdır. Bir slayt sıcak bir PBS damlacık içinde jelatinleştirilmiş hyalüroid doku ısınma daha kolay düz montaj sağlamak için daha sıvı benzeri bir forma geri dönüştürür. Doğru düzenleme ve hyaloid jel fincan oryantasyonu hala erime ve kurutma sonra bile düzleştirme sağlamak için esastır.
Hyalooid damarların yalıtılması Protokolü çeşitli şekillerde daha da değiştirilebilir. Kullanılan jelatin çözeltisi konsantrasyonu% 5, henüz daha yüksek veya daha düşük konsantrasyonlarda da çalışabilir, araştırma için daha sıkı veya daha yumuşak bir doku elde etmek için araştırmacı tercihine bağlı olarak. Hücresel çekirdeklerin DAPı boyama da ısolectın-ıB4 veya diğer endotel hücre veya makrophage işaretçileri ile değiştirilebilir, daha iyi makrofajlar vasküler endotel hücreleri ayırt etmek. Dikkatli bir kelime: düz monte hyaloid damarların çok hassas ve sadece gevşek slayt yapışmış; Bu nedenle, hyaloid slaytlar boyama sırasında durulama gerekiyorsa çok nazikçe ve dikkatle ele alınması gerekir. Bu yalıtım protokolü de, ince diseksiyon ve kırılgan doku doğası nedeniyle numunelerin uzun vadeli korunması zorluk gerçekleştirme karmaşıklığı da dahil olmak üzere, sınırlamaları vardır. Yine de, izole ve düz montaj hyaloid gemiler hala en kapsamlı ve sezgisel bir şekilde hyaloid damar çalışması için, oküler ve anjiyojenez çalışmaları teşvik etmek için10,17,27, 29,30,31.
Hyaloid damar geliştirme, Oftalmoloji, anjiyojenik ve programlanmış hücre ölümü araştırma alanları için ilgili gelişimsel damar büyümesi ve regresyon eğitim mükemmel bir deneysel model sağlar, hangi ile bu kağıt yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Yalıtım protokolünün gelecekteki modifikasyonları, teknik diseksiyon prosedürün fizibilitesini geliştirmeye yönlendirilebilir. Genel olarak, hiyoid damarların kombine in vivo görüntüleme ve ex vivo yalıtımı, fareler içinde Hiyoid damarların tam olarak değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi için faydalı bir yöntemdir ve vasküler regresyon yararlı bir model olarak kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, National Institutes of Health (NıH) hibe (R01 EY024963 ve EY028100) için JC Z.W. tarafından desteklenen bir Knights Templar göz Vakfı kariyer Starter Grant tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada açıklanan hyaloid yalıtım prosedürü, yazarların minnettar olduğu DRS. Richard Lang, Toshihide Kurihara ve Lois Smith tarafından cömertçe paylaşılan protokollerden değişiklik ile adapte edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
- Fruttiger, M.
- Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
