Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.
Burada biz için ters çevrilebilir ve akort ifade kontrolünü sağlayan uzaktan kumanda sistemi (Reversible Manipulation of Transcription Endogenous loci,), uygulama için bir iletişim kuralı tanımlamak bir yaşam ilgi endojen gen sistemleri model. Uzaktan kumanda sistemi aşağı – ya da upregulation bir hedef genin tek bir biyolojik sistem içinde elde etmek için gelişmiş lac baskı ve tet aktivasyon sistemleri kullanır. Sıkı baskı esnek bulunan sitelerde bağlama önleyici elde edilebilir çok transkripsiyon uzama inhibe bir transkripsiyon başlangıç sitesine aşağı. Sağlam upregulation soydaş organizatörü için tet transkripsiyon aktivatörleri hedefleyerek endojen bir gen transkripsiyonu güçlendirerek elde edilebilir. Bu geri dönüşümlü ve akort ifade denetimi uygulanan ve canlılar arasında art arda çekilmiş. Güç ve çok yönlülük endojen Dnmt1 için burada gösterildiği gibi sistem daha kesin içinde vivo fonksiyonel analiz araştırma çeşitli ifade düzeylerde gen işlevinin etkinleştirilmesi ve reversibility in test sağlayacak bir fenotip.
Genetik nakavt veya transgenik yaklaşımlar hayvan modellerinde gen işlevini öğrenmek için etkili yol olmuştur. Ancak, bu yaklaşımlarla ifade Yönetmeliği (açık/kapalı) ayrılmalar, geçici olmayan ve böylece bir gen tam fonksiyonel yelpazesini belirleme yeteneğine sahip değildir. Koşullu Cre/MoxP teknolojileri spatio-temporal inactivation veya gen fonksiyon aktivasyonu sağladı ama ayrılmalar doğaları hücre ölümcül ve irreversibility1,2 gibi sınırlamalar oluşturmaya devam ediyor , 3. bu boşluğu doldurmak için tetkullanarak koşullu devirme yaklaşımlar geliştirilmiştir-shRNA veya miRNA4düzenlenir. Ancak, hedef kapalı efektleri RNAi5 için bir endişe kalır ve içinde vivo. kontrol etmek zor oldu Daha yakın zamanlarda, CRISPR/CA-aracılı transkripsiyon kontrolü teknolojileri hem yukarı – ve endojen gen ekspresyonu downregülasyon ulaşmak daha çok yönlü bir yaklaşım tanıttı ve kendi araçları6,7 gösterdi . Ancak, transkripsiyon kontrolü CRISPR/CA-aracılı etkinliğini henüz vivo, belirsizdir ve reversibility KRAB tabanlı baskı KRAB görüldü, güçlü baskı gerekmektedir ve onun etkileşen protein KAP1 ikna etmek için gösterilen kalıcı gene8,9susturmak.
Bu sınırlamaları gidermek için bir roman transkripsiyon düzenleyici sistem koşullu olarak bir tersinir endojen gen ifadesinde kontrol yetenekli geliştirdiğimiz ve fare kullanarak ayarlanabilir şekilde prokaryotik ikili transkripsiyon mühendislik düzenleyici sistemleri10. Prokaryotik ikili transkripsiyon düzenleyici sistemleri ile lac ve tet, gibi düzenleyici ligandlar böyle tersinir etkin ve akort ifade kontrol11,12,13, 14. ancak, geçerli ikili sistemler yetersiz baskı potens endojen gen ekspresyonu memelilerde kontrol etmek için onların geniş kabulü engelledi. Biz bir gelişmiş lac baskı sistemi yeterince güçlü endojen genler baskı için geliştirilen ve tet transkripsiyon aktivatörleri ulaşmak için doğrudan soydaş organizatörü endojen bir gen için hedefleme yeni bir strateji istihdam sağlam upregulation (şekil 1)10. Bu teknoloji ile neredeyse iki büyüklük ifade kontrolünü endojen Dnmt1 gene bir akort, indüklenebilir ve geri dönüşümlü bir şekilde10elde ettik. Burada diğer genler ve fare modeli tür olarak kullanarak organizmalar içinde vivo uygulanması için adım adım yönergeler sağlar.
Resim 1 : Uzaktan kumandalı sistem bakış. Bir endojen hedef gen transkripsiyonu mühendislik lac önleyici ve tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak düzenlenmiş olması. Hedef gen Düzenleyici veya intron sıkı bağlama LacIGY önleyici ve/veya rtiçin işleçler içeren şekilde tasarlanmıştır TA-M2 harekete geçirmek. R Repron (Repression intrüzerinde), bir kısmi tavşan beta-globin intron 12 simetrik lac operatörleri (S) içeren gösterir. T tet işleç gösterir. Önleyici ve/veya harekete geçirmek/doku özgü organizatörü ifade edilir. Hedef gen ifadesinin ardından geri dönülebilir olarak istenen ifade seviyeye IPTG (izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY önleyici bir antagonist) veya Doxycycline (Dox) yönetimi tarafından ayarlanan. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu iletişim kuralı başlamadan önce Tablo 1 gen ekspresyonu istediğiniz denetim için ilgili adımları tanımlamak için gözden geçirin. Örneğin, “Gen x” tersine çevrilebilir downregülasyon sağlar bir fare mühendis için bölümler 1, 3 ve 4 / tamamlamak Protokolü aşağıda. Tablo 1 de uzaktan kumanda sisteminin gerekli bileşenleri özetler.
İstenen ifadeyi Değiştir | Sadece baskı | Yalnızca etkinleştirme | Baskı ve harekete geçirmek |
Protokolü’nün ilgili bölümleri | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Hedef geni gerekli uzaktan kumanda sırası | Repron (“Baskı intron”; 12 simetrik lac operatörleri artı bir kısmi tavşan beta-globin intron) | Tet operator(s) | Repron ve Tet operator(s) |
Uzaktan kumandalı sıra konumu | İntron | Organizatörü | İntron & organizatörü |
Harekete geçirmek/önleyici istediğiniz denetim için gerekli | LacIGY önleyici | rtTA-M2 harekete geçirmek | LacIGY önleyici ve rtTA-M2 aktivatör |
Düzenleyici ligandlar | IPTG | Doksisiklin | IPTG ve/veya Doxycycline |
Tablo 1: Uzaktan kumandalı bileşenleri bakış.
Uzaktan kumanda sistemi potansiyel sınırlama ve kritik adım hedef gen ekspresyonu etkilemeden önleyici ve/veya harekete geçirmek bağlayıcı siteleri ekleme ile ilgili sorun var. Özgün Baskı yaklaşımımız, Dnmt1 gen için uygulanan olarak lac önleyici bağlayıcı siteleri bir organizatörü transcriptionally kritik bölgeleri içinde ekleme dahil. Organizatörü işlevi etkileyen ve bu nedenle riskini azaltmak amacıyla uzaktan kumandalı sistem genel uygulanabilirliği geliştirmek, biz bir intron tabanlı baskı yaklaşım geliştirmiştir. Gelişmiş lac sistemimiz potens bizi sıkı bir şekilde yer alan işleçler test ettik güçlü rehberleri transkripsiyon bastırmak izin birkaç kilobases aşağı transkripsiyonu yüzlerce siteleri (şekil 3A-C) başlatmak 10. baskı düzeyleri önemlisi, Organizatör (şekil 3A-C)10transkripsiyon güçlerinden bağımsız olduğunu. Bu baskı kapasitesi bizim intron tabanlı baskı sisteminin test rehberleri transkripsiyon gücünü aştığını göstermektedir. İntron tabanlı bu yaklaşım, baskı yoluyla iki bileşeni, transkripsiyon uzama makine ve lac repressors57arasında fiziksel girişime aracılık ettiği olasıdır. Bu basit baskı mekanizması ve intron tabanlı yöntemi gösterdiği sağlamlık bu yaklaşım genellikle farklı genler, doku ve organizmalar için geçerli hale gelebilir.
Upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından organizatörü işlevi etkileyen riski üzerine kuruludur hedef gen düzenleyici bir mesafede olmak transactivator Bağlayıcı sıraları gerektirir. Ancak, dizileri bağlama pozisyon dışında transcriptionally kritik bölgesi olabilir bulundu. Hem Dnmt1 hem de EF1α rehberleri sağlam upregulated tet operatörleri transkripsiyon başlangıç siteleri10yüz üsleri akıntıya karşı birkaç yer vardı. Bu rahat sınırlama organizatörü işlevi bir hedef gen transactivator yokluğunda etkileyen şansını büyük ölçüde azaltır. Bağlama artırıldığında dizileri ve/veya daha güçlü transactivators kullanımı daha da azaltmak belgili tanımlık tehlike yanında olanaklı kılmak uzak uzak transkripsiyon başlangıç sitesinden sitelerden upregulation yardımcı olabilir.
Bizim uzaktan kumandalı sistem düzeyinde, zamanlama ve endojen gen ifadesinin bir fenotip reversibility ve tarafından kolayca ulaşılabilir değildir farklı ifade düzeyleri sonuçlarını test etmek için izin vererek, konumunu zarif kontrol sağlar vivo gen ifade-kontrol teknolojilerinde geçerli. Bizimki de dahil olmak üzere çoğu gen ifade analizleri içinde bir nüfus arasında önemli farklılıklar bulunan hücrelerin ortalamasını ifade değerleri temsil unutmamak gerekir. Bu heterojenlik farklılaşma veya apoptosis58gibi hücresel karar alma süreçlerine etkileyebilir. Gen ifadesi denetim duyarlığını ek genetik devre mühendislik59tarafından büyük olasılıkla daha fazla geliştirilebilir rağmen mevcut sistem gözlenen potens birçok biyolojik bağlamlarda yararlı gen fonksiyon incelenmesi izin verir. Buna ek olarak, hedef özgüllüğü yüksek derecede operatör dizileri yanı sıra büyük bir evrimsel mesafe memeliler ve düzenleyici bileşenleri60kaynak türleri arasında karmaşıklığı nedeniyle bekleniyor. Ayrıca, repressors ve harekete geçirmek transgenik fare satırları geliştirilen ve endojen herhangi bir gen için istihdam. Örneğin, varolan tet transactivator fare modelleri upregulation hedef gen istenen fare dokularda gerçekleştirmek için adapte edilebilir. Biz son zamanlarda bizim gelişmiş lac önleyici sağlam doku özgü ifade lacIGY gen48 Hipp11 odağı getirerek mevcut Cre satırları ile birlikte birden fazla doku türlerinde sürebilirim transgenik bir çizgi geliştirilen (yayınlanmamış) bir somon balığı-STOP-Lox öğesinin kontrol altında. Bu satırı önemli ölçüde uzaktan kumandalı sistem doku özgü uygulanmasının kolaylaştırılması.
Gene upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından geçerli indüklenebilir transgenik yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında birçok avantaj sağlar. Endojen locus kullanır gibi ekleme konumu etkili için sınama için birden çok satıra transgenik nesil gerektirmez. O zaten güçlü bir organizatörü ifadeden artırır çünkü geleneksel transgenik modelleri üzerinde en az viral rehberleri itimat ise buna ek olarak, bu yaklaşım gen güçlü temel ifade ile upregulation için çok uygundur. Son olarak, doku özgüllük, hücre döngüsü kontrol ve bir hedef gen türevleri Uçbirleştirme muhafaza upregulation yaklaşımımız tarafından doğuştan gelen BDTgibi doğal düzenleme unsurları korur gibi-düzenleyici elemanlarının. CRISPR/CA-aracılı gen hedefleme teknolojisi gelişine bu teknoloji farklı modeli sistemlerinde büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
Biz geç Dr Heidi Scrable memeli lacI gen yapısı (Mayo Clinic, Rochester, MN), onun cömert bir hediye için teşekkür Dr Daniel Villin organizatörü sağlamak için Louvard (Institut Curie, Paris, Fransa) ve Dr Laurie Jackson-Grusby (Çocuk Hastanesi, Boston, MA) bu teknoloji gelişme erken aşamalarında onun katkıları için. Dr Nancy Wu ve Dr Robert Maxson transgenik ve nakavt fareler üreten onların yardım için sana şükrediyoruz. Biz yararlı tartışmalar için Laird laboratuvar üye teşekkür ve destek. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 ve R01 CA212374 için P.W.L. ve 1F31CA213897-01A1 N.A.V.S için] tarafından desteklenmiştir.
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |