Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes
Summary
La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.
Abstract
L’utilisation de cellules dérivées d’hiPSC représente une approche utile pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la différenciation des hiPSCs provenant d’un patient présentant la triplication du locus du gène (SNCA) d’alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson (MP)-les populations neuronales dopaminergiques pertinentes. Accumuler des preuves a montré que des niveaux élevés de SNCA sont responsables pour le développement de PD. reconnaissant la non satisfaits ont besoin d’établir de nouvelles approches thérapeutiques pour PD, en particulier celles qui visent la régulation de l’expression SNCA , nous récemment mis au point un système CRISPR/dCas9-méthylation-basées sur l’ADN pour moduler épigénétiquement SNCA transcription en enrichissant les niveaux méthylation de la région régulatrice de SNCA intron 1. Pour fournir le système, composé d’un mort (désactivée) version de Cas9 (dCas9) a fusionné avec le domaine catalytique de l’ADN méthyltransférase enzyme 3 a (DNMT3A), un vecteur lentiviral est utilisé. Ce système est appliqué aux cellules avec la triplication du locus SNCA et réduit le SNCA-ARNm et protéines d’environ 30 % par le biais de la méthylation de l’ADN ciblée de SNCA intron 1. La diminution de l’expression affinée des niveaux SNCA sauve des phénotypes cellulaires liés à la maladie. Dans le protocole actuel, notre objectif est de décrire une procédure étape par étape afin de différencier les hiPSCs dans les cellules progénitrices neurales (PNJ) et l’établissement et la validation des tests pyrosequencing pour évaluer le profil de méthylation dans le SNCA intron 1. Pour connaître plus en détail le système de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilisé dans ces expériences, ce protocole décrit comment produire, purifier et concentrer les vecteurs lentiviraux et de mettre en évidence leurs qualités pour les applications d’édition épigénome et génome utilisant hiPSCs et PNJ. Le protocole est facilement adaptable et peut être utilisé pour produire des lentivirus titre élevé pour les applications in vitro et in vivo.
Introduction
Plusieurs plates-formes d’édition épigénome ont été récemment mis au point pour cibler toutes les séquences d’ADN dans les régions qui contrôlent l’expression de gène1,2. Les outils de retouche épigénome créés sont conçus pour (i) règlent la transcription, (ii) modifier les modifications post-traductionnelles histone, (iii) modifier la méthylation de l’ADN et (iv) modulent les interactions élément régulateur. L’approche d’ancrer les modificateurs de transcription/chromatine à un Cas9 (morts) désactivé (dCas9) proviendraient précédemment développés plates-formes édition épigénome comme zinc finger protéines (ZFP) et transcription activator comme effecteurs (contes), héberger un domaine effecteur transcriptionnelle puissant (ED) fondue vers le domaine de liaison à l’ADN conçu (DBD)3. Les résultats du phénotype désiré tels que l’activation ou la répression est défini par la molécule effectrice ancrée aux loci endogène (Figure 1). Pour créer des activateurs transcriptional programmables, dCas9/gRNA modules sont liés à VP164,5,6 (Figure 1 a), un domaine d’activation virale qui recrute Pol II et la machinerie de transcription généraux. La modification de ce système a inclus VP64, un tétramère de domaines VP16, fournissant une encore plus robustes activation tarifaire5,6. Le système a été avec succès employé pour activer des régions codantes et non codantes en ciblant des promoteurs et des éléments de régulation. Ce qui est important, même si les molécules de VP64 ne modifient pas directement la structure de la chromatine dans la région de la cible, il recrute les modificateurs de la chromatine qui lie les résultats dans les dépôts des marques actives (euchromatine), y compris comme l’acétylation H3/H4 et H3-K4 di / tri-méthylation5,6. En plus de la VP64, la sous-unité p65 de NF-κB humain complexe a été attachée à la dCas9/gRNA module7. Fait intéressant, l’attachement de ces effecteurs dans les régions en amont des sites de début de transcription (TSSs) et au sein des promoteurs se traduit par une induction forte gène. Néanmoins, VP64 et p65 Effecteurs peuvent aussi exercer les effets activatrices tout en étant liés aux régions situées en aval du TSSs et exhausteurs distale7,8. Pour obtenir une réponse transcriptionnelle plus robuste, multiples fusions dCas9-VP64 ou dCas9-p65 doivent être recrutés à une cible unique locus9,10. Par conséquent, le développement récent des activateurs de nouvelle génération, qui recrutent plusieurs domaines effecteurs par un complexe unique dCas9-gRNA, tels que SunTag, a donné lieu à une plus forte capacité activation comparant à dCas9-VP64 fusion homologues11 , 12. une meilleure activation de la transcription a été obtenue par la fusion de VP64, p65 et Rta (VPR), un domaine de transactivation de gamma-virus de l’herpès, à l’extrémité C-terminale de la dCas913 (Figure 1 a). Des systèmes similaires de CRISPR/dCas9 ont été développés pour répression spécifique à la cible (Figure 1 b).
Répression génique endogène peut être réalisée avec les fusions de répresseur machiné par le biais de divers mécanismes (Figure 1 b). Il a été démontré que les systèmes CRISPR/dCas9, liés à la répresseur DBD (même sans un domaine effecteur/s), peuvent taire efficacement l’expression des gènes tandis qu’attachés à un promoteur ou en amont/en aval-TSS régions3,6 ,14. Les effets sur la transcription est causé par l’interférence stérique de la liaison de facteur de transcription et de la transformation de l’ARN polymérase. Néanmoins, des approches plus globales sont nécessaires, car la répression génique par stérique seul n’est souvent pas suffisante pour silencieux d’échappement robuste. Le développement récent de la prochaine génération de silencieux basées sur des systèmes CRISPR/dCas9 transportant des domaines répresseur transcriptionnel (DRT), modificateurs d’histone (H3-K9 di-/ tri-méthylation, H3-K27 di-/ tri-méthylation ; H3-K36 di-/ tri-méthylation, H3/H4 désacétylation) et la méthylation de l’ADN (CpG) a conduit à la construction d’outils épigénétiques permettant plus robustes pour faire taire les effets4,5,15,16, 17,18,19,20. Il a été démontré que le recrutement de ces modificateurs épigénétiques de l’ADN peut conduire à la formation de plus la chromatine condensée et fermée, qui génèrent habituellement un plus puissant silencieux issue21,22. Le plus souvent silencieux domaine utilisé avec DBDs est la boîte Krüppel-associés (KRAB)4,5. Le recrutement du facteur a été démontré pour correspondre avec les modifications de la chromatine ; Néanmoins, les mécanismes de ces modifications doivent encore être élucidé16,17,18. Récemment, il a été démontré que la localisation de KRAB à l’ADN peut promouvoir l’Assemblée de l’histone-méthyltransférase SETDB1 et les complexes de NuRD histone désacétylation (HDAC), ce qui suggère la possibilité que ces interactions médient la formation de condensation de la chromatine et transcriptionnelle silencieux3,13. Comme approche alternative, domaines Effecteurs peuvent être fusionnés à DBDs à créer une protéine silencieux épigénétique personnalisée. Ce système directement catalyse répressif ADN marques ou modifications d’histone.
Récemment, l’utilisation de systèmes CRISPR/dCas9 synthétiques attaché à l’enzyme DNMT3A a été réaffectée transcriptionnelle de désactivation. DNMT3A catalyse la méthylation de l’ADN qui exerce une répression transcriptionnelle tout au long de la formation de l’hétérochromatine sur les promoteurs de gènes endogènes et autres régions régulatrices (Figure 1 b)18,20. McDonald et al.,18 et20 de la Vojta et coll. ont été les premiers auteurs de déclarer que la méthylation de l’ADN peut être utilisée pour épigénome-gene silencing ou de répression, ce qui démontre que le système de fusion de plasmide-prononcé dCas9-DNMT3A peut renforcer puissamment méthylation de la cytosine autour les TSS18,20. McDonald et ses collaborateurs ont démontré que l’emploi de la stratégie peut-être aboutir à une réduction significative (environ 40 %) un gène suppresseur de la tumeur, CDKN2A ARNm du niveau18. De même, ciblant la région non méthylé promoteur des gènes BACH ou IL6ST montre méthylation accrue de CpG qui a été corrélée avec une diminution de double dans l’ expression de gène20. Notre laboratoire a récemment réaffecté l’utilisation de méthylation de l’ADN pour atténuer les résultats pathologiques du SNCA surexpression (Figure 2)23. La stratégie repose sur l’amélioration sélective dans la méthylation de l’ADN dans la région d’intron 1 SNCA , comme il a été signalé auparavant comme hypométhylés en PD et démence avec Lewy organes (DLB) cerveaux24,25, 26. Cette hypométhylation a été liée à la surexpression SNCA , offrant ainsi une cible attractive pour une intervention thérapeutique24,27,28. Nous avons récemment montré un faible niveau de méthylation de l’ADN dans l’intron SNCA 1 région hiPSC dérivés dopaminergiques PNJs obtenus chez un patient de PD avec le SNCA triplication23. L’avantage de ce modèle expérimental est que les PNJ peuvent être robuste propagées en culture ou encore se différencient en neurones matures, ce qui permet un dépistage efficace identifier les facteurs génétiques qui véhiculent des phénotypes cellulaires, y compris oxydant stress et apoptose29. En outre, ce système modèle permet aux scientifiques de récapituler les événements du développement qui a eu lieu avant l’apparition des symptômes chez les patients. En outre, les dérivés hiPSC PNJ représente un excellent outil pour tester les voies moléculaires et cellulaires associées à l’expression des gènes. Ce qui est important, dérivés hiPSC PNJ combinée à la technologie CRISPR/Cas9-épigénome state-of-the-art peut faciliter considérablement le développement de « médicaments de nouvelle génération » pour beaucoup de maladies neurodégénératives.
Pour réduire les niveaux pathologiques d’expression SNCA, nous avons récemment mis au point un système de lentivirus portant une protéine de fusion dCas9-DNMT3A et gRNA à spécifiquement la méthylation CpG cible au sein de l’intron SNCA 1 (Figure 2 a)23. Ce protocole décrit vecteur lentiviral (LV) conception et réalisation en détail. LVs représentent un moyen efficace de prestation des modules CRISPR/dCas9 pour plusieurs raisons, à savoir (i) leur capacité à effectuer de volumineux ADN insère, (ii) un rendement élevé de transduction d’un large éventail de cellules, y compris les cellules ne se divisant pas tant démarcation30 et (iii) leur capacité à induire des réponses cytotoxiques et immunogènes minimales. Récemment, nous avons appliqué le système de LV de neurones dopaminergiques hiPSC dérivé d’un patient ayant la triplication du locus SNCA et démontré le potentiel thérapeutique de LVs pour la livraison de l’épigénome-édition méthylation outils23 ( Figure 2 b). En effet, un système de LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoque une augmentation significative dans la méthylation de l’ADN à la région d’intron 1 SNCA . Cette augmentation correspond à la réduction des niveaux d’ARNm et protéines SNCA 23. En outre, SNCA downregulation sauve des phénotypes liés PD dans les SNCA triplication/hiPSC-dérivés dopaminergiques neurones (c’est-à-dire mitochondrial ROS production et cellulaires la viabilité)23. Ce qui est important, nous avons démontré que la réduction SNCA expression par le système de LV-gRNA-dCas9-DMNT3A est capable d’inverser les phénotypes qui sont caractéristiques des neurones dopaminergiques dérivés hiPSC provenant d’un patient de PD qui portaient la SNCA triples emplois, tels que mitochondries ROS production et cellule viabilité23. Le but du présent protocole est 1) pour décrire le protocole de production et de la concentration d’une plate-forme de LV optimisée pour générer des préparations virales haute-titrés et 2) pour décrire la différenciation des hiPSCs en PNJ modelé pour devenir mature dopaminergique neurones31,32 et la caractérisation des niveaux méthylation de la région ciblée au sein de l’intron SNCA 1.
Plates-formes des gènes ont un avantage majeur sur la plus populaire plateforme de vecteur, à savoir virus adeno-associé vecteurs (AAVs), qui est la capacité de ce dernier pour accueillir les plus grands inserts génétique33,34. AAVs peuvent être générés à des rendements significativement plus élevés mais possèdent une capacité d’empaquetage faible (< 4,8 kb), compromettre leur utilisation pour fournir des systèmes CRISPR/Cas9 all-in-one. Il semble donc que la VL serait la plateforme de choix dans les applications impliquées dans la fourniture d’outils CRISPR/dCas9. Par conséquent, le protocole décrit ici sera un outil précieux pour les chercheurs souhaitant dispenser efficacement l’épigénome-montage de composants aux organes et cellules. De plus, le protocole décrit la stratégie visant à accroître les capacités de production et d’expression des vecteurs via une modification en cis des éléments dans le vecteur expression cassette30,35. La stratégie est basée sur le roman système mis au point dans notre laboratoire et études met en évidence sa capacité à produire des particules virales dans la gamme de 1010 unités virale (VU) / ml30,,35.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs ont commencé à émerger en tant que véhicule de choix pour l’épigénome édition, surtout dans le contexte des maladies génétiques, principalement en raison de leur capacité à (i) accueillir grandes charges utiles de l’ADN et (ii) transduce efficacement un large éventail de diviser et les cellules ne se divisant pas. L’efficacité de grand emballage de la VL est particulièrement utile pour les applications impliquant des emballages des systèmes CRISPR/dCas9 qui sont surdimensionnés. Dans cette persp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par le prix de développement de neurotechnologie Kahn (au décret) et la National instituts de santé/National Institute of Neurological Disorders et Stroke (NINDS/NIH) (R01 NS085011 à O.C.).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
References
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