JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

Lentiviral Vector plattform for effektiv levering av Epigenome-redigeringsverktøy i Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet sykdom modeller

Published: March 29, 2019
doi:
10.3791/59241
, , , , , , , ,
1Department of Neurology,Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology,Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core,Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology,Duke University Medical Center

Summary

Målrettet DNA epigenome redigering representerer en effektiv terapeutisk tilnærming. Denne protokollen beskriver produksjon, rensing og konsentrasjonen av alt-i-ett lentiviral vektorer skjuler CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgene for epigenome-redigering programmer i menneskelig indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons.

Abstract

Bruk av hiPSC-avledet celler representerer en verdifull tilnærming å studere human nevrodegenerative sykdommer. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for differensiering av hiPSCs avledet fra en pasient med triplication av alpha-synuclein genet (SNCA) locus i Parkinsons sykdom (PD)-relevante dopaminergic neuronal populasjoner. Samler bevis har vist at høye nivåer av SNCA er forårsaker for utvikling av PD. gjenkjenne den udekket må etablere nye behandlingsmetoder for PD, særlig de målretting regulering av SNCA uttrykk, vi nylig utviklet en CRISPR/dCas9-DNA-metylering-basert system for å epigenetically modulerer SNCA transkripsjon av berikende metylering nivåene på SNCA intron 1 regulatoriske regionen. Å levere systemet, som består av en død (deaktivert) versjon av Cas9 (dCas9) smeltet sammen med katalytisk domenet til DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), en lentiviral vektor brukes. Dette systemet er brukt på celler med triplication av SNCA locus og reduserer SNCA-mRNA og protein nivå ved ca 30% gjennom de målrettede DNA-metylering av SNCA intron 1. Den finjusterte downregulation av SNCA redder sykdom-relaterte mobilnettet fenotyper. I gjeldende protokollen, vi tar sikte på å beskrive en fremgangsmåte for å skille hiPSCs i nevrale stamceller (NPC) og etablering og validering av pyrosequencing analyser for evaluering av metylering profilen i SNCA intron 1. Hvis du vil disponere nærmere lentivirus-CRISPR/dCas9 systemet brukes i disse eksperimentene, beskriver denne protokollen hvordan å produsere, rense og konsentrere lentiviral vektorer og markere deres egnethet for epigenome – og genomet-redigering programmer som bruker hiPSCs og NPCer. Protokollen er lett tilpasses og kan brukes til å produsere høy titer lentiviruses for i vitro og in vivo programmer.

Introduction

Flere epigenome-redigering plattformer er nylig utviklet for å målrette noen DNA-sekvenser i regioner som kontrollerer gene expression1,2. De opprettede epigenome-redigeringsverktøy er utformet for å (i) regulere transkripsjon, (ii) endre posttranslational histone modifikasjoner, (iii) endre DNA metylering og (iv) modulerer regulatorisk element interaksjoner. Tilnærming til anker transkripsjon/chromatin modifiseringen til en deaktivert (død) Cas9 (dCas9) hevet fra tidligere utviklet epigenome-redigering plattformer, for eksempel sink finger proteiner (ZFPs) og transkripsjon aktivator som effektor (eventyr), skjuler et potent transcriptional effektor domene smeltet (ED) designet DNA-bindende domenet (DBD)3. Resultatene av ønsket fenotypen som aktivisering eller undertrykkelse er definert av effektor molekylet forankret til de endogene loci (figur 1). Hvis du vil opprette programmerbare transcriptional aktivator, er dCas9/gRNA moduler knyttet til VP164,5,6 (figur 1A), en viral aktivisering domene som rekrutterer Pol II og generell transkripsjon maskiner. Endring av dette systemet har inkludert VP64, en tetramer av VP16 domener, gir en enda mer robust aktivisering rate5,6. Systemet har vært vellykket ansatt å aktivere koding og noncoding av målretting arrangører og regulatoriske elementer. Viktigere, selv om VP64 molekyler ikke direkte endre chromatin strukturen i regionen mål, det rekrutter chromatin modifikatorer som binder resultater i deponering av aktiv (euchromatin) merker, inkludert som H3/H4 acetylation og H3-K4 di / Tri-metylering5,6. I tillegg til VP64, har p65 delenhet i menneskelig NF-κB komplekset blitt bundet til dCas9/gRNA modul7. Interessant, deling av disse effektor til regionene oppstrøms transkripsjon start områder (TSSs) og arrangører resulterer i en sterk genet induksjon. Likevel, VP64 og p65 effektor kan også utøve activatory effekten mens knyttet til regionene ligger nedstrøms TSSs og distale enhancers7,8. For å lokke fram en mer robust transcriptional reaksjon, trenger flere dCas9-VP64 eller dCas9-p65 fusjoner å bli rekruttert til en enkelt mål locus9,10. Som sådan, har den siste utviklingen av neste generasjons aktivator, som rekrutterer effektor domenene av en enkelt dCas9-gRNA-komplekset, som SunTag, resultert i en sterkere aktivisering funksjonen sammenligne dCas9-VP64 fusion kolleger11 , 12. en forbedret transcriptional aktivisering er innhentet gjennom fusjon av VP64, p65 og Rta (VPR), et transactivation-domene fra gamma-herpesviruses, til C-terminus dCas913 (figur 1A). Lignende CRISPR/dCas9-systemer har blitt utviklet for mål-spesifikke undertrykkelse (figur 1B).

Endogene genet undertrykkelse kan oppnås med utviklet repressor fusjoner gjennom en rekke mekanismer (figur 1B). Det har vist at CRISPR/dCas9 systemer, knyttet til repressor DBD (selv uten en effektor domene/s), kan effektivt slå genuttrykk mens bundet til en formidler eller oppstrøms/nedstrøms-TSS regioner3,6 ,14. Virkningene på transkripsjon er forårsaket av steric forstyrrelser av transkripsjon faktor bindende og RNA polymerase behandling. Likevel er mer omfattende tilnærminger nødvendig, som gene undertrykkelse av steric hindring alene er ofte ikke tilstrekkelig for robust stanse. Den siste utviklingen av den neste generasjonen av lyddempere basert på CRISPR/dCas9 systemer bærer transcriptional repressor domener (TRDs), histone modifikatorer (H3-K9 di-/ tri-metylering, H3-K27 di-/ tri-metylering; H3-K36 di-/ tri-metylering, H3/H4 deacetylation), og DNA (CpG) metylering førte til byggingen epigenetic verktøyer som mer robust stanse effekter4,5,15,16, 17,18,19,20. Det har blitt demonstrert at rekruttering av disse epigenetic modifikatorer til DNA kan føre til dannelse av mer lukket og kondensert chromatin, som vanligvis genererer en mer potent stanse utfallet21,22. Oftest stanse domenet brukes med DBDs er Krüppel-assosiert boks (KRAB)4,5. Rekruttering av faktor har vist tilsvarer chromatin endringer; Likevel er mekanismer for disse endringene ennå å bli belyst16,17,18. Nylig har det vært vist at lokaliseringen av KRAB DNA kan fremme montering av histone methyltransferase SETDB1 og histone deacetylation (HDAC) NuRD komplekser, antyder muligheten for at disse interaksjoner megle dannelsen av chromatin kondens og transcriptional stanse3,13. Som en alternativ tilnærming, kan effektor domener være smeltet å DBDs å opprette en egendefinert epigenetic stanse protein. Dette systemet gir direkte undertrykkende DNA merker eller histone modifikasjoner.

Bruk av syntetiske CRISPR/dCas9 systemer bundet til DNMT3A enzymet har nylig blitt repurposed for transcriptional deaktivering. DNMT3A gir DNA metylering som utøver transcriptional undertrykkelse gjennom dannelsen av heterochromatin på endogene genet arrangører og andre juridiske områder (figur 1B)18,20. McDonald et al.18 og Vojta et al.20 var første forfatterne rapporterer at DNA metylering kan brukes for epigenome-genet stanse eller undertrykkelse, demonstrere at plasmider levert dCas9-DNMT3A fusion systemet kan potently forbedre cytosine metylering rundt TSS18,20. McDonald og kolleger vist at bruken av strategien kan medføre en betydelig reduksjon (ca 40%) i en tumor suppressor genet nivåer CDKN2A mRNA18. Tilsvarende viser målretting regionen unmethylated promoter av BACH eller IL6ST genene økt CpG metylering som er forbundet med en todelt reduksjon i gene expression20. Våre lab har nylig tatt i bruk bruk av DNA metylering for demping patologisk utfallet av SNCA overuttrykte (figur 2)23. Strategien er basert på selektiv ekstrautstyr i DNA metylering i regionen SNCA intron 1 som det tidligere rapportert å være hypomethylated i PD og demens med Lewy organer (DLB) hjerner24,25, 26. Denne hypomethylation har vært knyttet til SNCA overuttrykte, dermed tilby en attraktiv mål for terapeutisk intervensjon24,27,28. Vi har nylig viste et lavt nivå av DNA metylering i SNCA intron 1 regionen i hiPSC-avledet dopaminergic NPCer innhentet fra en PD-pasient med SNCA triplication23. Fordelen med denne eksperimentelle modellen er at NPCer kan være robust overført i kultur eller videre differensiert i modne nerveceller, muliggjør en effektiv screening å identifisere genetiske faktorer som megle mobilnettet fenotyper, inkludert oksidativt stress og apoptose29. Videre, denne modellen gjør forskere til recapitulate utviklingsmessige hendelsene som oppstod før symptomdebut hos pasienter. I tillegg representerer hiPSC-avledet NPCer en stor verktøyet å teste cellulære og molekylære veier tilknyttet genuttrykk. Viktigere, kan hiPSC-avledet NPCer kombinert med state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome teknologi forenkle utvikling av “neste generasjon narkotika” for mange nevrodegenerative sykdommer.

For å redusere patologisk nivåer av SNCA uttrykk, vi nylig utviklet et lentivirus-basert system med en dCas9-DNMT3A fusion protein og gRNA til spesifikt mål CpG metylering i SNCA intron 1 (figur 2A)23. Denne protokollen vil beskrive lentiviral vektor (LV) design og produksjon i detalj. LVs representerer et effektivt middel for å levere CRISPR/dCas9 komponenter av flere grunner, nemlig (i) deres evne til å bære store DNA setter, (ii) en høy effektivitet av transducing et bredt spekter av cellene, inkludert både dele og nondividing celler30 , og (iii) evnen til å indusere minimal cytotoksiske og immunogenic svar. Nylig vi brukt LV systemet på hiPSC-avledet dopaminergic neurons fra en pasient med triplication av SNCA locus og bevist terapeutisk potensialet i LVs for levering av epigenome-redigering metylering verktøy23 ( Finne 2B). Faktisk forårsaker en LV-gRNA/dCas9-DNMT3A systemet en betydelig økning i DNA metylering i regionen SNCA intron 1. Denne økningen tilsvarer reduksjon i nivåene av SNCA mRNA og protein23. Videre redder SNCA downregulation PD-relaterte fenotyper i SNCA triplication/hiPSC-avledet dopaminergic neurons (f.eks mitokondrie ROS produksjon og celle levedyktighet)23. Viktigere, viste vi at reduksjonen i SNCA uttrykk av LV-gRNA-dCas9-DMNT3A systemet er i stand til å reversere av fenotyper som er karakteristisk for hiPSC-avledet dopaminergic neurons fra en PD pasient som bar i SNCA triplication, som mitokondrie ROS produksjon og celle levedyktighet23. Målet med denne protokollen er 1) å skissere protokollen for produksjon og konsentrasjonen av en optimalisert LV plattform for å generere høy-tittered viral forberedelser og 2) for å beskrive differensiering av hiPSCs i NPCer mønster for å bli moden dopaminergic neurons31,32 og karakterisering av metylering målrettingsområde innen SNCA intron 1.

Lentiviral plattformer har en stor fordel over de mest populære vektor plattform, nemlig adeno-assosiert vektorer (AAVs), som har evnen til å imøtekomme større genetisk innsettinger33,34. AAVs kan genereres ved betydelig høyere avkastning, men har en lav emballasje kapasitet (< 4.8 kb), at deres bruk for å levere alt-i-ett CRISPR/Cas9 systemer. Dermed virker det som LVs ville være det plattform av valget i programmer som er involvert i gjennomføringen av CRISPR/dCas9 verktøy. Protokollen skissert her vil derfor være et verdifullt verktøy for forskere ønsker å effektivt levere epigenome-redigering komponenter til cellene og organene. Protokollen ytterligere skisserer strategi for å øke produksjonen og uttrykk evnene av vektorer via en endring i cis elementer innen vektor uttrykk kassett30,35. Strategien er basert på romanen system utviklet og studerte i vår lab og fremhever dens evne å tilvirke virus partikler i området 1010 viral enheter (VU) /mL30,35.

Protocol

1. system Design- og Virus Plasmider design og konstruksjonMerk: Byggingen av en alt-i-ett LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektor utføres ved hjelp av en produksjon- og uttrykk-optimalisert uttrykk kassett publisert av Ortinski et al.30. Vector kassetten bærer en gjentakelse av webområdet anerkjennelse av transkripsjon faktor Sp1 og en state-of-the-art sletting i den uoversatt (U3 “) en terminal 3-lang gjenta (VTH) (figur 2A)<su…

Representative Results

Validering av produksjon titers av LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektorer sammenlignet naive GFP motpart Vi utførte p24kneble ELISA sammenligne mellom fysiske titers i LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro med de naive GFP/Puro kolleger. Representant resultater, presentert i figur 5A, viser at fysisk avkastning av vektorer, generert ved hjelp av protokollen her skissert, er sammenlignbare…

Discussion

LVs har begynt å dukke opp som bilen av valget for epigenome redigering, spesielt i sammenheng med genetiske sykdommer, hovedsakelig på grunn av deres evne til å (i) tilpasse store DNA nyttelast og (ii) effektivt transduce en rekke dele og nondividing celler. Store emballasje effekten av LVs er spesielt gunstig for programmene som involverer emballasje av CRISPR/dCas9 som er for store. Fra dette perspektivet representerer LVs det plattform av valget for levering av alt-i-ett CRISPR/Cas9 systemer. Faktisk er AAV plattf…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert delvis av Kahn Neurotechnology Development Award (å OC) og nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) (R01 NS085011 å OC).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 – BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson’s disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson’s disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson’s disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3′ untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson’s disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Tags

Lentiviral VectorEpigenome EditingHuman Induced Pluripotent Stem CellsDisease ModelsCRISPR/CasAlpha-synucleinGene ExpressionGuide RNAMolecular CloningPlasmid ConstructionNeural Progenitor CellsDNA Methyltransferase (DNMT3A)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image