Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Abstract

De neurovasculaire eenheid (NVU) is samengesteld uit microvasculaire endotheliale cellen vormen de bloed - hersenbarrière (BBB), een endothelial kelder membraan met ingesloten pericytes, en de glia limitans samengesteld door de parenchymal kelder-membraan en astrocytic einde-feed omarmen het abluminal aspect van het centrale zenuwstelsel (CNS) microvessels. Naast het behoud van de CNS bepaalt homeostase de NVU immuun cel smokkel naar het centraal zenuwstelsel. Tijdens de immunosurveillance van het centraal zenuwstelsel kunnen lage aantallen van geactiveerde lymfocyten het endotheel barrière oversteken zonder BBB dysfunctie of klinische ziekte te veroorzaken. In tegenstelling, tijdens neuroinflammation zoals in multiple sclerose of haar diermodel kan experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) een groot aantal immuuncellen kruisen de BBB en vervolgens de glia limitans uiteindelijk bereiken de CNS parenchym leidt tot klinische ziekte. Immuun cel migratie naar de CNS parenchym is dus een proces van twee stappen waarbij een sequentiële migratie over het endotheel en gliale barrière voor de NVU met verschillende moleculaire mechanismen. Als na hun passage over het endotheel barrière, T-cellen tegenkomen hun cognaat antigeen op gerelateerde antigeen-presenteren cellen hun lokale reactivering zal starten volgende mechanismen die leiden tot de focal activering van gelatinases, die de T-cellen te steken de gliale barrière en voer de CNS parenchym kunnen. Dus, beoordeling van zowel, BBB permeabiliteit en MMP activiteit in ruimtelijke correlatie met immuun cel accumulatie in het VNV tijdens EAE om aan te geven van verlies van de integriteit van het endotheel en gliale belemmeringen voor de NVU. Hier laten we zien hoe ertoe EAE in C57BL/6 muizen door actieve immunisering en hoe vervolgens analyseren BBB permeabiliteit in vivo met behulp van een combinatie van exogene fluorescerende verklikstoffen. We tonen verder, hoe om te visualiseren en lokaliseren van gelatinase activiteit in EAE hersenen door in situ zymogaphy gekoppeld aan immunefluorescentie technieken van BBB kelder membranen en CD45 + binnenvallende immuuncellen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het centrale zenuwstelsel (CNS) coördineert alle lichaam en mentale functies in gewervelde dieren, en CNS homeostase is essentieel voor een goede communicatie van neuronen. CNS homeostase is gerechtvaardigd door de neurovasculaire eenheid (NVU), die de CNS tegen de veranderende omgeving van de bloedstroom beschermt. De NVU is samengesteld uit CNS microvasculaire endotheliale cellen die biochemically uniek zijn en stellen de bloed - hersenbarrière (BBB) in continu Overspraak met pericytes, astrocyten, neuronen en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), tot oprichting van twee aparte kelder membranen1. Het endotheel kelder membraan dat ensheathes het abluminal aspect van de endotheliale cellen van BBB herbergt een groot aantal pericytes en bestaat uit laminin α4 en laminin α5, naast andere ECM eiwitten2. In tegenstelling, het parenchymal membraan van de kelder bestaat laminin alpha1 of alpha2 laminin en wordt omarmd door astrocytic einde-voeten. Het parenchymal membraan van de kelder samen met de Astrocyt einde-voeten componeert de glia-limitans dat het CNS neuronale netwerk van de cerebrospinale vloeistof gevuld gerelateerde of de subarachnoïdale ruimtes3beveiligingsmethode. Vanwege de unieke architectuur van de NVU verschilt immuun cel smokkel naar de CNS van dat in de perifere weefsels als het vereist een proces van twee stappen met de immune cellen, eerst overtredingen van het endotheel BBB en vervolgens de glia limitans ter de CNS parenchym bereiken.

Multiple sclerose (MS) is een gemeenschappelijk neuroinflammatoire ziekte van het centraal zenuwstelsel, waarin een groot aantal immuuncellen circulerende Voer de CNS en veroorzaken neuroinflammation, demyelinisatie en focale verlies van BBB integriteit4. Verlies van BBB integriteit is een vroeg kenmerk van MS, zoals aangegeven door de aanwezigheid van gadolinium-contrast verbetering van de laesies in het VNV als gevisualiseerde door magnetische resonantie beeldvorming (MRI)5. Extravasation van de leukocyten in het centraal zenuwstelsel plaatsvindt op het niveau van de postcapillary venules; de precieze mechanismen die betrokken zijn bij immuun cel diapedesis in het membraan van de kelder BBB en vervolgens de gliale barrière moeten echter nog worden onderzocht. Experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) fungeert als een dierlijk model voor MS en heeft aanzienlijk bijgedragen aan onze huidige kennis over MS pathogenese. Bijvoorbeeld heeft met behulp van de EAE-model men ontdekt dat leukocyte extravasation treedt op in een meerstaps proces, met inbegrip van een eerste opname en rollen stap gemedieerd door selectinen en mucin-achtige moleculen zoals selectine P glycoproteïne ligand (PSGL) -1, gevolgd door integrine-afhankelijke stevige arrestatie en kruipen van T cellen op BBB endotheliale cellen te tolerant zijden voor diapedesis6.

Zodra T cellen hebben gekruist het endotheel BBB en het endotheel kelder membraan, moeten zij hun cognaat antigeen op macrofagen en dendritische cellen strategisch gelokaliseerd in de ruimten van leptomeningeale of gerelateerde tegenkomen. Deze interactie induceert focal productie van pro-inflammatoire mediatoren die trigger de volgende mechanismen nodig voor CNS weefsel invasie van immune cellen via de glia limitans7,8,9. Focal activering van matrix-metalloproteinasen (MMP) -2 en MMP-9 verandert chemokine activering en induceert afbraak van extracellulaire matrix receptoren op Astrocyt einde-voeten, die een voorwaarde is voor immuun cel migratie over de glia-limitans in de CNS parenchym en voor het opwekken van het begin van de klinische symptomen van EAE10,11.

Het combineren van detectie van CNS infiltreren immuun cel met BBB verstrekt lekkage en gelatinase activiteit in CNS weefselsecties waardevolle informatie over de functionele integriteit van het endotheel en gliale blok in het kader van neuroinflammation. Bijvoorbeeld, we onlangs onderzocht de constitutieve verlies van het endotheel tight junction molecuul regulates adhesie molecuul (JAM)-B mensenhandel immuun cel in het centraal zenuwstelsel in het kader van EAE. In vergelijking met gezonde wild-type C57BL/6 muizen, gezonde JAM-B-deficiënte nestgenoten toonde geen bijzondere waardevermindering van BBB integriteit zoals blijkt uit de beoordeling van de in vivo permeabiliteit met behulp van zowel endogene als exogene traceurs12. In het kader van EAE toonde JAM-B-deficiënte C57BL/6 muizen verbeterd ziekte symptomen, die werd geassocieerd met inflammatoire cel overlapping in de leptomeningeale en gerelateerde spaties12. Dit fenomeen bestuderen we toegepast in situ zymography, waardoor identificatie van gelatinase activiteit om te testen of het gebrek aan gelatinase activiteit in JAM-B-deficiënte muizen mogelijk verantwoordelijk voor het verlaagde aantal immuuncellen kundig voor inbreuk op de glia limitans12.

Gegeven van de beschikbaarheid van gemodificeerde verschillende genetisch muis modellen ontbreekt, bijvoorbeeld verschillende BBB tight junction moleculen die wijzigingen in functie van de BBB veroorzaken kunnen, methoden voor het onderzoeken van BBB integriteit zijn belangrijk. Daarnaast kon nieuw ontwikkelde geneesmiddelen beïnvloeden op NVU belemmeringen. Hier laten we zien hoe ertoe EAE in C57BL/6 muizen door actieve immunisatie met de myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)-peptide aa35-55 in volledige Freund de hulpstoffen. We dan uitleggen hoe te lokaliseren immuun cel infiltratie in de barrières van het endotheel en gliale van de NVU en hoe om te bestuderen in vivo endotheel en gliale barrière integriteit door ter plaatse detectie van exogene verklikstoffen en gelatinase, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studies werden uitgevoerd onder de richtlijnen volgens de Zwitserse wetgeving inzake de bescherming van dieren en zijn goedgekeurd door het Veterinair Bureau van het Zwitserse kanton Bern (toestemming nummers: BE 31/17 en worden 77/18/EG).

1. behuizing van C57BL/6 muizen in specifieke pathogene vrije (SPF) voorwaarden

  1. Huis muizen in individuele geventileerde kooien met een 12/12 h licht-donker cyclus. Voedsel en water ad libidum. Om het toezicht op de microbiologische kwaliteit van de muizen, onderging de experimentele cohort driemaandelijkse gezondheidsmonitoring door vuile beddengoed sentinels na FELASA aanbevelingen13.
  2. Gebruik oor stoten aan het afzonderlijk markeren 8-12 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen.

2. de immunisatie van C57BL/6 muizen

  1. Bereiding van de oplossingen14:
    1. Voor de Complete Freund adjuvans (CFA), mix 30 mL van onvolledig Freund van adjuvante met 120 mg van vers pestled warmte geïnactiveerd Mycobacterium tuberculosis (H37RA) onder een zuurkast. Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
    2. Voor de MOGaa35-55-peptide stockoplossing, los MOGaa35-55-peptide in steriele PBS (4 mg/mL) en opslaan bij-80 ° C.
    3. Voorbereiding van de MOG-emulsie:
      1. Verdun CFA 1:2 met MOG-peptide stockoplossing in een microtube 2 mL.
      2. Zegel van de microtube met het afdichten van film en monteren op een Vortex-mixer volledig bedekken de buis met plakband. Vortex emulsie voor 4 uur bij 4 ° C.
    4. Voorbereiding spuiten met stabiele emulsie:
      1. Neem de microtube en snel spin down de emulsie met behulp van een centrifuge tafeltje. Emulsie in een injectiespuit met behulp van een 18G x 1½'' (1.2 mm x 40 mm) injectie naald verzamelen.
      2. Volgens het aantal muizen aanpassen van het volume van de emulsie in de spuit (100 µL/muis) en de naald 18 G vervangen door een injectie naald 27G x ¾'' (0.4 mm x 19 mm). Het zegel van de naald van de injectie aangesloten op de spuit met de afdichting van de film.
    5. Voor de toxine (PTx) stockoplossing van pertussis, ontbinden 50 µg gelyofiliseerd PTx in 500 µL van steriele PBS (100 ng/µL). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
    6. Meng voor de PTx-werkoplossing, 97 µL van steriele PBS met 3 µL van PTx-stockoplossing (300 ng/100 µL) per muis (voor intraperitoneale injectie gebruik een 30G x ½'' (0.3 mm x 13 mm)-naald).
  2. EAE inductie
    1. Anesthetize C57BL/6 muizen met isofluorane met behulp van een vaporizer-systeem. Om te induceren anesthesie bij muizen, bloot de muis naar 4,5% isofluorane in zuurstof in een kamer klein incubatie vóór de overbrenging van de muis om een gelaatsmasker met 2,1% isofluorane. Gebruik een verdoving eenheid uitgerust met verwarming pad te voorkomen hypothermie van de muis.
    2. De narcose muis in de ene hand vast en 30 µL van MOG35-55/CFA-emulsie eerst subcutaan te injecteren in de flanken van de achterpoot (figuur 1:1 + 2; in totaal 60 µL; links flank 30 µL en rechterflank 30 µL) in de onmiddellijke nabijheid naar de inguïnale lymfeklieren.
    3. Plaats de muis op zijn buik en injecteren 20 µL van MOGaa35-55/CFA-emulsie in de links en rechts zachte vetweefsel aan de wortel van de staart (figuur 1:3 + 4; in totaal 40 µL; linkerzijde staart wortel 20 µL en rechterkant staart wortel 20 µL) en een kleine druppel van MOGaa35-55/CFA-emulsie int o de hals van de muis (Figuur 1: 5).
    4. Intraperitoneally 100 µL van PTx oplossing te injecteren in de muis. Houd het hoofd van de muis onder het lichaam center injectie in de darm voorkomen.
    5. Vervangen onderhoud dieet (extrudate belangrijke voedingsstoffen: ruw eiwit 18.5% ruw vet 4.5% ruwe vezel 4,5%, ruwe as 6,5%; zetmeel 35%; metabole energie: 13.1 MJ/kg) aan het dieet fokken (extrudate belangrijke voedingsstoffen: ruw eiwit 23,5%, ruw vet 5,5%; ruwe vezel 3%; ruw as 5,7%; zetmeel 36%; metabole energie: 14.3 MJ/kg) zodat de muizen met voedsel van hogere energie-inhoud vóór en tijdens de verwachte klinische ziekte.
    6. Verwijder het gezichtsmasker en de muis overbrengen in zijn kooi met een opwarming pad. Zorg ervoor dat de muis is volledig wakker en motile na 10 minuten.
    7. Herhaal de PTx injectie (2.2.4) 48 h na de eerste behandeling.

3. scoren van muizen EAE

  1. Controleer de gezondheidsstatus van muizen EAE elke ochtend door een kijkje te nemen binnen de kooien.
  2. Score van muizen EAE elke middag.
  3. Elke individuele muis opgenomen in de EAE-experiment uit de kooi en controleer of de staart tonus heeft door deze te verplaatsen naar boven met een vinger te nemen. Een gezonde muis zal houden de staart (de staart heeft een tonus). Als klinische EAE is begonnen, zullen de tonus van de staart lager, door een geleidelijke daling van de staart zichtbaar zijn. Uiteindelijk de muis zal niet in staat zijn op te heffen zijn staart helemaal.
  4. Plaats elke individuele muis opgenomen in het experiment van de EAE op de schone Bank en observeren en documenteren van het wandelen gedrag. Zie tabel 1,15 voor het scoren van criteria voor de beoordeling van de ernst van de ziekte (de EAE-score).
  5. Beoordelen en documenteren van het gewicht van elke muis opgenomen in het experiment.
  6. Om te zorgen voor voldoende voedsel en water opname door muizen weer te geven van een klinische EAE score van 1 leveren bevochtigd voedsel in een kunststof schotel op de bodem van de kooi en dagelijks te vernieuwen.

4. In vivo permeabiliteit assay

  1. Preparaten van oplossingen:
    1. Los voor dextran stamoplossingen, 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 evenals 3 kDa Dextran Texas Red in 500 µL van 0,9% natriumchloride-oplossing (20 mg/mL).
    2. Voor de werkoplossing dextran, net vóór injectie Pipetteer 55 µL van 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 stockoplossing (20 mg/mL) op een stuk van de sluiting van de film en voeg 55 µL van 3 kDa dextran Texas Red stockoplossing (20 mg/mL). Meng en 100 µL verzamelen in een wegwerp fijne spuit (definitieve concentratie van 2 mg/100 µL).
    3. Voor de 10% formaldehyde (PFA) stockoplossing, combineren 10 g PFA extra pure poeder, 100 mL PBS en 200 µL van 1N NaOH in een bekerglas van schoon glas en warmte tot juist 56 ° C onder roeren met een magneetroerder; houden bij 56 ° C gedurende 30 minuten totdat de PFA volledig is opgelost; afkoelen tot kamertemperatuur; Breng de pH aan 7.4; en filtreer door een papieren filter. Winkel bij - 20 ° C. De stockoplossing kan worden verdund verder met PBS.
  2. Kort anesthetize gezonde C57BL/6 muizen of C57BL/6 muizen EAE lijden met Isofluraan (de muis zal worden verdoofd voor ongeveer 1 minuut). Het gebruik van een geautomatiseerd systeem zoals in stap 2.2.1 (muizen zal worden blootgesteld aan 4,5% Isofluraan in zuurstof in een kamer van de inductie en vervolgens overgebracht naar een gelaatsmasker met 2,1% Isofluraan).
  3. Plaats de narcose muis in zijligging op tafel, dan intraveneus (bijvoorbeeld retro-orbitally) 100 µL van fluorescerende traceurs injecteren met de muis, voordat de muis wakker.
  4. Onmiddellijk verwijderen van de gelaatsmasker en zorg ervoor dat de muis is volledig wakker en motile na de korte narcose. Laat de tracer circuleren gedurende 15 minuten.
  5. Ga verder met stap 5.1.

5. perfusie van muizen

  1. Voor in vivo permeabiliteit beoordeling:
    1. Allereerst de procedure 15 min na tl tracer injectie inducerende diepe Isofluraan anesthesie. Om diepe verdoving in muizen gebruiken 2,3% van Isofluraan in zuurstof. Gebruiken van de poot terugtrekking reflex om te beoordelen van de diepte van de narcose (knijpen van de huid tussen de tenen; een gebrek aan flexie geeft aan een voldoende diepte), en de reflexen van de voorpoot zowel het stuk in muizen onderworpen aan EAE sonde.
    2. Los van de muis op zijn rug en de buik spuiten met ethanol. Open van de thorax met behulp van een schaar en verwijder het middenrif. Open het recht atrium van het kloppend hart met een schaar en perfuse van de muis via het linkerventrikel van het hart met 10 mL PBS gevolgd door 10 mL 4% PFA in PBS.
      Let op: Voorkom inademen van PFA, perfuse de muis in een zuurkast.
    3. Ga naar sectie 6.
  2. Voor in situ zymography:
    1. Diepe Isofluraan verdoving 2,3% Isofluraan met zuurstof in een muis EAE lijden veroorzaken, en controleren van de diepte van de verdoving zoals in stap 5.1.1.
    2. Vervolgens de muis vast op zijn rug en de buik spuiten met ethanol. Open van de thorax met behulp van een schaar en verwijder het middenrif. Open het recht atrium van het kloppend hart met een schaar en perfuse van de muis via het linkerventrikel van het hart met 20 mL PBS.
    3. Ga naar sectie 6.

6. dissectie en bevriezen van hersenen

  1. Bereiding van koeling Bad:
    1. Vul een platte dewar container met geplette droogijs en voeg 2-methylbutane (tolueen) totdat de vloeistof ongeveer 1 cm boven het droogijs pack tot. Bedek met een losse deksel – bijvoorbeeld een ijsemmer dekking.
  2. Clip uit het hoofd van de perfused muis met een scherpe schaar en verwijderen van de huid en oren met behulp van een kleiner aantal schaar.
  3. Zorgvuldig ontleden de skullcap door te snijden uit het foramen magnum naar voren op de linkerkant en de rechterkant te upfold de skullcap laat zien dat in de hersenen. Til vervolgens zorgvuldig uit de intact hersenen vanaf de onderkant van de schedel terwijl het versnijden van de optische zenuwen met behulp van een platte metalen spatel.
  4. Plaats van hersenen op aluminiumfolie en snij de hersenen in drie stukken (frontale hersenen, middelste hersenen, en cerebellum + hersenstam) door het plaatsen van twee coronale sneden.
  5. Vul een cryomold (25 x 20 x 5 mm) met het eerste kwartaal met optimale temperatuur snijden (O.C.T.) matrix, hersenen segmenten hechten aan de voorste kant van elk stuk van de hersenen beneden gericht in de cryomold en dekking van weefsel volledig met O.C.T. matrix.
  6. De cryomold met het weefsel in een horizontale richting in de 2-Methylbutane Bad plaatsen en ervoor te zorgen dat het weefsel vanaf de onderkant tot de bovenkant binnen 1 minuut bevriest door het vermijden van de gehele weefsel blok dompelen in het bad.
  7. Overdracht van bevroren weefsel tot-80 ° C voor opslag en gaat u verder met sectie 7.

7. bereiding van bevroren weefselsecties

  1. Equilibreer temperatuur van bevroren weefsel van-80 ° C tot-20 ° C in de cryostaat gedurende 30 minuten.
  2. Verwijderen van weefsel blok uit de cryomold en de mount op de cryostaat weefsel houder (ingesteld op-15 ° C) via een O.C.T. matrix.
  3. Trim de randen van het blok van het weefsel op de houder van de cryostaat met een scherpe scalpel, en beginnen met het snijden in het weefsel blok door het verwijderen van 20 µm secties met het mes van de cryostaat, totdat het weefsel zichtbaar is.
  4. Voor de analyse van in vivo BBB permeabiliteit:
    1. 6-10 µm weefselsecties knippen, verzamelen ze op hechting glas dia's en onmiddellijk het beeld van de secties bedekt met een slip van de cover met behulp van een fluorescentie Microscoop.
    2. Uiterlijk van de bloedvaten in de hersenen (Let op de scherpe randen van de niet-lekkende bloedvaten in vergelijking met diffuse fluorescentie patronen waargenomen voor de lekkende bloedvaten) te beoordelen. Als positieve controle, Controleer of de lekkage van de tracer in het stroma van de organen van de Circumventriculaire of de plexus choroideus die een BBB ontbreken.
  5. Voor in situ zymography:
    1. 6 µm weefselsecties met behulp van een cryostaat knippen, verzamelen ze op hechting glas dia's en bevriezen van weefselsecties bij-20 ° C in een bevriezing doos met silica gel in het deksel.

8. in situ zymography gecombineerd met laminin/CD45 immunofluorescentie kleuring

  1. Oplossingen voor te bereiden:
    1. Bereid insluiten-oplossing:
      1. Meng 6 g glycerol (p.a.), 2,4 g van poly (vinylalcohol) en 6 mL ddH2O 12 mL 0,2 M Tris buffer, pH 8, en roer (magneetroerder) de oplossing voor 4 uur op RT.
      2. Breng de oplossing over in een tube van 50 mL centrifuge en laat het rusten gedurende 2 uur op RT. Vervolgens laat de oplossing gedurende 10 minuten bij 50 ° C (waterbad) en Centrifugeer gedurende 20 min bij 2700 x g bij kamertemperatuur inwerken.
      3. Neem het supernatant en bevriezen in aliquots bij-20 ° C.
    2. Bereid gelatine koude-oplossing:
      1. Los 0,1 g koude gelatine van boviene huid in 10 mL ddH2O.
      2. Laat het weken voor minimaal 1 dag en op te slaan aliquots bij 4 ° C.
    3. Bereiden ijskoude methanol (-20 ° C):
      1. 100% methanol zetten in een coplin pot en koel hem af tot-20 ° C.
    4. 10% natrium azide stamoplossing te bereiden:
      1. Voeg 1 g van natriumazide tot 10 mL van ddH2O en bewaren bij kamertemperatuur.
    5. Bereiden van 0,1% natrium azide werkende oplossing:
      1. Mix 99 µL van ddH2O met 1 µL van 10% natrium azide stockoplossing.
    6. Los 1 mg geconjugeerd fluoresceïne kleurstof-uitgeblust (DQ) gelatine van varken huid in 1 mL natriumazide werken oplossing en winkel 100 µL aliquots beschermd tegen licht bij 4 ° C.
    7. Los op 30 mg 1,10-phenanthroline monohydraat in 76 µL van ethanol en winkel bij-20 ° C.
    8. 25 x protease inhibitor van de omwenteling-oplossing te bereiden:
      1. Meng 1 tablet van EDTA gratis proteaseinhibitor 2 mL ddH2O. Winkel bij-20 ° C.
    9. Bereid de reactie-oplossing (150 µL/sectie) vlak voor gebruik:
      1. De 1 mg/mL DQ gelatine oplossing voor 5 min op 13,300 x gcentrifugeren.
      2. Mix 127,2 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer (Gelatinase/Collagenase Assay Kit; Zie Tabel of Materials), 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine, 1.5 µL van 1 mg/mL DQ gelatine en 6 µL van 25 x protease inhibitor oplossing.
    10. Net voordat hij gebruik, stelt phenantroline negatieve reactie bedieningsoplossing (150 µL/sectie):
      1. Mix 125.2 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer, 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine, 1.5 µL van 1 mg/mL DQ gelatine, 6 µL van 25 x proteaseinhibitor EDTA gratis en 2 µL van 2 M 1,10-phenantroline (MMP-remmer).
    11. Vlak voor gebruik bereiden koude gelatine (niet-tl) negatieve reactie bedieningsoplossing (150 µL/sectie):
      1. Mix 128,7 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer, 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine en 6 µL van 25 x proteaseinhibitor EDTA-vrij.
    12. Primair antilichaam cocktail voor de counterstaining, bijvoorbeeld, 0.95 µg/mL polyklonale konijn anti-laminin antistof en 10 µg Fe/mL polyklonale rat anti-CD45 antistof in 1% BSA in PBS voorbereiden, en passende isotype controle primair antilichaam cocktails te bereiden.
    13. Bereiden van secundair antilichaam oplossing, bijvoorbeeld 7,5 µg/mL Cy3 geit anti-rat + 15 µg Mo/mL AMCA anti-konijn in 1% BSA in PBS (beschermen tegen licht).
  2. Ontdooien 6 µm hersenen niet-vaste weefselsecties van EAE muizen binnen de plastic bevriezing doos met silica gel in het deksel in een zuurkast te voorkomen retentie van water aan het weefsel en 2 weefselsecties op één dia scheiden door het tekenen van lijnen met een water afstotende pen
  3. Reactie oplossingen (stappen 8.1.9-8.1.11) bereiden, Centrifugeer gedurende 5 min bij 13.400 x g bij kamertemperatuur, en pre warm tot 37 ° C met behulp van een waterbad.
  4. Hydrateren de weefselsecties gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 1 x reactie buffer. Vervolgens giet af de 1 x reactie buffer, reactie oplossing toevoegen op de weefselsecties en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Dia's 5 keer wassen in ddH2O.
  5. Herstellen van secties voor 5 min met de ijskoude methanol bij-20 ° C en daarna wassen secties keer met PBS bij kamertemperatuur.
  6. 1% BSA in PBS toevoegen aan de secties en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht). Vervolgens, 1% BSA in PBS van de secties te negeren door het omkeren van de dia's op weefsel, primair antilichaam cocktail toevoegen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht).
  7. Wassen van secties tweemaal met PBS, toevoegen van secundair antilichaam cocktail en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht).
  8. Wassen van secties tweemaal met PBS, mount de dia's met insluiten oplossing, laat gemonteerd secties over nacht bij kamertemperatuur drogen (beschermen tegen licht). Ten slotte analyseren gebeitst weefselsecties met behulp van een fluorescente microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evaluatie van de klinische cursus van EAE in C57BL/6 muizen zou moeten resulteren in een bocht van de ziekte zoals afgebeeld in figuur 2A en veranderingen in het lichaamsgewicht muis als aangegeven in figuur 2B. C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOGaa35-55 meestal beginnen te ontwikkelen van de ziekte symptomen rond dag 10-12 na actieve immunisatie (figuur 1A). Geïmmuniseerde muizen Toon een voorbijgaande daling van het lichaamsgewicht meestal de dag na de injectie van de emulsie en de eerste dosis van pertussis toxine (figuur 1B). Vanaf dag 2 na EAE inductie verhoogt het lichaamsgewicht van geïmmuniseerde muizen dan geleidelijk tot de ziekte begint, wanneer het lichaamsgewicht meestal druppels van één dag voorafgaand aan de ontwikkeling van klinische symptomen en dalen correleren blijft aan de toenemende de symptomen van de ziekte (figuur 1A,B). De ernst van de ziekte EAE verhoogt tot het hoogtepunt van de ziekte, die kan worden verwacht tussen dagen 16 en 20 na EAE inductie (figuur 2A). Op het hoogtepunt van klinische EAE blijkt muizen ook het laagste lichaamsgewicht (figuur 2B), waardoor in correlatie met verbetering van EAE in de verlossing-fase van de ziekte (figuur 2A,B). EAE inductie in C57BL/6 muizen met behulp van MOGaa35-55 resultaten bij een chronische ziekte-pathologie, en muizen meestal niet volledig herstellen (figuur 1A).

Figuur 3A geeft een representatief beeld van de plexus choroideus en de aangrenzende hersenen parenchym van een C57BL/6 muis lijden EAE die intraveneus met TL 3 kDa Dextran (rood) en 10 kDa Dextran (groen) 15 min voordat het offeren ingespoten was ; schaal bar 50 µm. Zoals we eerder hebben aangetoond, tracers gemakkelijk diffuus over de fenêtré microvessels in het stoma van de plexus choroideus (linker- en middelste foto), terwijl de BBB de verspreiding verbiedt van de verklikstoffen in de hersenen parenchym, circulerende aangegeven door de onderbroken lijn (rechterbeeld) is die dus verstoken van elke fluorescent signaal. Figuur 3B toont representatieve lekkende bloedvaten in het cerebellum van een C57BL/6 muis lijden EAE die intraveneus met TL 3 kDa Dextran (rood) en 10 kDa Dextran (groen) 15 min voor opofferen ingespoten was. Pijlpunten geven traceurs verspreid over de microvessels van de hersenen in de CNS parenchym (linker- en middelste foto), wat suggereert dat de BBB-functie in deze schepen wordt aangetast. In de CNS parenchym is groene en rode fluorescerende signaal zichtbaar buiten het bloedvat muren, die worden aangegeven door onderbroken lijnen. In EAE, kan in het cerebellum waar inflammatoire manchetten de traceurs verschijnen ook worden gevonden in de gerelateerde ruimte tussen het endotheel membraan van de kelder en de limitans van de glia die functioneel verlies van endothelial BBB integriteit aangeeft. Als tracer is gevonden om te verspreiden in de hersenen parenchym, toont het extra disfunctie van de gliale barrière-12.

Figuur 4 toont representatieve foto's van de analyse van de gelatinase (MMP) activiteit in de hersenen van een EAE van een C57BL/6 muis gevisualiseerd door ter plaatse zymography en gelokaliseerd op specifieke hersenen barrière compartimenten door anti-pan-laminin (blauw) en de aanwezigheid van ontstekingscellen door anti-CD45 (rood) immunofluorescentie kleuring. Proteolytische splitsing van kleurstof-uitgeblust (DQ) gelatine unquenches een fluoresceïne-signaal, waardoor de lokalisatie van de activiteiten van de gelatinase op de weefselsectie. Wanneer koude gelatine (niet-belichting fluorescerende control) is geïncubeerd, geen groen fluorescent signaal kan worden opgespoord in de secties van de hersenen van de muizen EAE (bovenste rij) alsmede in secties die hebben zijn geïncubeerd met DQ-gelatine gecombineerd met phenantroline, a potent Zn +- complexvormer en MMP-remmer (middelste rij). In de onderste rij is focal gelatinase/MMP activiteit zichtbaar als typische granulaire helder groene fluorescentie signaal, zoals benadrukt door de pijlpunten. In de inflammatoire manchetten in het cerebellum muizen EAE plaatsvindt specifieke MMP activiteit buiten de glia limitans (blauw) op sites van inflammatoire cel infiltratie (rood).

Figure 1
Figuur 1 : Grafische weergave van injectie sites voor EAE inductie. 1) injectieplaats voor 30 µL MOG-emulsie in de rechterflank, 2) de injectieplaats voor 30 µL MOG-emulsie in de linkerflank, 3) injectieplaats voor 20 µL MOG-emulsie in de linker staart wortel, 4) injectieplaats voor 30 µL MOG-emulsie in de juiste staart wortel 5) injectieplaats voor een kleine druppel van MOG-emulsie in de hals. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Representatief natuurlijk EAE. (A) symptomen van de ziekte van EAE in C57BL/6 muizen na verloop van tijd. Gemiddelde +/-SEM wordt weergegeven. (B) verandering van lichaamsgewicht tijdens EAE na verloop van tijd. Gemiddelde +/-SEM wordt weergegeven.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatief beeld van in vivo permeabiliteit. (A) linkerbeeld: groen fluorescent 10 kDa dextran op het niveau van de plexus choroideus. Middelste foto: rode fluorescerende 3 kDa dextran op het niveau van de plexus choroideus. Rechterbeeld: samenvoegen van de linker- en middelste foto's. Schaal bar 50 µm. (B) linkerbeeld: groen fluorescent 10 kDa dextran in het cerebellum van de muis. Middelste foto: rode fluorescerende 3 kDa dextran in het cerebellum van de muis. Rechterbeeld: samenvoegen van de linker- en middelste foto's. Onderbroken lijnen zijn indicatief voor bloedvat muren; pijlpunten wijs fluorescerende verklikstoffen in de CNS parenchym. Schaal bar 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Representatieve foto's van in situ zymography. Eerste kolom: groen fluorescent kanaal (ongelest signaal van kleurstof-uitgeblust (DQ) gelatine). Tweede kolom: blauwe fluorescerende kanaal (laminin). Derde kolom: rode fluorescerende kanaal (CD45). Vierde kolom: samenvoegen van fluorescerende kanalen. Bovenste rij: koude gelatine (niet-tl) negatieve controle. Middelste rij: phenantroline (MMP-remmer) negatieve controle. Onderste rij: DQ gelatine. Schaal bar 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

score van 0 tot en met 3-punt criteria gewicht wijzigen
0 geen tekenen normaal gewicht
~ zwakke staart (zwakke tonus) - inhouse criteria: niet opgenomen in de gedocumenteerde scoren gewichtsverlies (indicatief voor 2e check)
0,5 Limp staart (staart druppels) verlies van het gewicht
1 de zwakte van de hindleg, onvast gait (de muis loopt op de Bank als een eend) verlies van het gewicht
2 hindleg dwarslaesie (muis niet beweegt haar hindlimbs) ernstig gewichtsverlies (indicatief voor 2e check)
3 hindleg dwarslaesie, incontinentie verlies van lagere lichaam controle (muis falls naar één kant maar kunt verplaatsen in de kooi met behulp van ist voorpoten + incontinentie; stervende) zeer laag lichaamsgewicht (indicatief voor 2e check)

Tabel 1: Scoren criteria voordebeoordeling van EAE ziekte-ernst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier presenteren we een protocol om te induceren en monitor EAE in vrouwelijke C57BL/6 muizen. Vrouwtjes worden bij voorkeur gekozen, en er is een incidentie van vrouwen: mannen van 3:1 in MS. Om te beoordelen van de ernst van de EAE, wij maakte gebruik van een 3-punts scoren blad. EAE ernst is over het algemeen scoorde met betrekking tot de ernst van de motorische stoornissen. Muizen met geavanceerde stadia van EAE, d.w.z. exposeren een score boven 2 mag worden opgeofferd om te voorkomen dat onnodig lijden van de dieren. Dus het is aangeraden te scoren de muizen op korte tussenpozen bijvoorbeeld tweemaal daags zoals uiteengezet in het protocol.  Er zijn verschillende punten scoren routines werkzaam, bereiken van 0-3 tot en met 0-6 punten16,17,18,19 , of zelfs meer subpoints20. Wij hebben echter eerder getoond dat zogenaamd verfijnde EAE scoren niet tot enige verbetering leidt bij de bepaling van de potentiële statistisch significante verschillen in ziekte scores tussen groepen, bij het overwegen van de algehele ziekte ernst15. Op basis van deze constatering die we maakten gebruik van de 3-punts-schaal voor de beoordeling van de progressie van de ziekte in EAE teneinde muis verwerkingstijd en dus nood voor muizen de 3R uitvoeringsbepalingen. Een ander kritisch punt met behulp van de EAE-model te bestuderen van de verschillen tussen knock-out en wild-type muizen of verschillen tussen de groepen van de behandeling is het opzetten van een nauwkeurige experimentele planning. Wild-type muizen zijn in vergelijking met de knock-out muizen, is het essentieel om te vergelijken nestgenoten die afkomstig zijn van een heterozygoot verparingen zodat identieke genetische achtergronden van de wild-type en knockout muizen vergeleken in de EAE-experiment. Het is ook belangrijk om te houden van dezelfde voorwaarden voor alle muizen opgenomen in een experiment, bijvoorbeeld wijzigingen van de kooi, beheer van natte voedsel, en met name muis (status) woonomstandigheden. Om te voorkomen dat de kooi-specifieke verschijnselen geïnduceerd door de onderzoeker, moet Kruis-immunisatie worden uitgevoerd. Meer precies, als meer dan één spuit nodig is voor het immuniseren van een bepaald aantal muizen, moeten ze worden willekeurig toegewezen aan verschillende spuiten gebruikt. De laatstgenoemde moet eveneens gelden voor de uitvoering van studies van de behandeling. Laatste maar niet minder belangrijk, de gezondheidstoestand van muizen gehuisvest in verschillende dierlijke faciliteiten kan van invloed zijn op de ziekte-incidentie en ernst en dus meer21 of minder Mycobacterium tuberculosis22 wellicht is vereist voor het opwekken van een goede klinische ziekte. Bovendien, de plaats van injectie invloed kan zijn op ontwikkeling van de ziekte. In dit protocol stellen wij voor om te injecteren van relatief kleine volumes in vijf verschillende subcutane sites: 30 µL in twee flanken, 20 µL in de links en rechts staart wortel en een kleine druppel in de nek. In andere protocollen, worden 50 µL depots subcutaan geplaatst in de staart wortel enige23 of in de vier flanken21. Injecties van kleinere depots, echter wel minimaliseren het risico veroorzaken irritatie van de huid, welke muizen om te krabben proberen kunnen.

In vivo permeabiliteit kan worden uitgevoerd om te beoordelen van BBB lekkage tijdens EAE, maar ook om te beoordelen of de specifieke genetische verwijdering van een molecuul of een medicamenteuze behandeling van invloed is op de BBB integriteit in vivo. Dit kan worden uitgevoerd ofwel door het opsporen van endogene plasma traceurs zoals IgG deposito's12 of exogene trances die worden toegepast in de circulatie van een levend muis24. In dit protocol hebben we gemaakt gebruik van twee verschillende exogene traceurs (3 kDa en 10 kDa Dextran) die tegelijkertijd waren geïnjecteerd en toegestaan om te circuleren voor een bepaalde tijd van 15 min. met behulp van twee traceurs met verschillende formaten kunt bepalen van de ernst van de BBB dysfunctie en mogen toestaan dat een cutoff voor tracer maten die diffuus of niet over de BBB definiëren. Fluorescerende dextrans zijn hydrofiel polysacchariden gekenmerkt door goede water oplosbaarheid, lage toxiciteit, en relatief lage immunogeniciteit. Bovendien zijn dextrans samengesteld uit poly-(α-D-1,6 glucose), die resistent zijn tegen splijten door endogene cellulaire glycosidases. We gebruikten hier dextran varianten die lysine residuen in de geconjugeerde dextran opgenomen hebben. Lysinated dextrans zijn aldehyde muur, die het mogelijk maakt om op te lossen de tracer in het weefsel. Naast fluorescently geëtiketteerde dextrans, kunnen andere chemicaliën worden gebruikt om te beoordelen in vivo permeabiliteit, bijvoorbeeld Hoechst kleurstof in combinatie met Evan's blue, dat aan een groot deel aan serumalbumine bindt. Hoechst vlekken de BBB endothelial celkernen CNS microvessels voering, en Evan's blauw kan worden gedetecteerd in de ruimte gerelateerde op BBB dysfunctie en diffundeert verder wanneer de glia limitans is gestoord25,26. Daarentegen biedt in vivo permeabiliteit beoordeling door immunefluorescentie kleuring van endogene markers inzicht in de accumulatie van, bijvoorbeeld, IgG moleculen of fibrinogeen, een glycoproteïne die in het bloed, na verloop van tijd circuleert. In gezonde omstandigheden, de gerelateerde ruimte is heel smal en het endotheel membraan van de kelder en de glia limitans zijn nauw verbonden en, dus, visualiseren van de twee ECM barrières van de NVU vereist laminin isovorm-specifieke antilichaam kleuring van27 .

Endogene IgG moleculen zijn aanwezig tijdens gezondheid en ziekte binnen de bloedvaten zo goed zoals in het weefsel van organen van de Circumventriculaire, waar geen BBB gevestigde12is. Muizen met hersenen barrière defecten, tijdens de drugsbehandeling in gen gewijzigd, of tijdens neuroinflammation endogene moleculen die normaal in het bloed circuleren kan worden gedeponeerd in de CNS parenchym, die kan worden gevisualiseerd door counterstaining met anti-laminin antistoffen ofwel herkennen alle laminin isoforms (pan-laminin antilichamen) of laminin isovorm-specifieke antilichamen toestaan om te onderscheiden van laminins, laminin α4 en α5 van het endotheel kelder-membraan en laminin alpha1 en laminin alpha2 van de glia limitans. Tijdens neuroinflammatoire voorwaarden kan de ruimte gerelateerde worden verruimd door het infiltreren van immune cellen toestaan om zowel het endotheel membraan van de kelder en de glia limitans met behulp van een pan-laminin-antilichaam te identificeren. Counterstaining van laminins aanwezig op de NVU toestaat om te beoordelen of endogene maar ook exogene verklikstoffen worden afgezet in de CNS parenchym en counterstaining van CD45 toestaat om te beoordelen of focal lekkage van de BBB geassocieerd met immuun cel wordt infiltratie.

Immuun cel migratie naar de CNS parenchym vereist de sequentiële kruising van twee verschillende belemmeringen binnen de NVU, de endothelial BBB en vervolgens de glia limitans28. Overschrijding van de glia limitans en CNS toetreding van immuuncellen correleert met het begin van de klinische EAE29, terwijl CNS infiltreren cellen opgesloten in leptomeningeale en gerelateerde ruimten, activeren geen klinische EAE. Immuun cel overlapping in leptomeningeale en gerelateerde ruimten tussen kelder membranen is waargenomen in verschillende genetische gemodificeerde Muismodellen BV L-selectine knock-out muizen30, TNF knock-out muizen23, MMP2/MMP9 dubbele knock-out muizen10 , en JAM-B knock-out muizen12. Deze bevindingen onderstrepingsteken dat gebrek aan deze moleculen heeft geen invloed op immuun cel migratie in de BBB maar eerder over de glia limitans, onderstrepen dat moleculaire mechanismen bemiddelen immuun cel migratie over de BBB en de glia-limitans zijn onderscheiden. Hersenen in situ zymography is een methodologie te onderzoeken voor focal gelatinase activiteit in een weefselsectie in precieze ruimtelijke correlatie met CNS pathologie. Detectie van in vivo BBB permeabiliteit samen met in situ zymography op te sporen van MMP2/MMP9 activiteit uitvoeren dus Hiermee kunt af te bakenen endothelial versus glia barrière verstoring in correlatie met immuun cel infiltratie. Gecombineerd met pan-laminin en CD45 immunofluorescentie kleuring op EAE hersenen secties, staat het zowel de lokalisatie van de activiteiten van de gelatinase van de unquenching DQ-gelatine en de lokalisatie van immuuncellen infiltreren op hetzelfde moment. Unquenching van fluoresceïne van DQ-gelatine resultaten in een typische granulaire helder groene fluorescentie-signaal, terwijl fragmentarische vaag groen fluorescent gebieden op weefselsecties moeten worden beschouwd als aspecifieke signaal12. Zorgvuldige evaluatie van weefselsecties en goede controles zijn dus onmisbaar bij het uitvoeren van in situ zymography. In dit protocol hebben we uitgevoerd in situ zymography in combinatie met CD45 en laminin vlekken. Primaire antilichamen tegen zowel CD45 als laminin werden geïncubeerd als een mix op hetzelfde moment. Ook werden secundaire antilichamen geïncubeerd als een mix in een tweede stap in de kleuring. Die combinatie van antilichamen moet testen om ervoor te zorgen dat de tweede fase antilichamen worden geabsorbeerd tegen andere IgGs teneinde Kruisallergie.

Samen genomen, bieden de hier gepresenteerde protocollen hulpprogramma's om te onderzoeken in detail welk element van de NVU in neuroinflammatoire voorwaarden van EAE is aangetast. In vivo permeabiliteit beoordeling door exogene traceurs kunt identificeren huidige bijzondere waardevermindering van microvasculaire endothelial cel integriteit of huidige aantasting van de NVU. Bovendien kan de invoering van verklikstoffen met verschillende maten te schatten van de ernst van BBB bijzondere waardevermindering. Aanvullende in-situ zymography onthult focal gelatinase activiteit in astrocyten en potentieel ontstekingscellen, dat nodig is voor het schenden van de glia-limitans als een laatste barrière voor het verkrijgen van toegang tot de CNS parenchym10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij erkennen dankbaar Lydia Sorokin, die heeft haar oorspronkelijke in situ zymography protocol10 gedeeld met ons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113, (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48, (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).More

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter