Summary
Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.
Abstract
L'unità neurovascolare (NVU) è composto da cellule endoteliali microvascolari formando l'emato - encefalica (BBB), una membrana basale endoteliale con periciti incorporati, e la limitans glia composto da membrana dello scantinato parenchimatica e astrocitari alimentazione di testata che abbracciano l'aspetto abluminale di microvasi del sistema nervoso centrale (SNC). Oltre a mantenere CNS omeostasi il NVU controlla delle cellule immuni traffico nello SNC. Durante immunosorveglianza dello SNC basso numero di linfociti attivati può attraversare la barriera endoteliale senza causare BBB disfunzione o malattia clinica. Al contrario, durante la neuroinfiammazione come nella sclerosi multipla o il modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) un gran numero di cellule del sistema immunitario può attraversare la BBB e, successivamente, la glia limitans raggiungendo alla fine il parenchima di CNS che conducono alla malattia clinica. Migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS è dunque un processo in due fasi che comporta una migrazione sequenza attraverso la barriera endoteliale e gliale di NVU che impiegano meccanismi molecolari distinti. Se dopo il loro passaggio attraverso la barriera endoteliale, cellule T incontrano loro antigene cognate su cellule presentanti l'antigene perivascolare loro riattivazione locale avvierà successivi meccanismi che portano all'attivazione focale della gelatinasi, che consentirà le cellule di T di attraversare la barriera glial e immettere il parenchima di CNS. Così, valutazione, permeabilità BBB e attività MMP in correlazione spaziale per accumulo di cellule immuni nel SNC durante EAE permette di specificare perdita di integrità delle barriere endoteliali e gliali la nvu. Mostriamo qui come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva e come analizzare successivamente permeabilità BBB in vivo usando una combinazione di traccianti fluorescenti esogeni. Più ulteriormente indichiamo, come visualizzare e localizzare attività della gelatinasi nei cervelli EAE in situ zymogaphy accoppiato al immunofluorescente stainings di membrane dello scantinato BBB e CD45 + cellule immunitarie invasori.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) coordina tutto il corpo e funzioni mentali nei vertebrati, e l'omeostasi del CNS è essenziale per una corretta comunicazione dei neuroni. Omeostasi del CNS è garantito dall'unità neurovascolare (NVU), che protegge il sistema nervoso centrale da milieu cambiamento del flusso sanguigno. Il NVU è composto di cellule endoteliali microvascolari CNS, che sono biochimicamente unici e stabilire l'emato - encefalica (BBB) continuo crosstalk con periciti, astrociti, neuroni e componenti della matrice extracellulare (ECM), che istituisce due distinta delle membrane dello scantinato1. La membrana basale endoteliale che ensheathes l'aspetto abluminale delle cellule endothelial BBB ospita un elevato numero di periciti e si compone di laminina α4 e laminin α5, oltre ad altre proteine ECM2. Al contrario, la membrana basale parenchimatica consiste di laminina α1 e α2 laminina ed è abbracciata dai puntali astrocytic. La membrana basale parenchimatica insieme con i puntali Astrocita compone il limitans glia che segrega la rete neuronale CNS dal liquido cerebrospinale riempito perivascolare o spazi subaracnoidei3. Dovuto l'architettura unica del NVU, delle cellule immuni traffico nello SNC sono distinta da che nei tessuti periferici come richiede un processo in due fasi con le cellule immunitarie, violazione prima endothelial BBB e successivamente il limitans glia al fine di raggiungere il parenchima di CNS.
Sclerosi multipla (SM) è una malattia comune neuroinfiammatorie dello SNC, in cui un gran numero di cellule immuni circolanti immettere il CNS e causare neuroinfiammazione, demielinizzazione e perdita focale di BBB integrità4. Perdita di integrità BBB è un precoce segno distintivo della MS, come indicato dalla presenza di contrasto gadolinio aumentando le lesioni del SNC come visualizzati da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)5. Diapedesi nello SNC avviene a livello delle venule post-capillari; Tuttavia, i meccanismi precisi coinvolti nel processo di diapedesi delle cellule immuni attraverso la membrana dello scantinato BBB e successivamente la barriera glial rimangono per essere esplorato. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) serve come modello animale per MS e ha contribuito in modo significativo alla nostra attuale conoscenza sulla patogenesi della SM. Per esempio, utilizzando il modello di EAE è stato scoperto che lo stravaso del leucocita si verifica in un processo a più fasi, tra cui un'acquisizione iniziale e rotolamento passaggio mediato da selectine e mucina-come molecole come ligando di glicoproteina P-selectina (PSGL) -1, seguita da arresto ferma integrina-dipendente e scansione di cellule T su cellule endoteliali BBB ai lati permissivi per diapedesi6.
Una volta che le cellule di T hanno attraversato il BBB endoteliale e la membrana basale endoteliale, hanno bisogno di incontrare il loro antigene cognate su macrofagi o cellule dendritiche strategicamente localizzate negli spazi leptomeningeal o perivascolare. Questa interazione induce focale produzione di mediatori pro-infiammatori che attivano i meccanismi successivi necessari per invasione del tessuto CNS di cellule del sistema immunitario tramite il glia limitans7,8,9. Attivazione focale di metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9 altera l'attivazione delle chemochine e induce la degradazione dei recettori di matrice extracellulare Astrocita fine-piedi, che è un prerequisito per immunitario cellulare migrazione attraverso il limitans glia nella Parenchima di CNS e per indurre l'insorgenza di sintomi clinici di EAE10,11.
La combinazione di rilevamento del sistema nervoso centrale di infiltrazione delle cellule immuni con BBB perdite e gelatinasi attività in sezioni di tessuto di CNS fornisce preziose informazioni circa l'integrità funzionale della barriera endoteliale e gliale nel contesto del neuroinflammation. Per esempio, abbiamo recentemente studiato la perdita costitutiva della molecola di adesione giunzionale del molecola endoteliale stretta della giunzione (marmellata)-B delle cellule immuni traffico nello SNC nel contesto di EAE. Non rispetto ai topi C57BL/6 di selvaggio-tipo sani, sani littermates JAM-B-carente ha mostrato alcuna compromissione dell'integrità BBB come mostrato dalla valutazione di permeabilità in vivo mediante traccianti endogeni come pure esogeno12. Nel contesto di EAE, topi C57BL/6 JAM-B-carente ha mostrato sintomi di malattia migliorata, che è stato associato con intrappolamento delle cellule infiammatorie negli spazi leptomeningeal e perivascolare12. Per esaminare questo fenomeno abbiamo applicato in situ zymography, che consenta l'identificazione dell'attività della gelatinasi al fine di verificare se la mancanza di attività della gelatinasi in topi carenti-marmellata-B può essere responsabile per la riduzione del numero di cellule del sistema immunitario in grado di violare il glia limitans12.
Data la disponibilità di diversi geneticamente modificati del mouse modelli manca, ad esempio, diverse molecole di giunzione stretta BBB che potrebbero causare cambiamenti nella funzione BBB, metodologie per l'analisi di integrità BBB sono importanti. Inoltre, recentemente sviluppati farmaci potrebbero influire sugli ostacoli NVU. Qui vi mostriamo come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva con la glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG)-peptide aa35-55 a coadiuvanti di Freund completo. Spieghiamo quindi come localizzare l'infiltrazione delle cellule immuni attraverso le barriere endoteliali e gliali la NVU e come studiare l'integrità della barriera endoteliale e gliali in vivo di rilevazione in situ di traccianti esogeni e attività della gelatinasi, rispettivamente.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati condotti sotto la Guida di riferimento secondo la legislazione svizzera sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall'ufficio veterinario del Cantone di Berna, in Svizzera (numeri di autorizzazione: BE 31/17 ed essere 77/18).
1. alloggiamento dei topi C57BL/6 in condizioni di agente patogeno specifico gratuite (SPF)
- Ciclo di casa topi in gabbie individuali ventilate con un 12/12 h chiaro-scuro. Fornire cibo e acqua ad libidum. Per sorvegliare la qualità microbiologica dei topi, il gruppo sperimentale ha subito monitoraggio trimestrale da sentinelle di biancheria sporca segue il FELASA consigli13.
- Uso dell'orecchio pugni per contrassegnare individualmente topi C57BL/6 femmina 8-12 settimana di vita.
2. immunizzazione dei topi C57BL/6
- Preparazione di soluzioni14:
- Per adiuvante completo di Freund (CFA), mix 30 mL di adiuvante di Freund incompleto con 120 mg di calore appena si inattivato tubercolosi del micobatterio (H37RA) sotto una cappa aspirante. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Per la soluzione di riserva MOGaa35-55-peptide, sciogliere MOGaa35-55-peptide nel PBS sterile (4 mg/mL) e conservare a-80 ° C.
- Preparare il MOG-emulsione:
- Diluire CFA 1:2 con soluzione stock di MOG-peptide in una microprovetta da 2 mL.
- Sigillare la microprovetta con pellicola sigillante e difficoltà su un Vortex coprendo completamente il tubo con nastro adesivo. Emulsione di vortice per 4 h a 4 ° C.
- Preparare le siringhe con emulsione stabile:
- Prendere i conetti e ruota velocemente giù l'emulsione utilizzando una centrifuga di piccolo tavolo. Raccogliere emulsione in una siringa con un ago per iniezione 18 x 1½'' (1,2 mm x 40 mm).
- Secondo il numero di topi regolare il volume di emulsione nella siringa (100 µ l/topo) e sostituire l'ago da 18 G con un ago per iniezione 27 x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Sigillare l'ago per iniezione collegato alla siringa con pellicola sigillante.
- Per la soluzione di riserva di tossina (PTx) pertosse, sciogliere 50 µ g di liofilizzato PTx in 500 µ l di PBS sterile (100 ng / µ l). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Per la soluzione di lavoro di PTx, mescolare 97 µ l di PBS sterile con 3 µ l di soluzione madre di PTx (300 ng/100 µ l) per uso del mouse (iniezione intraperitoneale un ago 30 x ½'' (0,3 mm x 13 mm)).
- Induzione di EAE
- Anestetizzare topi C57BL/6 con isofluorano utilizzando un sistema di vaporizzatore. Per indurre l'anestesia in topi, esporre il mouse al 4,5% isofluorano in ossigeno in una camera di incubazione piccolo prima di trasferire il mouse in una maschera facciale con 2,1% isofluorano. Utilizzare un'unità di anestesia con rilievo di riscaldamento per prevenire l'ipotermia del mouse.
- Difficoltà il mouse anestetizzato in una mano e prima di iniettare per via sottocutanea 30 µ l di MOG35-55/CFA-emulsione in fianchi posteriori della gamba (Figura 1:1 + 2; in totale 60 µ l; sinistra fianco 30 µ l e fianco destro 30 µ l) nella prossimità vicina ai linfonodi inguinali.
- Posizionare il mouse sul suo ventre e iniettare 20 µ l di MOGaa35-55/CFA-emulsione nel tessuto adiposo softkey destro e sinistro alla radice della coda (Figura 1:3 + 4; in totale 40 µ l; lato destro e lato sinistro coda radice 20 µ l di coda radice 20 µ l) e una piccola goccia di MOGaa35-55/CFA-emulsione int o il collo del mouse (Figura 1: 5).
- Iniettare 100 µ l di soluzione di PTx intraperitonealmente nel mouse. Tenere la testa del mouse sotto il centro del corpo evitando iniezione nell'intestino.
- Sostituire la dieta di mantenimento (estruso principali sostanze nutritive: grassi greggi 4.5%, proteina greggia 18,5%; fibra grezza 4,5%; ceneri gregge 6,5%; amido 35%; energia metabolica: 13,1 MJ/kg) alla dieta di allevamento (estruso principali sostanze nutritive: proteina greggia 23,5%; grassi greggi 5,5%, fibra grezza 3%; ceneri grezze 5,7%; 36% di amido; energia metabolica: 14,3 MJ/kg) al fine di fornire i topi con cibo di maggiore contenuto energetico prima e durante la malattia clinica prevista.
- Rimuovere la maschera e trasferire il mouse alla sua gabbia a casa con un rilievo di riscaldamento. Assicurarsi che il mouse è completamente sveglio e motili dopo 10 minuti.
- Ripetere l'iniezione di PTx (2.2.4) 48 h dopo il primo trattamento.
3. Punteggio di topi EAE
- Controllare lo stato di salute dei topi EAE ogni mattina da un'occhiata all'interno delle gabbie.
- Punteggio ottenuto topi EAE ogni pomeriggio.
- Prendere ogni singolo mouse inclusi nell'esperimento EAE fuori la gabbia e verificare se la coda ha tonus spostandolo verso l'alto con un dito. Un topo sano vi permetterà di mantenere la sua coda (la coda ha un tonus). Se clinica EAE è iniziata, il tonus coda sarà inferiore, visibile da un graduale calo della coda. Alla fine il mouse non sarà in grado di sollevare la coda a tutti.
- Posizionare ogni singolo mouse inclusi nell'esperimento EAE sul banco pulito e osservare e documentare il comportamento a piedi. Vedere tabella 115 per criteri di classificazione per la valutazione della severità di malattia (il Punteggio di EAE).
- Valutare e documentare il peso di ogni mouse inclusi nell'esperimento.
- Per garantire un'alimentazione adeguata e l'assorbimento d'acqua dai topi visualizzati da una clinica EAE Punteggio di 1 fornitura cibo inumidito in un piatto di plastica sul fondo della gabbia e aggiorna ogni giorno.
4. test di permeabilità In vivo
- Preparazioni di soluzioni:
- Per soluzioni di riserva di destrano, sciogliere 10 mg di 10 kDa destrano Alexa Fluor 488, nonché 3 kDa destrano Texas Red in 500 µ l di soluzione di sodio cloruro 0,9% (20 mg/mL).
- Per la soluzione di lavoro di destrano, appena prima di iniezione dispensare 55 µ l di 10 kDa destrano Alexa Fluor 488 stock (20 mg/mL) di soluzione su un pezzo di pellicola sigillante e 55 µ l di 3 kDa destrano soluzione stock di Texas Red (20 mg/mL). Mescolare e raccogliere 100 µ l in una siringa monouso bene (concentrazione finale 2 mg/100 µ l).
- Per la la soluzione 10% formaldeide (PFA), unire 10 g di PFA extra puro in polvere, 100 mL di PBS e 200 µ l di NaOH 1N in un becher di vetro pulito e calore fino a precisamente a 56 ° C sotto agitazione con un agitatore magnetico; tenere a 56 ° C per 30 min fino a quando il PFA è completamente disciolto; raffreddare a temperatura ambiente; regolare il pH a 7.4; e filtrare su un filtro di carta. Conservare a - 20 ° C. La soluzione di riserva può essere diluita ulteriormente utilizzando PBS.
- Poco anestetizzare topi C57BL/6 sani o topi C57BL/6 affetti da EAE con isoflurano (il mouse verrà sedato per circa 1 min). Utilizzare un sistema automatico come descritto al punto 2.2.1 (topi saranno esposto al 4,5% isoflurane in ossigeno in un'aula di induzione e poi trasferiti in una maschera facciale con isoflurano 2,1%).
- Posizionare il mouse anestetizzato in posizione laterale sul tavolo, poi per via endovenosa (per esempio retrò-orbitally) iniettare 100 µ l di traccianti fluorescenti il mouse prima che il mouse si sveglia.
- Immediatamente rimuovere la maschera facciale e assicurarsi che il mouse è completamente sveglio e motili dopo l'anestesia breve. Lasciate che il tracciante circolare per 15 min.
- Procedere con il passaggio 5.1.
5. perfusione dei topi
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Per la valutazione della permeabilità in vivo:
- Iniziare la procedura di 15 min dopo l'iniezione del tracciante fluorescente attraverso l'induzione di anestesia profonda isoflurano. Per indurre l'anestesia profonda nei topi utilizzare 2,3% di isoflurane in ossigeno. Utilizzare il riflesso di ritiro della zampa per giudicare la profondità dell'anestesia (pizzicare la pelle tra le dita; mancanza di flessione indica una profondità sufficiente) e sonda i riflessi dell'arto anteriore sia del hindlimb nei topi sottoposti a EAE.
- Difficoltà il mouse sul dorso e il ventre a spruzzo con etanolo. Aprire il torace con una forbice e rimuovere il diaframma. Aprire l'atrio destro del cuore pulsante utilizzando una forbice e irrorare il mouse attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 10 mL di PBS seguita da 10 mL di 4% PFA in PBS.
Attenzione: Per evitare di inalare PFA, irrorare il mouse in una cappa aspirante. - Passare alla sezione 6.
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Per in situ zymography:
- Inducono anestesia profonda isoflurano utilizzando isoflurano 2,3% in ossigeno in un mouse affetti da EAE e controllare la profondità dell'anestesia come descritto al punto 5.1.1.
- Successivamente, il mouse fix sul dorso e spruzzare la pancia con etanolo. Aprire il torace con una forbice e rimuovere il diaframma. Aprire l'atrio destro del cuore pulsante utilizzando una forbice e irrorare il mouse attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 20 mL di PBS.
- Passare alla sezione 6.
6. dissezione e congelamento dei cervelli
- Preparazione del bagno di raffreddamento:
- Riempire un contenitore dewar piano con ghiaccio secco tritato e aggiungere 2-metilbutano (isopentano) fino a quando il liquido raggiunge circa 1 cm sopra il pacco di ghiaccio secco. Coprire con un coperchio sciolto – ad es., copertina di un secchiello per il ghiaccio.
- Clip la testa del mouse irrorato con forbici affilate e rimuovere la pelle e le orecchie utilizzando un insieme ridotto di forbici.
- Accuratamente sezionare il skullcap tagliando dal forame magno verso la parte anteriore a sinistra e la destra permettendo di upfold il skullcap sopra il cervello. Quindi, sollevare delicatamente il cervello intatto dalla base del cranio mentre recidere i nervi ottici con una spatola metallica piana.
- Mettere il cervello di alluminio e tagliare il cervello in tre pezzi (frontale del cervello, cervello medio e cervelletto + tronco cerebrale) inserendo due tagli coronali.
- Riempire un cryomold (25 x 20 x 5 mm) per il primo trimestre con matrice di taglio (t.o.c.) temperatura ottimale, posizionare fette del cervello con il lato anteriore di ogni pezzo di cervello rivolto verso il basso verso il cryomold e ricoprire il tessuto completamente con t.o.c. matrice.
- Posizionare il cryomold con il tessuto in un orientamento orizzontale nel bagno 2-metilbutano e assicurarsi che il tessuto si blocca dal basso verso l'alto entro 1 minuto evitando il blocco intero tessuto di immersione nella vasca da bagno.
- Trasferimento di tessuto congelato a-80 ° C per la conservazione e procedere con la sezione 7.
7. preparazione di sezioni di tessuto congelato
- Equilibrare la temperatura dal tessuto congelato da-80 ° C a-20 ° C a criostato per 30 min.
- Rimuovere il blocco di tessuto dal cryomold e montare il titolare di tessuto del criostato (impostato a-15 ° C) utilizzando o.c.t. matrice.
- Tagliare i bordi del blocco del tessuto sul supporto del criostato con un bisturi affilato e iniziare a tagliare nel blocco tessuto rimuovendo 20 µm sezioni con il coltello del criostato, fino a quando il tessuto è visibile.
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Per l'analisi di permeabilità in vivo di BBB:
- Tagliare sezioni di tessuto di 6-10 µm, raccoglierli su vetrini per l'adesione e la immagine immediatamente le sezioni coperte con un vetrino coprioggetto utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Valutare l'aspetto dei vasi sanguigni nel cervello (prestare attenzione a forti confini dei vasi sanguigni che non perde rispetto a diffondere modelli di fluorescenza osservati per i vasi sanguigni che perde). Come controllo positivo, verificare la perdita dell'elemento tracciante nello stroma degli organi circumventricolari o plesso coroideo che mancano un BBB.
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Per in situ zymography:
- Tagliare 6 µm sezioni di tessuto usando un criostato, raccoglierli sulle lastre di vetro di adesione e congelare a-20 ° C in una scatola di congelamento contenente gel di silice nel coperchio le sezioni di tessuto.
8. in situ zymography combinato con laminina/CD45 immunofluorescenza
- Preparare soluzioni:
- Preparare la soluzione di incorporamento:
- Mescolare 6 g di glicerolo (grado analitico), 2,4 g di poli (alcole vinilico), 6 mL di ddH2O e 12 mL di tampone Tris di 0.2 M, pH 8 e mescolare (agitatore magnetico) la soluzione per 4 h a TA.
- Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga 50ml e lasciarlo riposare per 2 ore a TA. Successivamente Incubare la soluzione per 10 min a 50 ° C (bagnomaria) e centrifugare per 20 min a 2.700 x g a temperatura ambiente.
- Prendere il surnatante e congelare in aliquote a-20 ° C.
- Preparare la soluzione di gelatina fredda:
- Sciogliere 0,1 g di gelatina fredda dalla pelle bovina in 10 mL di ddH2O.
- Lasciate macerare per almeno 1 giorno e conservare le aliquote a 4 ° C.
- Preparare metanolo ghiacciato (-20 ° C):
- Mettere il 100% di metanolo in una vaschetta di Coplin e raffreddare fino a-20 ° C.
- Preparare la soluzione di riserva di 10% sodio azide:
- Aggiungere 1 g di sodio azide a 10 mL di ddH2O e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di lavoro di 0,1% sodio azide:
- Mix 99 µ l della ddH2O con 1 µ l di soluzione madre 10% sodio azide.
- Sciogliere 1 mg di fluorescina coniugata tintura-estiguuto (DQ) gelatina da pelle di maiale in 1 mL di sodio azide lavorando aliquote di µ l 100 soluzione e conservare al riparo dalla luce a 4 ° C.
- Sciogliere 30 mg di 1,10-fenantrolina monoidrato in 76 µ l di etanolo e conservare a-20 ° C.
- Preparare la soluzione di inibitore di proteasi: 25x:
- Aggiungere 1 compressa di inibitore di proteasi gratis EDTA a 2 mL di ddH2O. Conservare a-20 ° C.
- Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di reazione (150 µ l/sezione):
- Centrifugare la soluzione di gelatina DQ 1 mg/mL per 5 min a 13.300 x g.
- µ L di mix 127,2 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione (gelatinasi/collagenosi Assay Kit; Vedi Tabella materiali) 10x, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL, 1,5 µ l di gelatina DQ 1 mg/mL e 6 µ l di soluzione di inibitore di proteasi: 25x.
- Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di reazione di controllo negativo di fenantrolina (150 µ l/sezione):
- µ L di mix 125,2 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL, 1,5 µ l di gelatina DQ 1 mg/mL, 6 µ l di 25 x inibitore della proteasi EDTA gratis: 10x e 2 µ l di 2 M 1,10-fenantrolina (inibitore della MMP).
- Appena prima dell'uso, preparare la soluzione di gelatina fredda controllo negativo (non fluorescente) reazione (150 µ l/sezione):
- µ L di mix 128,7 di ddH2O, 15 µ l di tampone di reazione 10x, 0,3 µ l di gelatina fredda 20 mg/mL e 6 µ l di inibitore di proteasi 25x privo di EDTA.
- Preparare cocktail per colorazione di contrasto, ad esempio l'anticorpo primario, 0,95 µ g/mL policlonali di coniglio anti-laminina anticorpo e 10 µ g/mL ratto policlonale anti-CD45 anticorpo in 1% BSA in PBS e isotype appropriato controllo cocktail di anticorpo primario.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario, ad esempio, 7,5 µ g/mL Cy3 capra anti-ratto + 15 µ g/mL anti-coniglio AMCA in 1% BSA in PBS (proteggere dalla luce).
- Preparare la soluzione di incorporamento:
- Scongelare 6 sezioni di tessuto di cervello non fissa di µm da topi EAE all'interno della scatola di congelamento in plastica contenenti gel di silice del coperchio in una cappa per evitare la ritenzione di acqua al tessuto e separare le 2 sezioni di tessuto su un vetrino disegnando linee con una penna di idrorepellente
- Preparare soluzioni di reazione (misure 8.1.9-8.1.11), centrifugare per 5 min a 13.400 x g a temperatura ambiente e pre-riscaldare a 37 ° C, utilizzando un bagno d'acqua.
- Reidratare le sezioni di tessuto per 5 min a 37 ° C, utilizzando 1x tampone di reazione. Quindi, versare il 1x tampone di reazione, aggiungere la soluzione di reazione su sezioni di tessuto e incubare per 4 h a 37 ° C. Lavare i vetrini 5 volte in ddH2O.
- Difficoltà sezioni per 5 min con metanolo ghiacciato a-20 ° C e successivamente lavare sezioni una volta con PBS a temperatura ambiente.
- Aggiungere le sezioni BSA 1% in PBS e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (proteggere dalla luce). Poi, scartare 1% BSA in PBS dalle sezioni lanciando le diapositive sul tessuto, aggiungere cocktail di anticorpo primario e incubare per 1 h a temperatura ambiente (proteggere dalla luce).
- Lavare sezioni due volte con PBS, aggiungere cocktail di anticorpo secondario e incubare per 1 h a temperatura ambiente (proteggere dalla luce).
- Lavare sezioni due volte con PBS, montare i vetrini con l'incorporamento di soluzione, lasciare montate sezioni asciugare tutta la notte a temperatura ambiente (proteggere dalla luce). Infine, analizzare sezioni di tessuto macchiato usando un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Valutazione del decorso clinico di EAE in topi C57BL/6 dovrebbe risultare in una curva di malattia come raffigurato in Figura 2A e cambiamenti nel peso corporeo del mouse come presentato nella Figura 2B. C57BL/6 topi immunizzati con MOGaa35-55 solitamente iniziano a sviluppare i sintomi della malattia circa 10-12 giorno dopo immunizzazione attiva (Figura 1A). In genere, topi immunizzati mostrano un calo transitorio del peso corporeo il giorno dopo l'iniezione dell'emulsione e la prima dose di tossina della pertosse (Figura 1B). Dal giorno 2 dopo induzione di EAE, il peso corporeo di topi immunizzati poi aumenta gradualmente fino a quando inizia la malattia, quando il peso del corpo in genere scende un giorno prima dello sviluppo dei sintomi clinici e continua a diminuire correlare alla crescente sintomi della malattia (Figura 1A,B). La severità di malattia EAE aumenta fino al picco della malattia, che può essere previsto tra i giorni 16 e 20 dopo induzione di EAE (Figura 2A). Al culmine della clinica EAE, topi mostrano anche il peso corporeo più basso (Figura 2B), che aumenta in correlazione a miglioramento di EAE in fase di remissione della malattia (Figura 2A,B). Induzione di EAE in topi C57BL/6 mediante MOGaa35-55 risultati in una patologia di malattia cronica e topi in genere non completamente ripristinato (Figura 1A).
Figura 3A Mostra un'immagine rappresentativa del plesso coroidico e parenchima adiacente del cervello di un topo C57BL/6 affetti da EAE è stato iniettato per via endovenosa con fluorescente 3 kDa destrano (rosso) e 10 kDa destrano (verde) 15 min prima di sacrificare ; scala bar 50 µm. Come abbiamo in precedenza dimostrato, traccianti prontamente diffusa attraverso i microvasi fenestrati in stoma del plesso coroidico (foto di sinistra e centrale), mentre il BBB non permette la diffusione di elementi traccianti di circolazione nel parenchima cerebrale, indicato dalla linea tratteggiata (foto a destra), che è dunque privo di qualsiasi segnale fluorescente. Figura 3B Mostra rappresentativi vasi sanguigni che perde nel cervelletto di un mouse C57BL/6 affetti da EAE è stato iniettato per via endovenosa con fluorescente 3 kDa destrano (rosso) e 10 kDa destrano (verde) 15 min prima di sacrificare. Punte di freccia indicano elementi traccianti diffusi in tutto i cervello dei microvasi nel parenchima CNS (foto di sinistra e centrale), suggerendo che la funzione BBB è alterata in questi vasi. Nel parenchima del CNS, segnale fluorescente verde e rosso è visibile fuori delle pareti del vaso sanguigno, che sono indicate da linee tratteggiate. In EAE, nel cervelletto dove polsini infiammatorie vengono visualizzati gli elementi traccianti può anche essere trovato nello spazio perivascolare tra la membrana basale endoteliale e la limitans glia che indica perdita funzionale dell'integrità endoteliale BBB. Se il tracciante viene trovato per diffondere nel parenchima cerebrale, Mostra ulteriore disfunzione della barriera glial12.
La figura 4 Mostra immagini rappresentative dell'analisi delle attività della gelatinasi (MMP) in un cervello di EAE del mouse C57BL/6 fruiti dallo zymography in situ e localizzato ai compartimenti barriera specifiche del cervello di anti-padella-laminina (blu) e alla presenza di cellule infiammatorie di colorazione di immunofluorescenza anti-CD45 (rosso). Clivaggio proteolitico di tintura-estiguuto gelatina (DQ) unquenches un segnale della fluorescina, che permette la localizzazione di attività della gelatinasi sulla sezione del tessuto. Quando viene incubato per gelatina fredda (non fluorescente controllo), nessun verde segnale fluorescente può essere rilevato nelle sezioni del cervello dai topi EAE (riga superiore), così come nelle sezioni che sono state incubate con gelatina di DQ combinato con fenantrolina, un potente Zn +- agente complessante e inibitore MMP (riga centrale). Nella fila inferiore, l'attività della gelatinasi/MMP focale è visibile come segnale di fluorescenza verde brillante granulare tipica, come evidenziato dalle punte delle frecce. In manette infiammatorie nel cervelletto di un mouse EAE, specifiche attività MMP si verifica oltre il limitans glia (blu) in siti di infiltrazione delle cellule infiammatorie (rosso).
Figura 1 : Rappresentazione grafica dei siti di iniezione per l'induzione di EAE. 1) sito di iniezione per 30 µ l MOG-emulsione nel fianco destro, 2) iniezione per 30 µ l MOG-emulsione nel fianco sinistro, 3) iniezione per 20 µ l MOG-emulsione nella radice della coda sinistra, 4) iniezione per 30 µ l MOG-emulsione nella radice della coda destra sito di iniezione 5) per una piccola goccia di MOG-emulsione nel collo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Corso rappresentanza di EAE. (A) i sintomi della malattia di EAE in topi C57BL/6 nel corso del tempo. Media + /-SEM è mostrato. (B) variazione del peso corporeo durante EAE nel corso del tempo. Media + /-SEM è mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immagine rappresentativa della permeabilità in vivo. Immagine di sinistra (A): verde fluorescente 10 kDa dextrano a livello del plesso coroidico. Immagine centrale: rosso fluorescente 3 kDa dextrano a livello del plesso coroidico. Foto a destra: unire delle immagini sinistra e centrale. Scala bar 50 µm. (B) immagine di sinistra: verde fluorescente 10 kDa destrano nel cervelletto di topo. Immagine centrale: rosso fluorescente 3 kDa destrano nel cervelletto di topo. Foto a destra: Unione delle immagini sinistra e centrale. Le linee tratteggiate sono indicative per le pareti del vaso sanguigno; punte di freccia indicano traccianti fluorescenti nel parenchima del CNS. Scala bar 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Immagini rappresentative di in situ zymography. Prima colonna: verde fluorescente canale (inappagata segnale di tintura-estiguuto gelatina (DQ)). Seconda colonna: canale blu fluorescente (laminina). Terza colonna: canale rosso fluorescente (CD45). Quarta colonna: Unione dei canali fluorescente. Riga superiore: controllo negativo gelatina fredda (non fluorescenti). Riga centrale: controllo negativo fenantrolina (MMP-inibitore). Riga in basso: gelatina DQ. Scala bar 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Punteggio di 0 a 3 punti | criteri | variazione di peso |
| 0 | Nessun segno | peso normale |
| ~ | debole della coda (debole tonus) - inhouse criteri: non inclusa nel punteggio documentata | perdita di peso (indicativo per il 2 ° check) |
| 0,5 | coda di zoppicare (coda gocce) | perdita di peso |
| 1 | Hindleg debolezza, andatura instabile (mouse passeggiate sulla panchina come un'anatra) | perdita di peso |
| 2 | Hindleg paraplegia (mouse non si muove le zampe posteriori) | perdita di peso severa (indicativo per il 2 ° check) |
| 3 | Hindleg paraplegia, incontinenza perdita di controllo del corpo inferiore (Cascate del mouse a uno lato ma può muoversi nella gabbia usando ist anteriori + incontinenza; moribondo) | peso corporeo molto basso (indicativo per il 2 ° check) |
Tabella 1: Criteri di classificazione per la valutazione della severità di malattia EAE.
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Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per indurre e monitorare EAE in topi femminili C57BL/6. Le femmine sono preferenzialmente scelti, e c'è un'incidenza delle donne: gli uomini di 3:1 in MS. Per valutare la severità di EAE, abbiamo fatto uso di un foglio di Punteggio 3 punti. Gravità EAE è generalmente segnato per quanto riguarda la gravità delle disfunzioni motore. Topi con fasi avanzate di EAE, vale a dire che esibiscono un punteggio superiore a 2 dovrebbe essere sacrificata per evitare inutili sofferenze degli animali. Pertanto, si consiglia di segnare i topi a intervalli ravvicinati per esempio due volte al giorno come spiegato nel protocollo. Ci sono parecchi segnando routine impiegate, raggiungendo da 0-3 punti a 0-6 punti16,17,18,19 , o anche di più sottopunti20. Tuttavia, precedentemente abbiamo indicato che presumibilmente raffinato EAE segnando non porta ad alcun miglioramento nel determinare potenziali differenze statisticamente significative nei punteggi di malattia tra i gruppi, se si considera la complessiva di gravità di malattia15. Basato su questa osservazione, che abbiamo fatto uso della scala 3-punto per valutare la progressione di malattia in EAE al fine di ridurre il tempo di gestione del mouse e quindi, angoscia per l'attuazione delle regole di 3R di topi. Un altro punto critico, utilizzando il modello di EAE per studiare le differenze tra knockout e topi wild-type o differenze tra gruppi di trattamento sta allestendo una precisa pianificazione sperimentale. Topi wild-type sono rispetto ai topi knockout, è essenziale per confrontare littermates provenienti da accoppiamenti eterozigotici per garantire ambiti di provenienza genetici identici dei topi wild-type e knockoui rispetto all'esperimento di EAE. È anche importante mantenere le stesse condizioni per tutti i mouse inclusi in un esperimento, ad esempio modifiche di gabbia, la somministrazione di cibo umido e soprattutto il mouse (stato di salute) condizioni abitative. Per evitare fenomeni di gabbia specifica indotti dallo sperimentatore, Croce-immunizzazione deve essere eseguita. Più precisamente, se più di una siringa è necessaria per immunizzare un certo numero di topi, essi dovrebbero essere casualmente assegnati a diverse siringhe usate. Quest'ultimo allo stesso modo deve essere applicato per la realizzazione di studi di trattamento. Ultimo ma non meno importante, lo stato di salute dei topi ospitato in strutture per animali diversi potrebbe avere un impatto sulla gravità e incidenza della malattia e così più21 o meno di tubercolosi del micobatterio22 potrebbe essere necessaria per indurre una vera e propria clinica malattia. Inoltre, il sito di iniezione può influire sullo sviluppo di malattia. In questo protocollo si propone di iniettare volumi relativamente piccoli in cinque diversi siti sottocutanei: 30 µ l in due fianchi, 20 µ l nella radice della coda destra e sinistra e una piccola goccia nel collo. In altri protocolli, depositi di 50 µ l sono inseriti per via sottocutanea nella coda root solo23 o nei quattro fianchi21. Iniezioni di depositi più piccoli, tuttavia, ridurre al minimo il rischio di provocare irritazione della pelle, quali topi potrebbero tentare di zero.
Permeabilità in vivo potrebbe essere eseguita per determinare la perdita BBB durante EAE, ma anche per valutare se la delezione genetica specifica di una molecola o un trattamento farmacologico influisce sull'integrità BBB in vivo. Può trattarsi di trance o eseguite tramite la rilevazione di traccianti endogeno del plasma come depositi di IgG12 o esogeni che vengono applicate nella circolazione di un topo vivo24. In questo protocollo abbiamo fatto uso di due diversi traccianti esogeni (10 kDa destrano e 3 kDa) che sono stati iniettati contemporaneamente e ammessi a circolare per un tempo definito di 15 min utilizzando due elementi traccianti con diverse dimensioni permette di determinare la gravità della BBB disfunzione e può consentire di definire un valore soglia per le dimensioni dell'elemento tracciante che diffuse o non attraverso la Bee. Fluorescente destrani sono polisaccaridi idrofili caratterizzate da buona solubilità nell'acqua, bassa tossicità e relativamente bassa immunogenicità. Inoltre, destrani sono composte di poli-(α-D-1,6 glucosio), che sono resistenti alla fenditura di glicosidasi cellulare endogeno. Abbiamo usato qui varianti di dextrano contenenti residui di lisina inglobati il coniugato di destrano. Lysinated destrani sono aldeide risolvibile, che permette di fissare il tracciante nel tessuto. Oltre a fluorescente contrassegnati destrani, altri prodotti chimici possono essere utilizzati per valutare la permeabilità in vivo, per esempio, Hoechst dye in combinazione con blu di Evan, che associa ad una grande parte all'albumina sierica. I nuclei delle cellule endoteliali BBB fodera CNS microvasi macchie di Hoechst, e blu di Evan può essere rilevato nello spazio perivascolare su disfunzione BBB e diffonde ulteriormente quando il limitans glia è disturbato25,26. Al contrario, valutare la permeabilità in vivo dalla macchiatura immunofluorescente dei marcatori endogeni consente spaccato accumulo di, per esempio, molecole di IgG o fibrinogeno, una glicoproteina che circola nel sangue, nel corso del tempo. In buone condizioni di salute, lo spazio perivascolare è molto stretto e la membrana basale endoteliale e la limitans glia sono strettamente connessi e, quindi, visualizzare le due barriere di ECM la NVU richiede laminin isoforma specifica dell'anticorpo che macchia27 .
Molecole di IgG endogene sono presenti durante la salute e la malattia all'interno dei vasi sanguigni anche come nel tessuto degli organi circumventricolari, dove nessun BBB è stabilito12. Nel gene modificato topi con difetti di barriera del cervello, durante il trattamento farmacologico, o durante neuroinflammation molecole endogene che normalmente circolano nel sangue potrebbe essere depositato nel parenchima del CNS, che possa essere visualizzato da controcolorazione con anti-laminina anticorpi che riconoscono sia tutte le isoforme di laminina (pan-laminina anticorpi) o anticorpi isoforma-specifici di laminina permettendo di differenziare laminine, laminina α4 e α5 dal endoteliali della membrana dello scantinato e laminin α1 e α2 laminin da glia Limitans. Durante condizioni di neuroinfiammatorie lo spazio perivascolare potrebbe essere ampliato da infiltrazione di cellule immuni che permette di identificare sia, la membrana basale endoteliale e il glia limitans usando un anticorpo pan-laminina. Colorazione di contrasto delle laminine presenti presso il NVU permette di valutare se endogena ma anche esogeni traccianti sono depositati nel parenchima del CNS e colorazione di contrasto di CD45 consente di valutare se la perdita focale della BBB è associato con delle cellule immuni infiltrazione.
La migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS richiede l'attraversamento sequenza di due distinte barriere all'interno il NVU, il BBB endoteliale e successivamente il glia limitans28. Attraversando la glia limitans e voce di CNS delle cellule immuni correla con l'inizio della clinica EAE29, mentre CNS cellule di infiltrazione intrappolati in leptomeningeal e spazi perivascolari non attivano la clinica EAE. Intrappolamento delle cellule immuni negli spazi leptomeningeal e perivascolare tra membrane dello scantinato è stata osservata in diversi modelli di mouse gene-modificato per esempio L-selectina KO topi30, TNF knockout mice23, MMP2/MMP9 topi doppio knockout10 e di topi knockout Incep-B12. Questi sottolineatura di risultati che mancanza di queste molecole non pregiudica la migrazione delle cellule immuni attraverso la BBB ma piuttosto attraverso la limitans glia, sottolineando che i meccanismi molecolari che mediano la migrazione delle cellule immuni attraverso la BBB e la limitans glia sono distinti. Cervello in situ zymography è una metodologia per l'accertamento di attività della gelatinasi focale in una sezione di tessuto in correlazione spaziale precisa per patologia dello SNC. Rilevamento di permeabilità in vivo di BBB insieme eseguendo zymography in situ per rilevare attività di MMP2/MMP9 permette quindi di delineare endoteliali contro dispersione della barriera glia in correlazione con l'infiltrazione delle cellule immuni. Combinato con pan-laminina e CD45 immunofluorescenza che macchia su sezioni del cervello EAE, permette di localizzazione di attività della gelatinasi di unquenching DQ-gelatina e la localizzazione di infiltrazione di cellule immuni allo stesso tempo. Unquenching di fluorescina dai risultati di DQ-gelatina in un segnale di fluorescenza verde brillante granulare tipica, mentre raffazzonati aree scarsamente verde fluorescente su sezioni di tessuto devono essere considerati come segnali aspecifici12. Così, la valutazione attenta di sezioni di tessuto e controlli adeguati sono indispensabili quando si eseguono in situ zymography. In questo protocollo, abbiamo effettuato in situ zymography in combinazione con CD45 e laminin macchiatura. Gli anticorpi primari contro CD45 e laminin sono stati incubati come un mix allo stesso tempo. Allo stesso modo, gli anticorpi secondari sono stati incubati come un mix in una seconda fase di colorazione. Tale combinazione di anticorpi ha bisogno di test per garantire che gli anticorpi fase secondo vengono assorbiti contro altri IgGs per evitare la cross-reattività.
Presi insieme, i protocolli presentati qui forniscono strumenti per studiare in dettaglio quale elemento il NVU è alterata in neuroinfiammatorie condizioni di EAE. Valutazione della permeabilità in vivo di traccianti esogeni permette di identificare attuale compromissione dell'integrità delle cellule endoteliali microvascolari o corrente danno il nvu. Inoltre, introduzione di rivelatori con diverse dimensioni permette di stimare la gravità della compromissione di BBB. Ulteriori zymography in situ scopre attività focale della gelatinasi in astrociti e cellule potenzialmente infiammatorie, che è necessario per violare la limitans glia come un'ultima barriera prima di ottenere accesso al parenchima CNS10.
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Disclosures
Conflitti di interesse non dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine Lydia Sorokin, che ha condiviso il suo originale in situ zymography protocollo10 con noi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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