Summary
Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie), een onlangs geïdentificeerd, evolutionair geconserveerd structuur in de gewervelde ogen. Met behulp van zebravis larven, aantonen we technieken die nodig zijn ter specificatie van de factoren die aan de vorming en de sluiting van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie bijdragen).
Abstract
Aangeboren oogbeschadigingen en/of coloboma is een genetische aandoening die wordt meestal waargenomen als een gespleten in het inferieur aspect van het oog die voortvloeien uit onvolledige choroideus horizontalis sluiting. Onlangs, de identificatie van personen met coloboma in het superieure aspect van de iris, het netvlies, en de lens leidde tot de ontdekking van een nieuwe structuur, hierna aangeduid als de superieure horizontalis of superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS), die op de dorsale Transient aanwezig is aspect van de optiek cup tijdens de ontwikkeling van de gewervelde oog. Hoewel deze structuur is behouden over muizen, kuiken, vis en newt, is ons huidige begrip van de SOS beperkt. Om het verhelderen van factoren die aan de vorming en de sluiting bijdragen, is het absoluut noodzakelijk te kunnen observeren en identificeren van afwijkingen, zoals vertraging bij de sluiting van de SOS. Hier, uiteengezet we om een gestandaardiseerde reeks van protocollen die kan worden gebruikt voor het efficiënt visualiseren de SOS door het combineren van verkrijgbaar microscopie technieken met gemeenschappelijke moleculaire biologietechnieken zoals immunefluorescentie kleuring en mRNA te maken overexpressie. Terwijl deze set van protocollen richt zich op de mogelijkheid om te observeren SOS sluiting vertraging, is het aan te passen aan de behoeften van de experimentator en kan eenvoudig worden aangepast. Over het geheel genomen, wij hopen te maken van een toegankelijke methode waardoor ons begrip van de SOS kan worden gevorderd om uit te breiden van de huidige kennis van de ontwikkeling van de gewervelde oog.
Introduction
De vorming van de gewervelde oog is een zeer geconserveerde proces waarin zorgvuldig georkestreerde intercellulaire signaalroutes stellen weefseltypes (HLA) en regionale identiteit1opgeven. Verstoringen te vroege oog morfogenese resulteren in ernstige gebreken aan de architectuur van het oog en zijn vaak verblindende2. Een dergelijke ziekte het gevolg van het niet sluiten van de choroideus oogbeschadigingen en/of horizontalis in de ventrale zijde van de optische kop3. Deze aandoening, bekend als oogbeschadigingen en/of coloboma, is naar schatting voorkomen bij 1 op de 4-5000 levendgeborenen en oorzaak 3-11% van de pediatrische blindheid, vaak manifesteert als een sleutelgat-achtige structuur die ondeugdelijkheid van de leerling in het midden van de oog-4uitsteekt, 5,6. De functie van de choroideus horizontalis is bedoeld als een ingangspunt voor vroege therapieën groeien in de optiek beker, waarna de zijkanten van de horizontalis zal smelten om omsluiten de vaartuigen7.
Terwijl oogbeschadigingen en/of coloboma heeft gekend sinds de oudheid, hebben we onlangs geïdentificeerd een roman subset van coloboma patiënten met weefsel verlies beïnvloeden de superior/dorsale aspect van het oog. Recente werkzaamheden in ons lab heeft geleid tot de ontdekking van een oogbeschadigingen en/of structuur in de zebravis dorsale ogen, die wij de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS) of superieure horizontalis8 noemen. Het is belangrijk op te merken dat de structuur kenmerken van zowel een Sulcus (hersenanatomie) en een horizontalis heeft. Gelijkaardig aan een Sulcus (hersenanatomie), het is een voortdurende weefsel laag die van de nasale aan het temporele netvlies omvat. Bovendien, de sluiting van de structuur is niet gemedieerd door een fusie van de twee tegengestelde kelder membraan, en lijkt het een morfogenetische proces waarmee de structuur wordt bevolkt door cellen vereisen. Echter, vergelijkbaar met een horizontalis, vormt het een structuur die scheidt van de nasale en temporele zijkanten van het dorsale oog met het membraan van de kelder. Voor consistentie, zullen we in deze tekst verwijzen ernaar als de SOS.
De SOS is evolutionair bewaard over gewervelde dieren, wordt zichtbaar tijdens oog morfogenese in vis, kuiken, newt en muis8. In tegenstelling tot de choroideus horizontalis, die van 20-60 uur na bevruchting (hpf) in zebrafish aanwezig is, de SOS is zeer voorbijgaande aard, wezen van 20-23 hpf gemakkelijk zichtbaar en afwezig door 26 hpf8. Recent onderzoek in ons lab heeft gevonden dat, vergelijkbaar met de choroideus horizontalis, de SOS een rol in vasculaire begeleiding tijdens oog morfogenese8 speelt. Hoewel de factoren waarmee de vorming en de sluiting van de SOS nog niet volledig begrepen zijn, onze gegevens wijzen op rollen voor dorsal-ventrale oog genen8patronen.
Zebravis is een uitstekende modelorganisme te bestuderen van de SOS. Als een modelsysteem, het biedt een aantal voordelen bij het bestuderen van de ontwikkeling van het oog: het is een gewervelde model; elke generatie vertoont hoge vruchtbaarheid (~ 200 embryo's); de genoom heeft zijn gesequenced, die vergemakkelijkt genetische manipulatie; en ongeveer 70% van de menselijke genen hebben ten minste één zebrafish orthologue, waardoor het een ideale genetica gebaseerde model van ziekten bij de mens9,10. Bovenal zijn ontwikkeling plaatsvindt extern aan de moeder en haar larven zijn transparant, waardoor voor de visualisatie van het derde oog met relatief gemak11.
In deze set van protocollen beschrijven we de technieken waarmee de SOS kan worden gevisualiseerd in zebrafish larven. De verscheidenheid van visualisatietechnieken gebruikt in dit verslag kan duidelijk observatie van de SOS tijdens normaal oog ontwikkeling, alsmede de mogelijkheid om te detecteren SOS sluiting gebreken. Onze voorbeeld-protocollen zal onderzoeken van Gdf6 functie, een BMP gelokaliseerd op de dorsale oog en bekende regulator van SOS sluiting. Verder kunnen deze technieken worden gecombineerd met experimentele manipulaties om genetische factoren of farmacologische agenten die goede SOS vorming en sluiting beïnvloeden te identificeren. Daarnaast hebben wij een protocol waardoor de fluorescerende beeldvorming van alle celmembranen is mogelijk opgenomen waardoor de experimentator te observeren morfologische veranderingen aan de cellen rondom de SOS. Ons doel is om een verzameling gestandaardiseerde protocollen die kunnen worden gebruikt in de gehele wetenschappelijke gemeenschap te bieden van nieuwe inzichten in deze nieuwe structuur van het derde oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn door de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.
1. protocol 1: Visualisatie van SOS met behulp van stereomicroscopy en differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming
- Embryo's worden verzameld
- Bereiden in een tank van dechlorinated water, kruisen van gdf6a+/- zebrafish in de avond door het koppelen van een mannelijke zebrafish met een vrouwelijke zebravissen. Zorg ervoor dat het mannetje van het vrouwtje te scheiden met behulp van een verdeler om ervoor te zorgen dat de embryo's worden geboren binnen een kleine tijdreeks.
- De volgende ochtend de scheidingslijn te trekken en toestaan van de zebravis te kweken voor niet langer dan 30 min. verzamelen van de embryo's in petrischalen met E3 media, beschreven in The Zebrafish boek12, en plaats ze in een 28,5 ° C incubator.
- Verwijder onbevruchte eieren of dode embryo's, die witte en ondoorzichtig verschijnen zal.
- Voorbereiding en live-imaging van zebravis embryo 's
- Op 20 hpf, vervangen de E3 media met E3 media met 0.004% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) om te voorkomen dat pigment productie.
Opmerking: Toevoeging van FTU op een iets latere timepoint, zoals 22-24 hpf, is het onwaarschijnlijk te bemoeien met het experiment vanwege de jonge leeftijd van de embryo's op het moment van beeldvorming. Het wordt echter aanbevolen voor de behandeling van de embryo's vroeg om volledig te voorkomen dat pigmentatie omdat er een band van pigmentatie die wordt weergegeven in het dorsale oog, die met de beeldvorming van de SOS interfereren kan. - Ervoor zorgen dat alle embryo's bij de juiste ontwikkelingsstadia op verschillende punten in aanloop naar de tijd van waarneming. Het wordt aanbevolen dat dit in de stadia op welke Somiet nummer duidelijk zichtbaar gebeurt is zoals uiteengezet door Kimmel et al.13. Verwijderen die ontwikkelingsachterstand onvolwassen zijn.
- Plaats van de embryo's onder een Microscoop ontleden en dechorionate de embryo's door zachtjes trekken uit elkaar met behulp van de chorion fijne pincet. Visualiseer de SOS in het dorsale oog. De SOS kan worden weergegeven als een kuiltje op de dorsale marge van het oog en een lijn over het dorsale oog zichtbaar moet zijn. Voor normale SOS sluiting, het observeren van de embryo's op rond hpf 20-23. Voor behandeling van vertraagde SOS sluiting fenotypen, observeren de embryo's op 28 hpf of hoger.
- Sorteren van de embryo's die aantonen dat SOS sluiting vertraging van degenen die dat niet doen.
- Om de foto van deze embryo's met behulp van een Microscoop ontleden, bereiden een petrischaal met 1% agarose in E3. Licht prik het midden van het agarose om een ondiepe gat waarin de dooier van het embryo zitten kan wanneer het embryo wordt geplaatst op de agarose te maken. Dit zal ervoor zorgen dat het embryo niet onder een schuine hoek is wanneer wordt gefotografeerd.
- Anesthetize embryo's met 0.003% tricaïne in E3 en lateraal op de agarose.
- Om het beeld van de embryo's met behulp van een samengestelde of confocal microscoop, breng het embryo in 35 mm petrischaal met een kleine bolus van niet-gegeleerde 1% laag-melting point agarose in E3 (w/v). Snel plaats het embryo lateraal met behulp van een prima vislijn of een wimper en wachten op de agarose om te koelen. Zodra de agarose stevig is, giet genoeg E3 in de schotel ter dekking van het agarose. Zie voor meer details, Distel en Köster14.
Opmerking: Als een omgekeerde microscope, het embryo kan worden geplaatst tegen het glas van een glas-dekglaasje aan onderkant schotel en beeld met een standaard 20 X objectieve lens. - Gebruik een water onderdompeling 20 x objectief te visualiseren de SOS met een samengestelde microscoop. Na visualization, zachtjes trekken de agarose van de embryo's en in 4% paraformaldehyde (PFA) worden opgelost of kunnen doorgaan met hun ontwikkeling.
- Op 20 hpf, vervangen de E3 media met E3 media met 0.004% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) om te voorkomen dat pigment productie.
2. protocol 2: Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin
- Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin: dag 1
- Dechorionate embryo's zoals beschreven in stap 1.2.3, indien nog niet verricht. Embryo's vast in een microcentrifuge-buis op de gewenste timepoint in versgemaakte 4% PFA gedurende 2 uur op een shaker kamertemperatuur (22-25 ° C). Wassen in 1 x PBST voor 5 min, vier keer.
Opmerking: Na gastrulatie, embryo's kunnen vaststellen beter na dechorionation. - Permeabilize van embryo's in 10 mg/mL proteïnase K bij kamertemperatuur voor 5 min. incubatietijd hangt af van het ontwikkelingsstadium waartegen de embryo's worden opgelost (Zie Thisse en Thisse15).
- Wassen in 1 x PBST voor 5 min, vier keer.
- Blokkeren van embryo's in een oplossing van 5% geit serum en 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) in 1xPBST voor 1-2 h op een kamertemperatuur shaker.
- Bereid primair antilichaam-oplossing door het konijn anti-laminin antistof in blok oplossing bij een verdunning 1:200 te verdunnen.
- De embryo's anti-laminin primair antilichaam 's nachts op een shaker 4 ° C te incuberen.
- Dechorionate embryo's zoals beschreven in stap 1.2.3, indien nog niet verricht. Embryo's vast in een microcentrifuge-buis op de gewenste timepoint in versgemaakte 4% PFA gedurende 2 uur op een shaker kamertemperatuur (22-25 ° C). Wassen in 1 x PBST voor 5 min, vier keer.
- Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin: dag 2
- Wassen in 1 x PBST voor 15 min, vijf keer.
- Bereid secundair antilichaam-oplossing door het verdunnen van geit anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaam in 1 x PBST met een verdunning van 1:1000.
Opmerking: Het is mogelijk om te passen deze stap te passen aan de beschikbare middelen aan de experimentator met behulp van een verschillende secundair antilichaam. - De embryo's secundair antilichaam 's nachts op een shaker 4 ° C te incuberen. Beschermen tegen licht zoveel mogelijk van deze stap verder.
- Wassen in 1 x PBST voor 15 min, vier keer. De embryo's kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een week, indien nodig.
- Dissectie en de montage van embryonale ogen
- Indien gewenst, plaatst u de embryo's in een kleine petrischaal en deyolk van de embryo's in 1 x PBST. Dit doen door voorzichtig verstoren de dooier met een fijne Tang en het verwijderen van de cellen van de dooier door het milde schrapen van de dooierzak.
- Voorbereiding van de volgende concentraties van PBS-glycerol reeks oplossingen in microcentrifuge buizen: 30%, 50% en 70% glycerol in PBS. Pipetteer embryo's in 30% glycerol/PBS, ervoor zorgend om de plaats van de embryo's op de top van de oplossing en de overdracht van zo weinig van de vorige oplossing mogelijk. Wacht totdat de embryo's te zinken naar de bodem van de buis.
- Embryo's hebben naar de bodem gezonken, kunt u deze overbrengen naar 50% glycerol/PBS. Herhaal en transfer naar 70% glycerol/PBS.
- Zodra de embryo's in 70% glycerol/PBS gezonken, verplaatst naar een kleine kunststof schotel voor ontledingen.
- Verbreken van het embryo posterieure aan de hindbrain, en gebruik het posterieure weefsel voor genotypering, indien nodig.
- Verplaats het hoofd naar een glasplaatje, overbrengen als weinig glycerol mogelijk. Gebruik pincet of andere fijne dissectie tools aan het achterste uiteinde op houd het hoofd stationaire vasthouden. Gebruik fijn minutien pin-code of andere fijne dissectie tools zachtjes invoegen in de ventrikel reukkolf van de anterieure en duw naar beneden naar de rechter en linker helften van het hoofd van elkaar scheiden. Herhaal dit tijdens het verplaatsen posteriorly door de veroorzaakt en in de hindbrain ventrikel, in wezen fileting het hoofd naar beneden de middellijn. Dit minimaliseert de manuele manipulatie van het oog en het omringende weefsel, waardoor de SOS onbeschadigd.
- Elke zijde van het hoofd middellijn naar beneden, oog opstapelen. Positie vier palen vacuüm vet op de hoeken (een juiste afstand van elkaar voor het dekglaasje aan wordt gebruikt) en dek af met een dekglaasje glas aan, omlaag drukken opeenvolgend op elke post tot het dekglaasje aan contact maakt met de monsters. Pipetteer 70% glycerol aan de rand van het dekglaasje aan zodat de glycerol wordt getrokken onder, de ruimte tussen het dekglaasje aan en de dia te vullen.
- De monsters van de afbeelding binnen een dag, of afdichting rond het dekglaasje aan met nagellak en beeld monsters pas na de nagellak is opgedroogd. Opslaan in het donker bij 4 ° C.
3. protocol 3: Visualisatie van gebruik van SOS eGFP-CAAX mRNA
- Synthese van eGFP-CAAX mRNA
- Linearize pCS2-eGFP-CAAX plasmide16 met kennisgevingen in een volume van de reactie van 40 mL 1 mg gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Om te stoppen met de beperking digest reactie, voeg 10 mL RNase-gratis water, 2,5 mL 10% SDS en 2,0 mL 10 mg/mL proteïnase K.
- Incubeer 1 uur bij 50 ° C.
- Voeg het volgende toe de reactie (total volume 200 mL) en gaat u verder met de volgende stap: 50 mL RNase-gratis water, 20 mL 3 M natrium acetaat pH 5.2 en 75,5 mL RNase-gratis water
NOTE: RNase-gratis water is toegevoegd in twee afzonderlijke gelegenheden om te voorkomen dat buitensporige verdunning van de Natriumacetaat.
- Zuivering van DNA door middel van fenol/chloroform extractie en ethanol neerslag
- Voeg 200 mL fenol: chloroform: Isoamylalcohol en vortex om 20 s. aparte de waterige en biologische fasen door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 5 minuten.
- De bovenste laag van waterige overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-buis, ervoor zorgend om te voorkomen dat de overdracht van de organische onderlaag. Voeg een gelijk volume chloroform aan de nieuwe buis.
Opmerking: Toevoeging van chloroform is optioneel, maar het is aangeraden om te zorgen voor volledige verwijdering van fenol uit het monster. - Vortex om 20 s. aparte de waterige en biologische fasen door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 5 minuten.
- Als voorheen, overbrengen in de bovenste laag van waterige een nieuwe microcentrifuge-buis, ervoor zorgend om te voorkomen dat de overdracht van de organische onderlaag.
- Het toevoegen van 1/10 volume van 3 M natrium acetaat pH 5.2.
- Neerslag van DNA door toevoeging van 3 volumes van 100% RNase-vrije ethanol en chill bij-20 ° C gedurende 15 min. Centrifuge bij 18.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Een pellet moet worden weergegeven. Giet het supernatant.
- Wassen van de pellet met 100 mL koud water van 70%-ethanol/RNase-gratis. Na het mengen zachtjes te breken de pellet losse, centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Een pellet moet worden weergegeven. Giet het supernatant.
- De pellet gedurende 5 minuten drogen en resuspendeer de DNA in 7 mL water.
Opmerking: De pellet wellicht langer dan 5 minuten afhankelijk van de luchtstroom beschikbaar worden gedroogd.
- Transcriptie en zuivering van eGFP-CAAX mRNA
- RNase-vrije wijze, door een reactie van transcriptie in vitro met een commercieel beschikbare Sp6 RNA polymerase kit, met ongeveer 1 mg van gezuiverde gelineariseerde plasmide DNA verkregen in stap 3.2 te bereiden. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Sp6 RNA polymerase moet worden gebruikt voor de productie van afgetopte mRNA. - Voeg 1 mL DNase (2 U/mL; RNase gratis) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Zuiveren de mRNA met alle verkrijgbare RNA zuivering kit. Aliquot de mRNA voorkomen herhaalde bevriezen-ontdooien en opslaan bij-80 ° C.
- RNase-vrije wijze, door een reactie van transcriptie in vitro met een commercieel beschikbare Sp6 RNA polymerase kit, met ongeveer 1 mg van gezuiverde gelineariseerde plasmide DNA verkregen in stap 3.2 te bereiden. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Injectie en visualisatie
- Verkrijgen embryo's zoals beschreven in het Protocol 1.1.
- Met behulp van een apparaat van microinjection, injecteren 300 pg van eGFP-CAAX mRNA in het stadium 1-cel.
- Scherm voor embryo's met de heldere expressie van eGFP in de ogen met behulp van een stereoscoop fluorescentie.
- Het imago van de embryo's zoals beschreven in het Protocol 1.2.
- U kunt ook dechorionate en monteren van de embryo's op de gewenste timepoint in 4% PFA voor 4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4° C. Wassen de embryo's in 1 x PBST voor 5 min, viermaal en dechorionate, indien niet eerder gedaan. Ontleden van de ogen en bevestig ze op dia's zoals beschreven in punt 2.3 van Protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De zebravis SOS verschijnt op 20 hpf in de vermoedelijke dorsale netvlies8. Door 23 hpf de SOS overgang van de eerste smalle architectuur naar een breed inspringing en 26 hpf het is niet langer zichtbaar8. Daarom moeten de embryo's te onderzoeken de SOS tijdens de ontwikkeling van de ogen van de normale zebrafish, in acht te worden genomen tussen hpf 20-23. Tijdens deze periode is de SOS waarneembare via de ontleden Microscoop en DIC imaging aangeduid met een dunne lijn in het dorsale oog dat scheidt van de nasale en temporele helften van het ontwikkelende netvlies (Figuur 1). Daarnaast is een subtiele inspringen mogelijk zichtbaar in de dorsale grens van het oog (Figuur 1). Na immunefluorescentie kleuring van laminin, de dunne lijn kan worden bevestigd als de kelder membraan (Figuur 1).
Onderzoek naar moleculaire pathways resulterend in vertraagde SOS sluiting, kozen we om het observeren van de embryo's op 28 hpf als dit is een timepoint dat voldoende wordt verwijderd uit de tijd van normale SOS sluiting en is dus een betrouwbare marker van SOS sluiting vertraging te wijten aan experimentele manipulaties. Door rechtstreekse visualisatie van 28 hpf zebrafish onder de Microscoop ontleden is het mogelijk om te evalueren van SOS sluiting vertraging te wijten aan experimentele manipulatie. Bij SOS sluiting is vertraagd, kan zijn langdurige aanwezigheid worden gezien als een uitgesproken gespleten in de dorsale zijde van het oog onder de ontleden Microscoop (Figuur 2). Wanneer waargenomen onder de samengestelde microscoop met behulp van DIC of Nomarski optica, deze functie is nog belangrijker, en de nasale en temporele zijkanten van het oog worden gescheiden door de SOS, die is duidelijk zichtbaar als een lijn in het dorsale oog (Figuur 3).
De SOS is bekleed met basale lamina componenten, met inbegrip van laminin. Daarom biedt immunefluorescentie kleuring een aanvullende methode SOS sluiting in vaste embryo's te evalueren. Wanneer imaging het embryonale oog van een laterale weergave, de basale lamina kadert de buitenmarge van het oog, zowel oogbeschadigingen en/of scheuren, en de grens tussen de lens en het netvlies (Figuur 4). De SOS is gericht rechtstreeks tegenover de choroideus horizontalis in het dorsale aspect van het oog. Hele embryo's kunnen lateraal, met enigszins beter optische helderheid bereikt als ogen eerder microdissected zijn worden gemonteerd. Door 28 hpf, in wildtype zebrafish, laminin kleuring toont duidelijk aan dat de SOS volledig is gesloten, waardoor dit het ideale podium voor het toezicht op vertragingen in horizontalis sluiting.
Injectie van eGFP-CAAX mRNA kunt visualisatie van de celmembranen van een live of vaste embryo (Figuur 5). Succesvolle één-cel fase injectie is voldoende voor de productie van embryo's met volledige celmembraan fluorescentie. In de laterale weergave alle cellulaire grenzen moeten worden gemarkeerd door GFP fluorescentie, en als zodanig ook duidelijk de morfologie van de cel wordt waargenomen. Hierdoor is de visualisatie van de morfologische veranderingen aan de cellen die tot sluiting van de SOS leiden.
Figuur 1: observatie van SOS tijdens de ontwikkeling van de ogen van de normale zebrafish. Zebravis embryo's zijn verzameld en beeld op 22 hpf. A-B. Laterale weergave van 22 hpf embryo's live-image gemaakt met het ontleden Microscoop (A) en via DIC imaging (B), respectievelijk. De SOS is gemarkeerd met een rood sterretje. C. Laminin kleuring immunefluorescentie van een 22 hpf embryo. Embryo's werden vastgesteld in 4% PFA en verkregen voor het geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin. De embryo's waren fileted en gemonteerd in 70% glycerol/PBS. Enkel sneetje beelden werden verkregen door middel van de confocal beeldbewerking met een software. De SOS is gemarkeerd met een wit sterretje. Alle cijfers waren geannoteerde en geassembleerd met behulp van Adobe Illustrator-software. Schaal staven 50 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Ontrafeling van Microscoop beelden van SOS sluiting vertraging in zebrafish larven. Wildtype en gdf6a- / - embryo's zijn verzameld en live-beeld op 28 hpf. A. laterale weergave van een embryo van wildtype met een gesloten SOS. B. zijdelingse weergave van een gdf6a- / - embryo met een SOS sluiting vertraging (sterretje). Een scherpe depressie is waarneembaar in het dorsale aspect van het oog door het mislukken van de SOS te sluiten op de juiste manier. Schaal staven 50 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger DIC beelden van de SOS in de zebravis embryonale oog. Wildtype en gdf6a- / - embryo's zijn verzameld, verdoofd en lateraal in 1% Ultrapure laag-melting point agarose in E3 op een 35 mm petrischaal geplaatst. De schotel was gevuld met E3, en een samengestelde microscoop met een 20 x water dompelen doelstelling werd gebruikt voor DIC imaging. A. laterale weergave van een embryo van wildtype met een gesloten SOS. B. zijdelingse weergave van een gdf6a- / - embryo met een SOS sluiting vertraging (sterretje). De SOS is waarneembare aangeduid met een dunne lijn in het dorsale aspect van het oog. Schaal staven 50 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve beelden van laminin immunefluorescentie kleuring in embryonale zebrafish oog. Wildtype en gdf6a- / - embryo's zijn verzameld en vaste in de 4% PFA op 28 hpf. De basale lamina was immunostained, en de embryo's waren fileted en gemonteerd in 70% glycerol/PBS voor confocal imaging. Enkel sneetje beelden werden verkregen met behulp van ZEN software. A. laterale weergave van een embryo van wildtype met een gesloten SOS. B. zijdelingse weergave van een gdf6a- / - embryo met een SOS sluiting vertraging (sterretje). De basale lamina wordt weergegeven waarin het oog in het groen, met de SOS zichtbaar in het dorsale deel van het oog in gdf6a- / - embryo's. Schaal staven 50 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: beeldvorming van de zebravis embryonale oog na injectie van eGFP-caax mRNA. Wildtype embryo's werden ingespoten met 300 pg van eGFP-caax mRNA stadium 1-cel. Op 22 hpf en 28 hpf, respectievelijk, de embryo's waren verdoofd en lateraal gemonteerd in 1% Ultrapure laag-melting point agarose in E3 op een 35 mm petrischaal. Een confocal microscoop met een 20 x water dompelen doelstelling werd gebruikt voor beeldvorming, en enkel sneetje beelden werden verkregen met behulp van een software. A. zijdelingse weergave van een gdf6a- / - embryo op 22 hpf met een zichtbaar open SOS (sterretje). B. uitgebreid panelen van een gdf6a- / - embryo op 22 hpf. C. laterale weergave van een gdf6a- / - embryo op 28 hpf met de sluiting van een SOS vertragen. D. uitgebreid panelen van een gdf6a- / - embryo op 28 hpf. Schaal staven 50 mm en 10 mm panelen A en C, en B en D, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de SOS in het zich ontwikkelende embryo zebrafish. Om te bepalen sluiting vertraging fenotypen, hebben onze protocollen gericht op de mogelijkheid om te onderscheiden van de scheiding van twee discrete kwabben van de dorsale-nasale en dorsale-temporele zijden van het oog, vergelijkbaar met de technieken die worden gebruikt om te visualiseren choroideus horizontalis sluiting vertraging fenotypen in het ventrale oog.
Deze visualisatietechnieken kunnen worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid van genetische manipulatie technieken te bestuderen van de gevolgen van remmen of induceren expressie van bepaalde genen aan het bestuderen van hun rol in de sluiting van de SOS. Wij hebben besloten om aan te tonen van deze protocollen gebruik van gdf6a- / - embryo's, zoals wij eerder hebben aangetoond dat de nederlaag kan invloed hebben op juiste sluiting van de SOS, maar de protocollen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van het manipuleren van de expressie van elk gen als Vereist. Het wordt aanbevolen dat morfologische wijzigingen in het dorsale oog preliminair met opmerkingen met behulp van de Microscoop van ontleden worden bestudeerd. De andere technieken moeten worden gebruikt zodra een eerste link is definitief vastgesteld zoals ze meer tijdrovend en lagere doorvoer zijn.
Terwijl de protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de experimentator, zijn er verschillende aspecten die moeten zorgvuldig worden gevolgd. Vanwege de voorbijgaande aard van deze structuur is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat alle waargenomen embryo's zijn het hetzelfde ontwikkelingsstadium. Voor ons werk vinden wij het belangrijk dat slechts een klein venster van tijd fokken en periodiek het sorteren van de embryo's in de hele vroege ontwikkeling. De meest belangrijke stap van de fasen gelijk is aan 20 hpf, wanneer u nog steeds nauwkeurig somieten (24)17kan rekenen, en wij vinden dat veel betrouwbaarder dan de tijdelijke kenmerken die tijdstip 28 bakenen hpf. Pigmentatie moet bovendien worden geremd of verwijderd zodat succesvolle visualisatie van de structuur. Wij hebben geconstateerd dat het pigment in het oog wordt gestart rond 22 hpf, en er is een patroon van pigment in de dorsale oog dat met de goede visualisatie van de SOS interfereren kan. Daarom is het sterk aanbevolen voor de behandeling van de embryo's met FTU vóór pigmentatie om succesvolle visualisatie. Bovendien, vereist dissectie van de embryonale oog vóór dia montage zonder schade enige oefening. Het is ook noodzakelijk te lateraal monteren de ogen zo parallel mogelijk met de dia. Het wordt aanbevolen dat de experimentator deze technieken met extra embryo's voorafgaand aan het experiment praktijken.
Met uitzondering van de immunefluorescentie kleuring van de basale lamina, kan alle hier beschreven protocollen worden uitgevoerd met behulp van levende embryo's. Hierdoor voortdurende visualisatie van de SOS hele vroege embryogenese, waardoor de experimentator time-lapse studies van de morfologische veranderingen die betrokken zijn bij de sluiting van de SOS te verrichten. In het verleden hebben wij gebruikt netvlies-specifieke transgenen, zoals Tg(rx3:eGFP), die het neurale netvlies tijdens de vroege ontwikkeling. markeert Hoewel het ontbreekt de mogelijkheid om het visualiseren van celmembranen, is het gebruik van Tg(rx3:eGFP) heeft het voordeel dat geen microinjections wordt verlangd en onze primaire methode van visualiseren van bruto morfologische veranderingen naar SOS architectuur in real-time. Dat protocol heeft niet opgenomen hier, zoals soortgelijke methoden eerder in dit dagboek18,19 besproken zijn. Onderzoek naar de biologische basis van de cel van SOS vorming en sluiting vergt echter fluorescerende membraaneiwitten. In het bijzonder kunt de injectie van eGFP-CAAX mRNA visualisatie van de celmembranen rond de SOS zoals te zien in figuur 5, die ons toelaat om te bestuderen van de dynamiek van de cel vorm veranderingen in het dorsale oog die vereist voor goede SOS sluiting zijn. Terwijl eGFP-CAAX kan bruikbaar zijn voor het uitvoeren van live-imaging van SOS sluiting, wordt het bemoeilijkt door de aanwezigheid van de omhullende laag in zebrafish. Bovendien moet worden gezorgd bij het analyseren van de resultaten van mRNA injecties omdat het mozaïcisme, waardoor het moeilijk te vergelijken direct embryo's die zijn gebaseerd op kwantificering van eGFP expressie sterkte kan opleveren. Dit kan worden verbeterd door het gebruik van transgene zebrafish lijnen die fluorescently label celmembranen specifiek in de ontwikkelingslanden retina, zoals Tg(vsx2.2:GFP-caax).
Een van de uitdagingen van onze protocollen ligt bij een behandeling die niet volledig penetrant. We hebben eerder gemerkt dat SOS vertragingen kunnen worden gezien in ongeveer 10% van de embryo's de controle op 28 hpf8, en deze onderliggende aanwezigheid van embryo's met een SOS binnen een bepaalde experimentele groep het moeilijk maken kon te observeren subtiele effecten van experimentele manipulatie. Dit kan worden aangepakt door verblindende de experimentator ter vermindering van de experimentator bias en door het verhogen van het aantal embryo's die binnen elke experimentele groep gebruikt om de macht van het experiment te vergroten. Het stadium van analyse kan bovendien worden verschoven naar 29-30 hpf.
Met deze set van protocollen die wij willen standaardiseren van de manier waarmee SOS sluiting vertragingen worden gevisualiseerd. De technieken die hierboven beschreven is gebleken in het opsporen en visualiseren van SOS sluiting vertragingen in een verscheidenheid van experimentele instellingen betrouwbaar en zijn aanpasbaar aan de behoeften van de experimentator. Terwijl wij zijn gewend dat technieken zoals scanning elektronen microscopie of time-lapse beeldvorming van transgene embryo's visualiseren de SOS uitvoeriger, is ons doel hier om een gestandaardiseerde set van protocollen die vatbaar voor high-throughput experimentele zijn te maken ontwerpen te visualiseren van een groot aantal embryo's in één dag met nadruk op het vermogen te scoren sluiting vertraging fenotypen. Naast het gebruik ervan met gdf6a- / - embryo's, heeft men kunnen waarnemen van SOS sluiting vertraging fenotypen met behulp van deze visualisatietechnieken naast farmacologische behandelingen, morfolino injecties en RNA overexpressie studies. Zoals de rol van de SOS in oog ontwikkeling is opgehelderd verder via verschillende middelen, wij hopen dat deze gestandaardiseerde set van protocollen bieden de wetenschappelijke gemeenschap een gemeenschappelijke taal waarmee deze nieuwe structuur wordt bestudeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), natuurwetenschappen en techniek onderzoek Raad (NSERC), Alberta innoveert technologie Futures, en vrouwen en Children's Health Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
