Summary
Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов для наблюдения за Улучшенный глазной борозды, недавно выявленных, эволюционно сохраняется структура в позвоночных глаз. С помощью данио рерио личинки, мы демонстрируем методов, необходимых для выявления факторов, влияющих на формирование и закрытие Улучшенный глазной борозды.
Abstract
Врожденная колобома глазной это генетическое нарушение, которое обычно наблюдается как расщелина в нижней аспект глаза результате неполной сосудистое трещина закрытия. Недавно выявление лиц с колобома в Улучшенный аспекте Ирис, сетчатке и объектив, привели к открытию новой структуры, называется Улучшенный трещина или Улучшенный глазной борозды (SOS), который временно присутствует на дорсальной аспект глазного бокала во время развития позвоночных глаз. Хотя эта структура сохраняется через мышей, цыпленок, рыбы и Тритон, нашего нынешнего понимания особенностей SOS ограничен. Для того, чтобы разъяснить факторы влияющие на его формирование и закрытия, крайне важно, чтобы иметь возможность наблюдать это и выявления аномалий, таких, как задержки в закрытии SOS. Здесь мы намереваемся создать серию стандартизированных протоколов, которые могут быть использованы эффективно визуализировать SOS путем объединения методов широко доступны микроскопии с общие методы молекулярной биологии как immunofluorescent окрашивание и мРНК Гиперэкспрессия. Хотя этот набор протоколов фокусируется на способность наблюдать за задержку закрытия SOS, он адаптируется к потребностям экспериментатора и могут быть легко изменены. В целом мы надеемся создать доступный метод, через который наше понимание SOS можно дополнительно расширить текущий набор знаний развития позвоночных глаз.
Introduction
Формирование позвоночных глаз является весьма сохранены процесс в котором тщательно спланированных межклеточной сигнализации пути установить типы тканей и указать региональной идентичности1. Возмущений в начале глаз морфогенеза приводят к глубокие дефекты в архитектуре глаза и часто слепоте2. Один из таких заболеваний результаты от неспособности закрыть сосудистое глазной щели в брюшной части глазного бокала3. Это расстройство, известный как глазные колобома, оценивается в 1 из 4-5000 живорожденных и причиной детской слепоты, часто проявляется как замочной скважины как структура, которая выступала книзу от ученика в центре глаза4, 3-11% 5,6. Функцию сосудистого трещина является предоставляют точку входа для раннего сосудистую, врастают в глазного бокала, после чего стороны трещины будет предохранитель подложить судов7.
В то время как глазные колобома был известен с древних времен, мы определили недавно подмножество Роман колобома пациентов с потерей ткани, затрагивающих Улучшенный/спинной части глаза. Последние работы в нашей лаборатории привела к открытию глазной структуры в спинной глаза данио рерио, который мы называем Улучшенный глазной борозды (SOS) или Улучшенный трещина8. Важно отметить, что структура имеет характеристики борозды и фиссур. Подобно борозды, это постоянное ткани слой, который охватывает от носа до височной сетчатки. Кроме того закрытие структуры не опосредовано слияние двух противоположных базальной мембраны, и она, как представляется, требуют морфогенетических процесс, в котором структура заполняется клетками. Однако подобно трещина, он образует структуру, которая отделяет носовой и височной стороны спинной глаз с базальной мембраны. Для обеспечения согласованности мы будет ссылаться на него как SOS в этом тексте.
SOS эволюционно сохраняется через позвоночных, будучи видимыми в ходе морфогенеза глаз рыбы, куриных, Тритон и мыши8. В отличие от сосудистое трещина, которая присутствует от 20-60 часов после оплодотворения (hpf) в данио рерио, SOS весьма преходящими, будучи легко видны с 20-23 hpf и отсутствует 26 hpf8. Недавние исследования в нашей лаборатории обнаружил, что, подобно сосудистое трещина, SOS играет роль в сосудистой руководство во время глаз морфогенеза8. Хотя факторы, определяющие формирование и закрытие SOS еще полностью не поняты, наши данные выделить ролей для глаз спинной вентральный кучность генов8.
Данио рерио — организм отличную модель для изучения SOS. Как модель системы, он обеспечивает ряд преимуществ при изучении глаз развития: это позвоночных модель; Каждое поколение проявляет высокую плодовитость (~ 200 эмбрионов); полностью виртуализированных его генома, который облегчает генетические манипуляции; и примерно 70% генов человека имеют по крайней мере один orthologue данио рерио, что делает его идеальным модель на основе генетики человека болезни9,10. Самое главное ее развитие происходит извне для матери, и его личинки являются прозрачными, что позволяет для визуализации развивающихся глаза с относительной легкостью11.
В этом наборе протоколов мы описываем методы, через которые SOS могут быть визуализированы в zebrafish личинки. Разнообразие методов визуализации, используемые в настоящем докладе позволит четкое наблюдение SOS во время разработки нормальный глаз, а также способность обнаруживать SOS закрытия дефектов. Наш пример протоколы будут представлены исследования Gdf6, BMP локализованные в спинной глаз и известных регулятор SOS закрытия. Кроме того эти методы могут быть объединены с экспериментальных манипуляций для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на формирование надлежащего SOS и закрытия. Кроме того мы включили протокол, посредством которого возможна флуоресцентных изображений всех клеточных мембран, позволяя экспериментатор соблюдать морфологические изменения клеток, окружающих SOS. Наша цель – создать набор стандартизованных протоколов, которые могут использоваться на протяжении всего научного сообщества предложить новые идеи в этот роман структуры развивающихся глаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены в университете Альберта животное уход и использование Комитета.
1. Протокол 1: Визуализация SOS, используя стереомикроскопия и дифференциальной помехи изображения контрастность (DIC)
- Эмбрион коллекция
- В баке дехлорируемым воды Подготовьте кресты gdf6a+ / данио рерио вечером, задавая мужчины данио рерио с женской данио рерио. Убедитесь в том отделить мужчин от женского, используя разделитель для обеспечения что эмбрионы рождаются в пределах небольшой диапазон времени.
- Следующим утром, потяните делителя и позволяют данио рерио породы для больше чем 30 мин собирать эмбрионов в чашках Петри с E3 медиа, описанные в данио рерио книга12и поместите их в инкубаторе 28,5 ° C.
- Удалите все неоплодотворенных яиц или мертвых эмбрионов, которые появятся белые и непрозрачным.
- Подготовка и жить изображений zebrafish эмбриона
- 20 hpf, заменить E3 медиа с E3 медиа, содержащие 0,004% 1-фенил 2-тиомочевины (PTU) для предотвращения производства пигмента.
Примечание: Добавление ПТУ на чуть позже timepoint, таких как hpf 22-24, вряд ли мешать эксперимент из-за раннего возраста эмбрионов во время визуализации. Однако рекомендуется для лечения эмбрионы рано полностью предотвратить пигментации, как есть полоса пигментация, которая появляется в спинной глаза, что может помешать с изображениями SOS. - Убедитесь, что все эмбрионы находятся в правильных этапы развития в различных точках, вплоть до времени наблюдения. Рекомендуется, чтобы это было сделано на этапах, на котором Сомит номер хорошо видна как говорится Kimmel et al.13. Удалите эти, которые развивающих незрелые.
- Место эмбрионов под микроскопом рассечения, и dechorionate эмбрионы, осторожно потянув друг от друга с помощью Хорион изысканные щипцами. Визуализируйте SOS в спинной глаз. SOS может появиться как отступ на спинной маржа глаза, и линия должна быть видна через спинной глаз. Для нормальной SOS закрытия, наблюдать эмбрионов в окрестностях hpf 20-23. Для проверки задержки SOS закрытие фенотипов, наблюдать эмбрионов в 28 hpf или более поздней версии.
- Сортировка эмбрионов, которые показывают задержка закрытия SOS от тех, которые этого не делают.
- Сфотографировать эти эмбрионы с использованием рассечения микроскопа, подготовьте чашку Петри, содержащие агарозы 1% в E3. Слегка укол центр агарозы для создания неглубоких отверстия, в котором желток эмбриона может посидеть когда эмбрион помещается на агарозе. Это будет гарантировать, что эмбрион не под углом косой когда фотографироваться.
- Анестезировать эмбрионов с 0,003% tricaine в E3 и место боково на агарозе.
- Для изображения эмбрионов, с помощью составного или конфокального микроскопа, передачи эмбриона в 35 мм Петри, содержащий небольшой болюс-загущенное 1% легкоплавких точки агарозы в E3 (w/v). Быстро положение эмбриона, сбоку с использованием тонкой лески или ресниц и ждать агарозы для охлаждения. Как только агарозы фирмы, наливайте достаточно E3 в блюдо для покрытия агарозы. Для более подробной информации смотрите Distel и Köster14.
Примечание: Если с помощью инвертированного микроскопа, эмбрион может быть помещены против стекло стекло coverslip дно тарелки и образы с стандартной 20 X объективные линзы. - Используйте воду погружения 20 x объектив для визуализации SOS с составной микроскоп. После визуализации осторожно потяните агарозы из эмбрионов и исправить в параформальдегида 4% (PFA) или позволит продолжить их развитие.
- 20 hpf, заменить E3 медиа с E3 медиа, содержащие 0,004% 1-фенил 2-тиомочевины (PTU) для предотвращения производства пигмента.
2. Протокол 2: В целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин
- Целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин: день 1
- Dechorionate эмбрионы, как описано в шаге 1.2.3, если это еще не сделано. Исправить эмбрионов в microcentrifuge трубку на нужную timepoint в свежеприготовленные 4% PFA для 2 h на шейкере комнатной температуры (22-25 ° C). Вымойте его в 1 x PBST 5 минут, четыре раза.
Примечание: После гаструляция, эмбрионы могут исправить лучше после dechorionation. - Разрушения эмбрионов в протеиназы K 10 мг/мл при комнатной температуре за 5 минут инкубации время будет зависеть от стадии развития, на котором фиксируются эмбрионов (см. Thisse и Thisse15).
- Вымойте его в 1 x PBST 5 минут, четыре раза.
- Блокировать эмбрионов в раствор 5% козьего сыворотки и 2 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 1xPBST для 1-2 h на комнатной температуре шейкер.
- Готовят раствор основного антитела путем разбавления антитела анти Ламинин кролика в решении блока при разбавлении 1: 200.
- Инкубируйте эмбрионов в первичных антител анти Ламинин ночь на 4 ° C шейкер.
- Dechorionate эмбрионы, как описано в шаге 1.2.3, если это еще не сделано. Исправить эмбрионов в microcentrifuge трубку на нужную timepoint в свежеприготовленные 4% PFA для 2 h на шейкере комнатной температуры (22-25 ° C). Вымойте его в 1 x PBST 5 минут, четыре раза.
- Целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин: день 2
- Вымойте его в 1 x PBST за 15 мин, пять раз.
- Приготовляют раствор вторичные антитела путем разбавления коза анти кролик Alexa Fluor 488 антитела в 1 x PBST в разведении 1: 1000.
Примечание: Это возможно адаптировать этот шаг с учетом имеющихся ресурсов экспериментатора, используя различные вторичные антитела. - Инкубируйте эмбрионов в вторичное антитело в ночь на 4 ° C шейкер. Защищают от света максимально от этого шага начиная.
- Вымойте его в 1 x PBST за 15 минут, четыре раза. Эмбрионы могут храниться на 4 ° C на срок до недели, в случае необходимости.
- Рассечение и монтаж эмбриональных глаз
- При желании, эмбрионы в небольшой Петри и deyolk эмбрионов в 1 x PBST. Сделать это аккуратно нарушая желток с тонкой щипцами и удаляя желток клетки через мягкий соскоб желточного мешка.
- Подготовить следующие концентрации решения серии PBS-глицерина в microcentrifuge трубы: 30%, 50% и 70% глицерина в PBS. Перенос эмбрионов в 30% глицерина/PBS, убедившись, что место эмбрионов на вершине решение и передачи как мало предыдущего решения как можно скорее. Ждать для эмбрионов опускаться до нижней части трубки.
- Когда эмбрионы потоплены на дно, перевести их на 50% глицерина/PBS. Повторить и передача на 70% глицерина/PBS.
- После того, как эмбрионы потоплены в 70% глицерина/PBS, переместите их в небольшой пластиковый блюдо для вскрытия.
- Разорвать эмбриона кзади задний мозг и при необходимости использовать задней ткани для генотипирования.
- Перемещение голову к слайду стекла, передачи как мало глицерин как можно скорее. Использовать пинцет или другие инструменты тонкой рассечение провести на задний конец держать голову стационарные. Используйте тонкой minutien PIN-код или другие средства тонкой рассечение осторожно вставить в желудочек мозга от передней и сместите вниз, чтобы отделить правой и левой половины головы друг от друга. Повторите это, пока двигающ кзади через мозга и в задний мозг желудочек, по существу fileting головой вниз по средней линии. Это минимизирует ручной манипуляции глаз и окружающие ткани, тем самым оставляя неповрежденный SOS.
- Смонтируйте каждой стороне головы средней линии вниз, глаза вверх. Положение четырех должностей вакуумной смазки на углах (соответствующие расстояние врозь для coverslip используется) и крышка с coverslip стекла, толкая вниз последовательно на каждый пост до coverslip делает контакт с образцами. Пипетка 70% глицерина на краю coverslip, так что глицерин вытягиван под, заполняющей пространство между coverslip и слайд.
- Примеры изображений в день, или печать вокруг coverslip с ногтей и примеры изображений только после высыхания лака. Хранить в темноте при 4 ° C.
3. Протокол 3: Визуализация из SOS с помощью eGFP-CAAX мРНК
- Синтез мРНК eGFP-CAAX
- Линеаризации 1 мг16 pCS2-eGFP-CAAX плазмиду с Ноти в реакции объемом 40 мл за 4 часа при 37 ° C.
- Чтобы остановить ограничение дайджест реакции, добавить 10 мл, RNase свободной воды, 2,5 мл 10% SDS и 2.0 мл 10 мг/мл протеиназы K.
- Инкубировать 1 час при температуре 50 ° C.
- Добавьте следующее в отношении реакции (общий объем 200 мл) и переходите к следующему шагу: вода 50 мл, RNase бесплатно, 20 мл 3 M натрия ацетата рН 5.2 и 75,5 мл, RNase свободной воды
Примечание: РНКазы бесплатная вода добавляется в двух отдельных случаях, чтобы избежать чрезмерного разбавления ацетат натрия.
- Очистка ДНК через фенол/хлороформ добычи и этанола осадков
- Добавьте 200 мл фенола: хлороформ: изоамилового спирта и вихревые для 20 s. Отдельные водные и органические фазы путем центрифугирования в 18000 x g за 5 мин.
- Передать верхний водный слой новой microcentrifuge трубки, убедившись в том избежать передачи в органическом слое снизу. Добавьте равное количество метилхлороформа на новую трубу.
Примечание: Добавление метилхлороформа не является обязательным, но рекомендуется, чтобы обеспечить полное удаление фенола из образца. - Вортекс для 20 s. Отдельные водные и органические фазы путем центрифугирования в 18000 x g за 5 мин.
- Как и прежде передавать верхний водный слой новой microcentrifuge трубки, убедившись в том избежать передачи в органическом слое снизу.
- Добавьте 1/10 объема 3 M натрия ацетата рН 5.2.
- Осадок ДНК, добавив 3 тома 100% бесплатно РНКазы этанола и холод в-20 ° C в течение 15 мин центрифуги на 18,000 g x 20 мин при 4 ° C. Гранулы должны быть видны. Декант супернатант.
- Помойте лепешка с 100 мл холодной воды 70%, этанол/РНКазы бесплатно. После аккуратно перемешивания вырваться гранулы, центрифуги на 18,000 x g 15 мин при 4 ° C. Гранулы должны быть видны. Декант супернатант.
- Просушите Пелле за 5 мин и Ресуспензируйте ДНК в 7 мл воды.
Примечание: Гранулы может потребоваться сушить дольше, чем 5 мин в зависимости от доступных воздуха.
- Для очистки eGFP-CAAX мРНК и транскрипция
- Образом, RNase бесплатно Подготовьте в vitro транскрипция реакции с коммерчески доступных комплект полимеразы Sp6 РНК, используя около 1 мг очищенного линеаризованного плазмидной ДНК, полученных в шаге 3.2. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
Примечание: РНК-полимеразы Sp6 должен использоваться для производства ограничен мРНК. - Добавьте 1 mL DNase (2 ед/мл; РНКазы бесплатно) и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
- Очищайте мРНК с любого коммерчески доступных kit Очистка РНК. Алиготе мРНК избегать повторного замораживания оттаивания, и хранить при температуре-80 ° C.
- Образом, RNase бесплатно Подготовьте в vitro транскрипция реакции с коммерчески доступных комплект полимеразы Sp6 РНК, используя около 1 мг очищенного линеаризованного плазмидной ДНК, полученных в шаге 3.2. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
- Инъекции и визуализация
- Получения эмбрионов, изложенные в протоколе 1.1.
- С помощью аппарата микроинъекции, залить 300 pg eGFP-CAAX мРНК на этапе 1-клетка.
- Экран для эмбрионов с ярким выражением eGFP в глазах, с помощью флуоресценции стереоскоп.
- Изображения эмбрионов, как описано в протоколе 1.2.
- Кроме того, dechorionate и исправить эмбрионы на нужную timepoint в 4% PFA для 4 часа при комнатной температуре или на ночь при 4° C. Вымойте эмбрионы в 1 x PBST 5 минут, четыре раза и dechorionate, если сделано не ранее. Вскрыть глаза и смонтировать их на слайдах, как описано в разделе 2.3 протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данио рерио SOS появляется в 20 hpf предполагаемого спинной сетчатки8. 23 hpf SOS переходы от его первоначального узкого архитектуры для широкого отступы и 26 hpf, это больше не видны8. Таким образом для изучения SOS во время разработки глаз обычных данио рерио, эмбрионы должны соблюдаться между hpf 20-23. В этот период SOS является наблюдаемый объект путем рассечения микроскоп и через DIC изображений как тонкая линия в спинной глаз, который отделяет носовой и временных половинки развивающихся сетчатки (рис. 1). Кроме того тонкие отступы могут быть видны в спинной границы глаз (рис. 1). После immunofluorescent окрашивание Ламинин, тонкая линия может быть подтверждена быть базальной мембраны (рис. 1).
Чтобы изучать молекулярные пути, обусловило задержки SOS закрытия, мы решили наблюдать эмбрионов в 28 hpf как это является timepoint, что достаточно удалены от времени нормальной SOS закрытия и, следовательно, надежный маркер SOS закрытие задержки из-за экспериментальной манипуляции. Через прямые визуализация 28 hpf данио рерио под микроскопом рассечения можно оценить SOS закрытие задержки из-за экспериментальной манипуляции. Когда закрытие SOS задерживается, свое длительное присутствие может рассматриваться как произносится расщелины в спинной стороне глаза под микроскопом рассечения (рис. 2). Когда под составной микроскоп с использованием DIC или Номарски Оптика, эта особенность является даже более заметным, и стороны носа и временных глаза разделяются SOS, который хорошо виден как линия в спинной глаз (рис. 3).
SOS является выложены базальной пластинки компонентов, в том числе Ламинин. Таким образом immunofluorescent окрашивание обеспечивает дополнительный метод оценки закрытия SOS в фиксированных эмбрионов. При визуализации эмбриональных глаз от боковой вид, базальной пластинки разграничивает внешнего края глаза, как глазные трещины, так и на границе между объективом и сетчатки (рис. 4). SOS ориентирован непосредственно напротив сосудистое трещина в спинной части глаза. Весь эмбрионы могут монтироваться боков, с несколько лучше оптической прозрачностью, достигнуты, если глаза ранее microdissected. 28 hpf, в wildtype данио рерио, Ламинин пятнать ясно показывает что SOS полностью закрыт, что делает это идеальным сцену для мониторинга задержки с закрытием трещина.
Инъекции eGFP-CAAX мРНК позволяет визуализации клеточных мембран живой или фиксированной эмбриона (рис. 5). Успешный этап один клеточной инъекции достаточно для производства эмбрионов с флуоресценцией полной клеточной мембраны. В представлении боковой всех клеточных границ должен быть отмечен GFP флуоресценции, и как таковой, также четко прослеживается морфологии клеток. Это позволяет визуализировать морфологические изменения в ячейки, которые приводят к закрытию SOS.
Рисунок 1: наблюдение SOS во время разработки глаз обычных данио рерио. Данио рерио эмбрионы были собраны и отражаться в 22 hpf. A-B. Боковой вид 22 hpf эмбрионов, live образы с рассечения микроскопа (A) и через DIC изображений (Б), соответственно. SOS отмечены красной звездочкой. C. Ламинин immunofluorescent окрашивание 22 hpf эмбриона. Эмбрионы были зафиксированы в 4% PFA и получены для всего гора immunofluorescent окрашивание Ламинин. Эмбрионы были fileted и установлен в 70% глицерина/PBS. Один фрагмент изображения были получены через конфокальная томография с программным обеспечением. SOS характеризуется белая звездочка. Все цифры были аннотацией и собраны с помощью программного обеспечения Adobe Illustrator. Масштаб бары представляют 50 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: разбор изображения микроскопа SOS закрытие задержки в zebrafish личинок. Wildtype и gdf6a- / - эмбрионы были собраны и live образы на 28 hpf. А. боковой вид wildtype эмбриона с закрытой SOS. Б. боковой вид gdf6a- / - эмбриона с задержкой закрытия SOS (звездочка). Острые депрессии является наблюдаемая в спинной части глаза из-за неспособности SOS закрыть надлежащим образом. Масштаб бары представляют 50 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель DIC образы SOS в zebrafish эмбриона глаз. Wildtype и gdf6a- / - эмбрионы были собраны, под наркозом и боков помещены в 1% сверхчистого легкоплавких точки агарозы в E3 на 35 мм Петри. Блюдо был заполнен с E3, а составной микроскоп с 20 x погружением в воду цель была использована для визуализации DIC. А. боковой вид wildtype эмбриона с закрытой SOS. Б. боковой вид gdf6a- / - эмбриона с задержкой закрытия SOS (звездочка). SOS является наблюдаемый объект как тонкая линия в спинной части глаза. Масштаб бары представляют 50 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель изображений Ламинин, immunofluorescent окрашивание в zebrafish эмбриона глаз. Wildtype и gdf6a- / - эмбрионы были собраны и исправлена в 4% PFA 28 hpf. Базальной пластинки был immunostained, и эмбрионы были fileted и монтируется в 70% глицерина/PBS для конфокальная томография. Один фрагмент изображения были получены с помощью программного обеспечения дзен. А. боковой вид wildtype эмбриона с закрытой SOS. Б. боковой вид gdf6a- / - эмбриона с задержкой закрытия SOS (звездочка). Базальной пластинки показано изложением глаз в зеленый, с видимым в спинной части глаза в gdf6a- / - эмбрионов SOS. Масштаб бары представляют 50 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Imaging данио рерио эмбриональных глаза после инъекции мРНК eGFP-caax. Wildtype эмбрионы были введены с 300 pg eGFP-caax мРНК на этапе 1-клетка. 22 hpf и 28 hpf, соответственно, эмбрионы были под наркозом и боков установлен в 1% сверхчистого легкоплавких точки агарозы в E3 на 35 мм Петри. Конфокальный микроскоп с 20 x погружением в воду цель была использована для обработки изображений, и один фрагмент изображения были получены с помощью программного обеспечения. А. боковой вид gdf6a- / - эмбриона на 22 hpf с видимой открытой SOS (звездочка). Б. расширен панели gdf6a- / - эмбриона на 22 hpf. C. боковые вид gdf6a- / - эмбриона на 28 hpf с SOS закрытия задержки. D. расширен панели gdf6a- / - эмбриона на 28 hpf. Масштаб бары представляют 50 мм и 10 мм групп A и C и B и D, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов соблюдать SOS в развивающихся zebrafish эмбриона. Чтобы определить закрытие задержки фенотипов, наши протоколы были сосредоточены на способность различать разделение двух дискретных долей спинной носовой и спинной височной сторон глаза, похож на методы, используемые для визуализации задержка закрытия сосудистое трещина фенотипы в вентральной глаз.
Эти методы визуализации может использоваться в сочетании с различными методами генетической манипуляции для изучения последствий ингибирования или вызывая экспрессии определенных генов для изучения их роли в закрытии SOS. Мы выбрали для демонстрации этих протоколов с помощью gdf6a- / - эмбрионов, как ранее мы показали, что ее потеря может повлиять на надлежащее закрытие SOS, но протоколы могут использоваться для изучения последствий манипулирования выражение гена, как Обязательно. Рекомендуется предварительно изучены морфологические изменения спинной глаз с наблюдениями, с использованием рассечения микроскопа. Другие методы должны использоваться после первоначального связь установлена окончательно, как они являются более длительным и нижней пропускной способности.
В то время как протоколы могут быть легко изменены в соответствии с потребностями экспериментатора, есть несколько аспектов, которые следует тщательно. Из-за преходящий характер этой структуры крайне важно обеспечить, что все наблюдаемые эмбрионы имеют же стадии развития. Для нашей работы мы считаем важным обеспечить только небольшое окно разведение время и периодически сортировка эмбрионов на протяжении раннего развития. Самый важный шаг выравнивания этапов является 20 hpf, когда вы можете все еще точно рассчитывать сегменты (24)17, и мы находим это гораздо более надежным, чем промежуточной клейма, которые отображают время 28 hpf. Кроме того необходимо ингибированный или удалены для обеспечения успешной визуализации структуры пигментации. Мы наблюдали пигментации в глазах начинает начать около 22 hpf, и есть шаблон пигментации в спинной глаз, что может помешать правильной визуализации SOS. Поэтому настоятельно рекомендуется лечить эмбрионы с ПТУ до пигментации для обеспечения успешной визуализации. Кроме того рассечение эмбриональных глаза перед монтажом слайд без причинения ущерба требует некоторой практики. Важно также боково смонтировать глаза как параллельные, максимально на слайд. Рекомендуется, что экспериментатор практики эти методы с дополнительной эмбрионов до эксперимента.
За исключением immunofluorescent окрашивание базальной пластинки, все протоколы, описанные здесь может быть завершена с использованием живой эмбрионов. Это позволяет постоянно визуализации SOS в раннем эмбриогенезе, позволяя экспериментатор проводить покадровой исследований морфологических изменений, участие в закрытии SOS. В прошлом мы использовали трансгенов сетчатки конкретным, например Tg(rx3:eGFP), который знаменует нейронных сетчатки во время раннего развития. Хотя ей не хватает способность визуализировать клеточных мембран, использование Tg(rx3:eGFP) имеет преимущество, не требующих микроинъекций и был наш основной метод визуализации грубые морфологические изменения архитектуры SOS в режиме реального времени. Этот протокол не были включены здесь, как похожие методы обсуждались ранее в этом журнале18,19. Однако исследование клеток биологические основы формирования SOS и закрытие потребует мембранных флуоресцентных белков. В частности инъекции eGFP-CAAX мРНК позволяет визуализации клеточной мембраны вокруг SOS, как показано на рисунке 5, что позволяет изучить динамику изменения формы клетки в спинной глаза, которые необходимы для правильного закрытия SOS. Хотя eGFP-CAAX могут быть полезны для выполнения жить изображений SOS закрытия, он затрудняется наличием обертывающей слоя в данио рерио. Кроме того необходимо позаботиться при анализе результатов от мРНК инъекции, потому что это может привести к мозаичностью, что делает его трудно непосредственно сравнить на основе количественной оценки прочности выражения eGFP эмбрионов. Это могут быть смягчены за счет использования трансгенных данио рерио линии, которые дневно обозначить клеточной мембраны специально в развивающихся сетчатки, например Tg(vsx2.2:GFP-caax).
Одна из задач наших протоколов лежит на любое лечение, которое не является полностью капиллярный. Мы ранее отметил, что SOS задержки можно увидеть примерно в 10% эмбрионов управления в 28 hpf8, и это основной присутствие эмбрионов с SOS в пределах любой экспериментальной группы могут сделать его трудно наблюдать тонкие эффекты экспериментальных манипуляция. Это может рассматриваться, ослепляя экспериментатора по сокращению экспериментатор предвзятости и увеличивая количество эмбрионов, используемых в рамках каждой экспериментальной группы для увеличения мощности эксперимента. Кроме того на этапе анализа может быть перенесен на 29-30 hpf.
С этим набором протоколов мы стремимся к стандартизации путь, через который визуализируются SOS закрытие задержки. Методы, описанные выше было показано, быть надежными в обнаружения и визуализации SOS закрытие задержки в различных экспериментальных установок и могут быть адаптированы к потребностям экспериментатора. Хотя мы использовали методы, такие как сканирование электронной микроскопии или промежуток времени изображений трансгенных эмбрионов для визуализации SOS более подробно, нашей целью является создание стандартизированный набор протоколов, которые поддаются высок объём экспериментальной конструкции для визуализации большое количество эмбрионов в один день с упором на способность Оценка закрытие задержки фенотипов. В дополнение к его использование с gdf6a- / - эмбрионов мы были в состоянии соблюдать SOS закрытие задержки фенотипы с помощью этих методов визуализации наряду с фармакологических препаратов, Морфолино инъекции и РНК гиперэкспрессия исследований. Как осветил роль SOS в глаз развития далее через различные средства, мы надеемся, что этот стандартизированный набор протоколов обеспечивают научное сообщество общий язык, через который изучал этот роман структуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конфликтующие интересы объявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана канадской институты здравоохранения исследований (КНИИЗ), естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ), Альберта инновационную технологию фьючерсы и женщин и Институт исследований здоровья детей (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
