Summary
Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att iaktta den överlägsna okulära sulcus, en nyligen identifierade, evolutionärt bevarade struktur i ryggradsdjur öga. Med Zebrafiskar larver, demonstrerar vi tekniker behövs för att identifiera faktorer som bidrar till bildning och stängning av den överlägsna okulära sulcus.
Abstract
Medfödd okulär coloboma är en genetisk sjukdom som observeras vanligtvis som en skreva i sämre aspekt av ögat följd av ofullständig koroidea fissur stängning. Nyligen, identifiering av individer med coloboma i överlägsen aspekten av iris, näthinnan och linsen som ledde till upptäckten av en ny struktur, kallad den överlägsna spricka eller överlägsen okulär sulcus (SOS), som tillfälligt finns på den dorsala aspekt av optic cup under ryggradsdjur öga utveckling. Även om denna struktur är bevarad över möss, chick, fisk och newt, är vår nuvarande förståelse av SOS begränsad. För att belysa faktorer som bidrar till dess bildande och nedläggning, är det absolut nödvändigt för att kunna följa det och identifiera avvikelser, såsom fördröjning i stängningen av SOS. Här, syftar vi till att skapa en standardiserad serie av protokoll som kan användas för att effektivt visualisera SOS genom att kombinera allmänt tillgängliga mikroskopi tekniker med gemensamma molekylärbiologiska tekniker såsom Immunofluorescerande färgning och mRNA överuttryck. Medan denna uppsättning protokoll är inriktad på förmågan att iaktta SOS stängningen försening, det är anpassningsbar till de experimenter's behov och kan enkelt ändras. Sammantaget hoppas vi skapa en lättillgänglig metod genom vilken vår förståelse av SOS kan föras fram för att expandera den aktuella kunskapen om ryggradsdjur öga utveckling.
Introduction
Bildandet av vertebrate ögat är en mycket process där noggrant iscensatta intercellulära signalvägar upprätta vävnadstyper och ange regional identitet1. Störningar till tidig ögat morfogenes resultera i djupa defekter till arkitekturen i ögat och är ofta bländande2. En sådan sjukdom resulterar från underlåtenhet att stänga den koroidea okulära sprickan i ventrala sida av optic cup3. Denna sjukdom, som kallas okulär coloboma, uppskattas förekomma hos 1 av 4-5000 levande födda och orsak 3-11% av pediatrisk blindhet, ofta manifesterar sig som ett nyckelhål-liknande struktur som sticker ut inferiorly från eleven i mitten av ögat4, 5,6. Funktionen av koroidea spricka är att ge en startpunkt för tidig vaskulatur växer i optic koppen, varefter sidorna av sprickan kommer säkring för att innesluta den fartyg7.
Medan okulär coloboma har varit känt sedan urminnes tider, har vi nyligen identifierat en roman delmängd av coloboma patienter med vävnad förlust påverkar den superior/dorsala aspekten av ögat. Senaste arbete i vårt labb har lett till upptäckten av en okulär struktur i Zebrafiskar dorsala ögat, som vi kallar den överlägsna okulär sulcus (SOS) eller överlägsna spricka8. Det är viktigt att notera att strukturen har egenskaper från både en sulcus och en spricka. Liknar en sulcus, det är en kontinuerlig vävnad skikt som spänner från nässlemhinnan på tidsmässiga näthinnan. Dessutom stängningen av strukturen är inte medieras av en fusion av de två motsatta basalmembranet, och det verkar kräva en morphogenetic process genom vilken struktur är befolkad av celler. Dock liknar en spricka, det bildar en struktur som skiljer nasal och tidsmässiga sidorna av dorsala ögat med basalmembranet. För konsekvens hänvisar vi till det som SOS i denna text.
SOS är evolutionärt bevarad över ryggradsdjur, att vara synlig under ögat morfogenes i fisk, chick, newt och mus8. I motsats till den koroidea spricka, som finns från 20-60 timmar efter befruktning (hpf) i Zebrafiskar, SOS är mycket övergående, lätt synlig från 20-23 hpf och frånvarande av 26 hpf8. Senare forskning i vårt labb har funnit att, liknar den koroidea sprickan, SOS spelar en roll i vaskulär vägledning under ögat morfogenes8. Även om de faktorer som styr bildandet och nedläggning av SOS inte är ännu helt klarlagda, våra data Markera roller för dorsal-ventrala öga mönstring gener8.
Zebrafisk är en utmärkt modellorganism att studera SOS. Som modellsystem, det ger ett antal fördelar i att studera ögats utveckling: det är en vertebrate modell; varje generation uppvisar hög fruktsamhet (~ 200 embryon). dess arvsmassa har varit fullt sekvenserade, vilket underlättar genetisk manipulation; och cirka 70% av mänskliga gener har minst en Zebrafiskar orthologue, vilket gör det till en idealisk genetik-baserad modell av mänskliga sjukdomar9,10. Viktigast av allt, dess utveckling sker externt till mamman, och dess larver är transparenta, vilket möjliggör visualisering av utveckla ögat med relativ lätthet11.
I denna uppsättning protokoll beskriver vi de metoder genom vilka SOS kan visualiseras i Zebrafiskar larver. Olika visualiseringstekniker som används i denna rapport gör att tydlig observation av SOS under normala ögats utveckling, liksom förmågan att upptäcka SOS stängning defekter. Våra exempel protokoll kommer att innehålla undersökningar av Gdf6, BMP lokaliserad till den dorsala öga och kända regulator av SOS nedläggning. Ytterligare, dessa tekniker kan kombineras med experimentella manipulationer för att identifiera genetiska faktorer eller farmakologiska medel som påverkar korrekt SOS bildandet och stängning. Vi har dessutom inkluderat ett protokoll genom vilket den fluorescerande avbildning av alla cellmembran är möjligt, att låta försöksledaren att iaktta morfologiska förändringar i celler som omger SOS. Vårt mål är att fastställa en uppsättning standardiserade protokoll som kan användas i hela det vetenskapliga samfundet för att erbjuda nya insikter i denna nya struktur i utvecklingsländer ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av University of Alberta djur vård och användning kommittén.
1. protokoll 1: Visualisering av SOS med hjälp av stereomicroscopy och differentiell störningar kontrast (DIC) imaging
- Embryosamlingsgruppen
- I en tank dechlorinated vatten, förbereda korsningar av gdf6a+/- Zebrafiskar på kvällen genom att para ihop en manlig Zebrafiskar med en kvinnlig Zebrafiskar. Var noga med att skilja hanen från honan med hjälp en avdelare för att säkerställa att embryon är födda inom ett litet utbud av tid.
- Följande morgon dra delningslisten och tillåta den Zebrafiskar till aveln för längre än 30 min. samla embryon i petriskålar med E3 media, beskrivs i The Zebrafiskar bok12, och placera dem i en 28,5 ° C inkubator.
- Ta bort alla Obefruktade ägg eller döda embryon, som kommer att visas vit och ogenomskinlig.
- Förberedelse och live-imaging Zebrafiskar embryon
- 20 hpf, Ersätt E3 media med E3 media som innehåller 0,004% 1-fenyl 2-Tiourea (PTU) att förhindra pigment produktion.
Obs: Tillägg av PTU på en något senare tidpunkt, såsom 22-24 hpf, är osannolikt att störa experimentet på grund av embryona tidiga år vid tidpunkten för bildframställning. Det rekommenderas dock att behandla embryona tidigt för att helt förhindra pigmentering som det finns ett band av pigmentering som visas i dorsala ögat, som kan störa avbildning av SOS. - Se till att alla embryon i de rätta utvecklingsstadierna på olika punkter fram till tidpunkten för observation. Det rekommenderas att detta görs i de skeden som vid som somite nummer är tydligt synlig som beskrivs av Kimmel et al.13. Ta bort de som är utvecklingsstörda omogna.
- Placera embryona i dissekera Mikroskop, och dechorionate embryon genom att försiktigt dra isär den chorion med fina pincett. Visualisera SOS i dorsala ögat. SOS kan visas som en inbuktning på dorsala marginalen i ögat, och en linje ska synas över dorsala ögat. För normala SOS stängning, iaktta embryona på runt 20-23 hpf. För granskning av fördröjd SOS stängning fenotyper, iaktta embryona 28 hpf eller senare.
- Sortera de embryon som visar SOS stängningen försening från de som inte gör.
- För att fotografera dessa embryon med dissekera Mikroskop, förbereda en petriskål som innehåller 1% agaros i E3. Lätt sticka centrum Agarens skapa ett grunt hål där äggulan i embryot kan sitta när embryot placeras på Agarens. Detta kommer att säkerställa att embryot inte är i en sned vinkel när att fotograferas.
- Söva embryon med 0,003% tricaine i E3 och plats sido på Agarens.
- För att bild embryon med sammansatta eller confocal Mikroskop, överför embryot till 35 mm petriskål som innehåller en liten bolusdos av icke-geléartad 1% låg-smältande punkt agaros som i E3 (w/v). Snabbt placera embryot sidled med hjälp av en fin fiskelina eller en ögonfrans och vänta på Agarens svalna. När Agarens är fast, häll tillräckligt E3 i skålen att täcka Agarens. För mer information, se Distel och Köster14.
Obs: Om du använder ett inverterat Mikroskop, embryot kan vara placerad mot glaset i en glas-täckglas-botten maträtt och avbildas med en standard 20 X objektiv lins. - Använda en vatten nedsänkning 20 x objektiv för att visualisera SOS med ett compound-Mikroskop. Efter visualisering, försiktigt dra Agarens från embryon och fixa i 4% paraformaldehyd (PFA) eller tillåta för att fortsätta sin utveckling.
- 20 hpf, Ersätt E3 media med E3 media som innehåller 0,004% 1-fenyl 2-Tiourea (PTU) att förhindra pigment produktion.
2. protokoll 2: Hela-mount Immunofluorescerande färgning av laminin
- Hela-mount Immunofluorescerande färgning av laminin: dag 1
- Dechorionate embryon som beskrivs i steg 1.2.3, om inte redan har gjort. Fixa embryon i en mikrocentrifug rör på den önskad tidpunkt i nygjorda 4% PFA för 2 h på en rumstemperatur (22-25 ° C) shaker. Tvätta i 1 x PBST för 5 min, fyra gånger.
Obs: Efter gastrulation, embryon kan fixa bättre efter dechorionation. - Permeabilize embryon i 10 mg/mL proteinas K vid rumstemperatur för 5 min. inkubationstid beror på utvecklingsstadiet där embryona korrigeras (se Thisse och Thisse15).
- Tvätta i 1 x PBST för 5 min, fyra gånger.
- Blockera embryon i en lösning av 5% get serum och 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) i 1xPBST för 1-2 h på en rumstemperatur shaker.
- Bered primär antikropp genom spädning av kanin-anti-laminin-antikropp i block lösning vid en spädning 1: 200.
- Inkubera embryon i anti-laminin primär antikropp övernattning på en 4 ° C shaker.
- Dechorionate embryon som beskrivs i steg 1.2.3, om inte redan har gjort. Fixa embryon i en mikrocentrifug rör på den önskad tidpunkt i nygjorda 4% PFA för 2 h på en rumstemperatur (22-25 ° C) shaker. Tvätta i 1 x PBST för 5 min, fyra gånger.
- Hela-mount Immunofluorescerande färgning av laminin: dag 2
- Tvätta i 1 x PBST för 15 min, fem gånger.
- Förbereda sekundär antikropp lösning genom att späda ut get-anti-kanin Alexa Fluor 488 antikropp i 1 x PBST till en utspädning av 1: 1000.
Obs: Det är möjligt att anpassa detta steg för att passa de tillgängliga resurserna till experimenter med hjälp av en annan sekundär antikropp. - Inkubera embryon i sekundär antikropp över natten på en 4 ° C shaker. Sköld från ljus så mycket som möjligt från detta steg framåt.
- Tvätta i 1 x PBST för 15 min, fyra gånger. Embryon kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka, om det behövs.
- Dissektion och montering av embryonala ögon
- Om du vill placera embryon i en liten petriskål och deyolk embryon i 1 x PBST. Gör detta genom försiktigt störa äggulan med fin pincett och ta bort äggula cellerna genom mild skrapning av gulesäcken.
- Förbered följande koncentrationer av PBS-glycerol serie lösningar i mikrocentrifugrör: 30%, 50% och 70% glycerol i PBS. Överföra embryon till 30% glycerol/PBS, se till att placera embryona ovanpå lösningen och överföra så lite av föregående lösning som möjligt. Vänta tills embryona som sjunker till botten av röret.
- När embryon har sjunkit till botten, överföra dem till 50% glycerol/PBS. Upprepa och överföra till 70% glycerol/PBS.
- När embryona har sjunkit i 70% glycerol/PBS, flytta dem till en liten plast skål för dissektioner.
- Sever embryot posteriort hindbrain och använda den bakre vävnaden för genotypning, om nödvändigt.
- Flytta huvudet till en glasskiva, överföra som lite glycerol som möjligt. Använd tång eller andra fina dissektion verktyg för att hålla fast vid den bakre änden till hålla huvudet stilla. Använd en fin minutien PIN-kod eller andra fina dissektion verktyg att försiktigt in i framhjärnan ventrikeln från den främre och tryck nedåt för att skilja på höger och vänster halvor av huvudet från varandra. Upprepa detta medan du flyttar posteriort genom mitthjärnan och in hindbrain ventrikeln, i huvudsak fileting huvudet ner mittlinjen. Detta minimerar manuell manipulation av ögat och omgivande vävnad, vilket lämnar SOS oskadade.
- Montera varje sida av huvudet mittlinjen ner, ögat upp. Position fyra inlägg av vakuum fett i hörnen (ett lämpligt avstånd ifrån varandra för de täckglas används) och täck med ett täckglas, pressar sekventiellt på varje inlägg tills täckglaset kommer i kontakt med prover. Pipettera 70% glycerol vid kanten av täckglaset så att glycerol dras under, fyller utrymmet mellan täckglaset och bilden.
- Bild prover inom en dag eller tätning runt på täckglaset med nagellack och bild prover endast efter nagellacket har torkat. Förvaras i mörker vid 4 ° C.
3. protokoll 3: Visualisering av SOS använder Andra-CAAX mRNA
- Syntes av andra-CAAX mRNA
- Linjär 1 mg pCS2-andra-CAAX plasmid16 med NotI i en reaktionsvolym 40 ml i 4 timmar vid 37 ° C.
- För att stoppa begränsning digest reaktionen, tillsätt 10 mL RNase-gratis vatten, 2,5 mL 10% SDS och 2,0 mL 10 mg/mL proteinas K.
- Inkubera i 1 timme vid 50 ° C.
- Lägg till följande reaktion (total volym 200 mL) och fortsätt till nästa steg: 50 mL RNase-gratis vatten, 20 mL 3 M natrium acetat pH 5.2 och 75,5 mL RNase-gratis vatten
Obs: RNase-fritt vatten tillsätts i två separata tillfällen att förhindra överdriven utspädning av natriumacetat.
- Rening av DNA genom fenol/kloroform utvinning och etanol nederbörd
- Tillsätt 200 mL fenol: kloroform: isopentanol och vortex för 20 s. separat vattenfasen och den organiska faserna genom centrifugering vid 18.000 x g i 5 min.
- Överföra övre vattenskiktet till en ny mikrocentrifug rör, se till att undvika överföring av organiska bottenlagret. Tillsätt en motsvarande volym av kloroform till nya röret.
Obs: Tillägg av kloroform är valfritt, men det rekommenderas att garantera fullständigt avlägsnande av fenol från provet. - Vortex för 20 s. separat vattenfasen och den organiska faserna genom centrifugering vid 18.000 x g i 5 min.
- Liksom tidigare överföra övre vattenskiktet till en ny mikrocentrifug rör, se till att undvika överföring av organiska bottenlagret.
- Tillsätt 1/10 volym 3 M natrium acetat pH 5.2.
- Fällningen DNA genom att lägga till 3 volymer av 100% RNase-gratis etanol och chill vid-20 ° C i 15 min. Centrifugera vid 18.000 x g i 20 min vid 4 ° C. En pellet ska synas. Dekantera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 100 mL 70% etanol/RNase-free kallvatten. Efter försiktigt blandning för att lossna pelleten, Centrifugera 18.000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. En pellet ska synas. Dekantera supernatanten.
- Lufttorka pelleten i 5 min och resuspendera DNA i 7 mL vatten.
Obs: Pelleten kan behöva torkas längre än 5 min beroende på luftflödet tillgängliga.
- Transkription och rening av andra-CAAX mRNA
- I ett RNase-fri sätt, förbereda en in vitro- transkription reaktion med ett kommersiellt tillgängliga Sp6 RNA polymeras kit, använda ca 1 mg av renat linearized plasmid DNA som erhålls i steg 3,2. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
Obs: Sp6 RNA-polymeras måste användas för produktion av utjämnade mRNA. - Tillsätt 1 mL av DNAS (2 U/mL; RNase gratis) och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Rena mRNA med någon kommersiellt tillgänglig RNA rening kit. Alikvot mRNA att undvika upprepad frysning-tining och lagra vid-80 ° C.
- I ett RNase-fri sätt, förbereda en in vitro- transkription reaktion med ett kommersiellt tillgängliga Sp6 RNA polymeras kit, använda ca 1 mg av renat linearized plasmid DNA som erhålls i steg 3,2. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Injektion och visualisering
- Erhålla embryon som beskrivs i protokollet 1.1.
- Med hjälp av en Mikroskop apparatur, injicera 300 pg av andra-CAAX mRNA i 1-cellstadie.
- Skärmen för embryon med ljusa uttryck för andra i ögonen med en fluorescens Stereoskop.
- Bild embryona som beskrivs i protokollet 1.2.
- Alternativt, dechorionate och fixera embryona på den önskad tidpunkt i 4% PFA i 4 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4° C. Tvätta embryona i 1 x PBST för 5 min, fyra gånger och dechorionate, om inte tidigare gjort. Dissekera ögonen och montera dem på bilder som beskrivs i protokollet 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebrafiskar SOS visas 20 hpf i presumtiva dorsala retina8. Av 23 hpf SOS övergångar från dess ursprungliga smala arkitektur till en bred indrag och 26 hpf är inte längre synlig8. Därför, för att undersöka SOS under normala Zebrafiskar öga utveckling, embryon måste observeras mellan 20-23 hpf. Under denna period är SOS observerbar via mikroskopet dissekera och DIC imaging som en tunn linje i dorsala ögat som separerar de nasala och tidsmässiga halvorna av utveckla näthinnan (figur 1). Dessutom syns en subtil indrag i dorsala kanten av ögat (figur 1). Efter Immunofluorescerande färgning av laminin, den tunna linjen kan bekräftas vara basalmembranet (figur 1).
För att undersöka molekylära vägar resulterar i försenad SOS stängning, vi valde att observera embryona 28 hpf eftersom detta är en tidpunkt som är tillräckligt ifrån normala SOS stängning och därför är det en pålitlig markör SOS stängningen försening på grund av experimentella manipulationer. Genom direkt visualisering av 28 hpf Zebrafiskar under mikroskopet dissekera är det möjligt att utvärdera SOS stängningen försening pga experimentella manipulation. När SOS avslutandet fördröjs, kan dess långvarig närvaro ses som en uttalad skreva i den dorsala sidan av ögat under mikroskopet dissekera (figur 2). När observeras under mikroskopet förening använder DIC eller Nomarski optik, denna funktion är ännu mer framträdande, och nasal och tidsmässiga sidorna av ögat är separerade av SOS, vilket syns tydligt i en linje i dorsala ögat (figur 3).
SOS är fodrad med basala lamina komponenter, inklusive laminin. Immunofluorescerande färgning ger därför en kompletterande metod för att utvärdera SOS stängning i fasta embryon. När imaging embryonala ögat från sidoutsikt, den basala lamina avgränsas yttermarginalen i ögat, både okulär sprickor, och gränsen mellan linsen och näthinnan (figur 4). SOS är orienterad direkt motsatt koroidea sprickan i den dorsala delen av ögat. Hela embryon kan monteras i sidled med något bättre optisk klarhet uppnås om ögonen är tidigare microdissected. Av 28 hpf, i vildtyp Zebrafiskar, laminin färgning visar tydligt att SOS är helt stängd, vilket gör detta perfekta scenen för övervakning av förseningar i sprickan stängning.
Injektion av andra-CAAX mRNA tillåter visualisering av cellmembranen av ett levande eller fasta embryo (figur 5). Framgångsrik en-cellstadie injektion är tillräcklig för att producera embryon med komplett cellmembranet fluorescens. I vyn laterala alla cellulära gränser bör präglas av god Jordbrukarsed fluorescens, och som sådan, Cellmorfologi observeras också tydligt. Detta tillåter visualisering av de morfologiska förändringarna till de celler som leda till SOS.
Figur 1: Observation av SOS under normala Zebrafiskar öga utveckling. Zebrafiskar embryon samlades och avbildas på 22 hpf. A-B. Lateral bild av 22 hpf embryon live-avbildas med mikroskopet dissekera (A) och via DIC imaging (B), respektive. SOS är markerad med en röd asterisk. C. Laminin Immunofluorescerande färgning av en 22 hpf embryo. Embryon fastställdes i 4% PFA och erhålls för hela-mount Immunofluorescerande färgning av laminin. Embryona var fileted och monterad i 70% glycerol/PBS. Cirkelsektor bilder erhölls genom confocal imaging med en programvara. SOS är markerad med en vit asterisk. Alla siffror var annotated och monteras med hjälp av Adobe Illustrator programvara. Skala staplarna representerar 50 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: dissekera mikroskopbilder av SOS stängningen försening i Zebrafiskar larver. Vildtyp och gdf6a- / - embryon var insamlade och live-avbildas på 28 hpf. A. Lateral vy av en vildtyp embryo med en sluten SOS. B. Lateral vy av en gdf6a- / - embryo med en SOS stängningen försening (asterisk). En kraftig depression är observerbar i den dorsala delen av ögat på grund av SOS att stänga på lämpligt sätt. Skala staplarna representerar 50 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: representant DIC bilder av SOS i Zebrafiskar embryonala ögat. Vildtyp och gdf6a- / - embryon var samlat, sövd och sidled placeras i 1% Ultrarena låg-smältande punkt agaros i E3 på en 35 mm petriskål. Skålen var fylld med E3, och en förening Mikroskop med en 20 x vatten-doppning mål användes för DIC avbildning. A. Lateral vy av en vildtyp embryo med en sluten SOS. B. Lateral vy av en gdf6a- / - embryo med en SOS stängningen försening (asterisk). SOS är observerbar som en tunn linje i den dorsala delen av ögat. Skala staplarna representerar 50 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder av laminin Immunofluorescerande färgning i embryonala Zebrafiskar ögat. Vildtyp och gdf6a- / - embryon samlades och fasta i 4% PFA 28 hpf. Den basala lamina var immunostained, och embryona var fileted och monterad i 70% glycerol/PBS för confocal avbildning. Cirkelsektor bilder erhölls med ZEN programvara. A. Lateral vy av en vildtyp embryo med en sluten SOS. B. Lateral vy av en gdf6a- / - embryo med en SOS stängningen försening (asterisk). Den basala lamina visas beskriver ögat i grönt, med SOS synliga i den dorsala delen av ögat i gdf6a- / - embryon. Skala staplarna representerar 50 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: avbildning av zebrafisk embryonala ögat efter andra-caax mRNA injektion. Vildtyp embryon injicerades med 300 pg av andra-caax mRNA 1-cellstadie. 22 hpf och 28 hpf, respektive embryona var sövda och sido monterad i 1% Ultrarena låg-smältande punkt agaros i E3 på en 35 mm petriskål. En confocal Mikroskop med en 20 x vatten-doppning mål användes för avbildning och cirkelsektor bilder erhölls användande en mjukvaran. A. Lateral vy av en gdf6a- / - embryo 22 hpf med en synlig öppen SOS (asterisk). B. förstorade paneler av en gdf6a- / - embryo 22 hpf. C. Lateral vy av en gdf6a- / - embryo 28 hpf med SOS förslutning fördröja. D. förstorade paneler av en gdf6a- / - embryo 28 hpf. Skala staplarna representerar 50 mm och 10 mm i paneler A och C och B och D, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att följa SOS i det växande embryot Zebrafiskar. För att avgöra stängningen försening fenotyper, har våra protokoll fokuserat på förmågan att särskilja separation av två diskreta lober av dorsala-nasala och dorsal-temporal sidor av ögat, liknande tekniker används för att visualisera koroidea fissur stängningen försening fenotyper i ventrala ögat.
Dessa visualiseringstekniker kan användas tillsammans med en mängd genetiska manipulation tekniker för att studera effekterna av hämmande eller inducerande uttrycket av vissa gener att studera deras roller i stängningen av SOS. Vi har valt att visa dessa protokoll som använder gdf6a- / - embryon som vi har tidigare visat att dess förlust kan påverka korrekt stängning av SOS, men protokoll som kan användas för att studera effekterna av att manipulera uttrycket av någon gen som krävs. Det rekommenderas att eventuella morfologiska förändringar i dorsala ögat studeras preliminärt med observationer med hjälp av mikroskopet dissekera. Andra tekniker kan användas när en inledande koppling slutgiltigt, eftersom de är mer tidskrävande och lägre genomströmning.
Medan protokoll kan enkelt modifieras för att passa behoven hos experimenter, finns det flera aspekter som måste följas noggrant. På grund av övergående arten av denna struktur är det absolut nödvändigt att se till att alla embryon är av samma utvecklingsstadiet. För vårt arbete tycker vi att det är viktigt att tillåta endast ett litet fönster avel tid och regelbundet sortera embryon under tidig utveckling. Det viktigaste steget i utjämningsladdning stadier är 20 hpf, när du kan fortfarande exakt räkna thoraxsegmenten (24)17, och vi tycker att detta är mycket mer tillförlitliga än mellanlagringsplatsen kännetecken som avgränsa tid 28 hpf. Dessutom måste pigmentering hämmade eller bort för att säkerställa framgångsrika visualisering av strukturen. Vi har observerat pigmentering i ögat börjar att starta omkring 22 hpf, och det finns ett mönster av pigmentering i dorsala ögat som kan störa korrekt visualisering av SOS. Därför rekommenderas det att behandla embryona med PTU före pigmentering att säkerställa framgångsrika visualisering. Dessutom kräver dissektion i embryonala ögat före Slädmontage utan att skada lite övning. Det är också viktigt att sidled montera ögon så parallellt som möjligt i bilden. Det rekommenderas att experimenter övar dessa tekniker med extra embryon innan experimentet.
Med undantag för Immunofluorescerande färgningen av den basala lamina, kan alla de protokoll som beskrivs här slutföras via levande embryon. Detta tillåter kontinuerlig visualisering av SOS i hela tidig embryogenes, att låta försöksledaren time-lapse studier av de morfologiska förändringarna som förekommer i stängningen av SOS. Tidigare har vi använt näthinnan-specifika transgener, såsom Tg(rx3:eGFP), som markerar den neural retina under tidig utveckling. Även om den saknar förmågan att visualisera cellmembran, användningen av Tg(rx3:eGFP) har fördelen att inte kräva microinjections och har varit våra primära metod att visualisera brutto morfologiska förändringar till SOS arkitektur i realtid. Protokollet har inte tagits med här, eftersom liknande metoder har diskuterats tidigare i denna tidning18,19. Dock kräver utredning av cellen biologisk grund av SOS bildandet och nedläggning fluorescerande membranproteiner. Specifikt kan injektion av andra-CAAX mRNA visualisering av cellmembranen runt SOS som kan ses i figur 5, som tillåter oss att studera dynamiken i cell formförändringar i dorsala ögat som krävs för korrekt SOS stängning. Medan andra-CAAX kan vara användbar för att utföra live-imaging SOS nedläggning, försvåras det av närvaron av omslutande lagret i Zebrafiskar. Dessutom måste vara försiktig när man analyserar resultaten från mRNA injektioner eftersom det kan resultera i mosaicism, vilket gör det svårt att direkt jämföra embryon baserat på kvantifiering av andra uttrycksstyrka. Detta kan förbättras genom användning av transgena Zebrafiskar linjer som fluorescently etikett cellmembran specifikt i utvecklingsländer näthinnan, såsom Tg(vsx2.2:GFP-caax).
En av utmaningarna som våra protokoll ligger med någon behandling som inte är fullt penetrant. Vi har tidigare noterat att SOS förseningar kan ses hos ca 10% av kontroll embryon på 28 hpf8, och denna underliggande förekomsten av embryon med en SOS inom någon viss experimentell grupp kunde göra det svårt att iaktta subtila effekter av experimentella manipulation. Detta kan åtgärdas genom bländande experimenter för att minska experimenter bias och öka antalet embryon som används inom varje experimentella gruppen för att öka kraften i experimentet. Dessutom kunde arrangera av analys skiftas till 29-30 hpf.
Med denna uppsättning protokoll försöker vi standardisera det sätt genom vilket SOS stängning förseningar visualiseras. De tekniker som beskrivs ovan har visat sig vara tillförlitlig att upptäcka och visualisera SOS stängning förseningar i en mängd olika experimentella inställningarna och är anpassningsbar till de experimenter's behov. Medan vi har använt tekniker såsom scanning electron microscopy eller time-lapse avbildning av transgena embryon för att visualisera SOS i större detalj, är vårt mål här att skapa en standardiserad uppsättning protokoll som är mottagliga för hög genomströmning experimentella mönster för att visualisera ett stort antal embryon i en enda dag med betoning på möjligheten att poäng stängningen försening fenotyper. Förutom dess användning med gdf6a- / - embryon, har vi kunnat följa SOS stängningen försening fenotyper använder dessa visualiseringstekniker tillsammans med farmakologiska behandlingar, morpholino injektioner och RNA överuttryck studier. Som rollen av SOS i ögat utveckling är klarlagd vidare på olika sätt, vi hoppas att denna standardiserad uppsättning protokoll ger det vetenskapliga samfundet ett gemensamt språk genom vilket denna roman struktur studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), naturliga vetenskaper och Engineering Research rådet (NSERC), Alberta utvecklar teknik Futures, och kvinnor och barns hälsa Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
