Summary
Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.
Abstract
Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.
Introduction
La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale1. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes2. Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique3. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 11 % de la cécité pédiatrique, communément se manifestant par une structure de type trou de serrure qui fait saillie inférieurement de l’élève au centre de l’oeil4, 5,6. La fonction de la fissure choroïde est de fournir un point d’entrée pour début vascularisation de plus en plus dans la cupule optique, après quoi les côtés de la fissure vont se fusionnent pour enfermer les vaisseaux7.
Alors que le colobome oculaire est connu depuis les temps anciens, nous avons récemment identifié un nouveau sous-ensemble de colobome patients avec perte de tissu qui affectent l’aspect supérieur/dorsale de le œil. Des travaux récents dans notre laboratoire a conduit à la découverte d’une structure oculaire dans le œil de poisson-zèbre dorsale, que nous appelons le sillon oculaire supérieur (SOS) ou fissure supérieure8. Il est important de noter que la structure présente des caractéristiques d’un sillon tant une fissure. Semblable à un sillon, c’est une couche de tissu continu qui s’étend de la nasale de la rétine temporale. En outre, la fermeture de la structure n’est pas véhiculée par une fusion des deux s’opposant à membrane basale, et il semble avoir besoin d’un processus morphogénétique par lequel la structure est remplie de cellules. Cependant, comme dans une fissure, il forme une structure qui sépare les parties nasales et temporelles de le œil dorsale avec la membrane basale. Par souci de cohérence, nous appellerons à elle comme SOS dans ce texte.
Le SOS est évolutivement conservée à travers des vertébrés, étant visible durant la morphogenèse oeil de poisson, poussin, Triton et souris8. Contrairement à la fissure choroïde, qui est présente de 20 à 60 heures après la fécondation (hpf) chez le poisson zèbre, le SOS est très transitoire, étant facilement visible de 20-23 hpf et absent par 26 hpf8. Des études récentes dans notre laboratoire ont révélé que, semblable à la fissure choroïde, le SOS joue un rôle dans une conduite vasculaire au cours de le œil la morphogenèse8. Bien que les facteurs qui contrôlent la formation et la fermeture du re ne sont pas encore totalement comprises, nos données mettent en évidence les rôles pour oeil dorsal-ventral patterning gènes8.
Poisson zèbre est un organisme d’excellent modèle pour étudier la SOS. Comme système modèle, il fournit un certain nombre d’avantages dans l’étude de développement de le œil : C’est un modèle de vertébrés ; chaque génération présente forte fécondité (~ 200 embryons) ; son génome a été entièrement séquencé, ce qui facilite la manipulation génétique ; et environ 70 % des gènes humains ont au moins un orthologue de poisson-zèbre, ce qui en fait un modèle idéal de base génétique des maladies humaines9,10. Plus important encore, son développement se déroule à l’extérieur à la mère, et ses larves sont transparentes, ce qui permet la visualisation de le œil en développement avec la facilité relative de11.
Dans cet ensemble de protocoles, les auteurs décrivent les techniques à travers lequel le SOS peuvent être visualisées dans des larves de poisson zèbre. La variété des techniques de visualisation utilisé dans le présent rapport permettra l’observation claire du re au cours du développement de l’oeil normal, ainsi que la capacité de détecter les défauts de fermeture de SOS. Nos protocoles d’exemple mettra en vedette des enquêtes de Gdf6, un BMP localisée à la partie dorsale oeil et régulateur connu de fermeture de SOS. En outre, ces techniques peuvent être associés à des manipulations expérimentales afin d’identifier les facteurs génétiques ou des agents pharmacologiques qui affectent la fermeture et la bonne formation de SOS. En outre, nous avons inclus un protocole par lequel l’imagerie fluorescente de toutes les membranes cellulaires est possible, permettant à l’expérimentateur d’observer les changements morphologiques pour les cellules qui entourent les SOS. Notre objectif est d’établir un ensemble de protocoles normalisés qui permet d’offrir de nouvelles perspectives sur cette nouvelle structure de l’oeil en développement dans l’ensemble de la communauté scientifique.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme.
1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel
- Collecte des embryons
- Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oubliez pas de séparer le mâle de la femelle à l’aide d’un diviseur pour s’assurer que les embryons sont nés dans une gamme limitée de temps.
- Le lendemain matin, enlever l’et laisser le poisson-zèbre à reproduire pour ne plus que 30 min. recueillir les embryons dans des boîtes de pétri avec les médias de l’E3, décrits dans le livre du poisson-zèbre,12et placez-les dans un incubateur à 28,5 ° C.
- Enlevez tous les œufs non fécondés ou des embryons morts, qui apparaîtront blanche et opaque.
- Préparation et vivre-imagerie des embryons de poisson-zèbre
- À 20 hpf, remplacer l’E3 media avec E3 media contenant 0,004 % 1-phényl 2-thiourée (PTU) pour empêcher la production de pigments.
Remarque : L’ajout de PTU à un validant un peu plus tard, comme les 22-24 hpf, est peu susceptible d’interférer avec l’expérience en raison de l’âge de l’embryon à l’époque de l’imagerie. Toutefois, il est recommandé de traiter les embryons tôt afin d’éviter complètement la pigmentation il y a une bande de pigmentation qui apparaît dans l’oeil dorsal, qui peut interférer avec l’imagerie du re. - S’assurer que tous les embryons sont aux stades du développement corrects en divers points menant au moment de l’observation. Il est recommandé que cela se fait au stade à laquelle somite nombre est clairement visible tels que décrits par Kimmel et al.13. Supprimer celles qui sont immatures développemental.
- Placer les embryons sous un microscope à dissection et dechorionate les embryons en tirant doucement le chorion à l’aide de pinces fines. Visualiser les SOS dans l’oeil dorsal. Le SOS peut apparaître comme une mise en retrait à la marge dorsale de le œil, et une ligne doit être visible à travers le œil dorsale. Pour la fermeture normale de SOS, observez les embryons à autour de 20-23 hpf. Pour l’examen des phénotypes de fermeture retardées SOS, observez les embryons à 28 hpf ou version ultérieure.
- Trier les embryons qui montrent le retard de fermeture de SOS de ceux qui ne le font pas.
- Pour photographier ces embryons à l’aide d’un microscope à dissection, préparer une boîte de pétri contenant 1 % d’agarose dans E3. Légèrement piquer au centre de l’agarose à créer un trou peu profond dans lequel le jaune de l’embryon peut s’asseoir lorsque l’embryon est placé sur l’agarose. Cela garantira que l’embryon n’est pas à un angle oblique quand se faire photographier.
- Anesthésier les embryons avec tricaïne 0,003 % en E3 et place latéralement sur l’agarose.
- Pour les embryons à l’aide d’un microscope confocal ou de composés d’images, transférer l’embryon dans 35 mm boîte de pétri contenant un petit bolus de non-gélifié 1 % agarose low-melting point en E3 (p/v). Rapidement la position de l’embryon latéralement à l’aide d’une ligne de pêche fine ou un cil et attendre l’agarose à refroidir. Une fois que l’agarose est ferme, verser suffisamment E3 dans le plat pour couvrir l’agarose. Pour plus de détails, voir Distel et Köster14.
Remarque : Si vous utilisez un microscope inversé, l’embryon peut être placé contre la vitre d’une lamelle couvre-objet-fond en verre plat et photographié avec un standard 20 X lentille de l’objectif. - Utiliser une lentille d’objectif eau immersion 20 x pour visualiser le SOS avec un microscope composé. Après visualisation, doucement tirer l’agarose des embryons et difficulté à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) ou permettre de poursuivre leur développement.
- À 20 hpf, remplacer l’E3 media avec E3 media contenant 0,004 % 1-phényl 2-thiourée (PTU) pour empêcher la production de pigments.
2. protocole 2 : Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine
- Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine : jour 1
- Dechorionate embryons tel que décrit à l’étape 1.2.3, si pas déjà fait. Difficulté des embryons dans un tube de microcentrifuge à la validant désirée dans fraîchement préparés 4 % PFA pendant 2 h sur un agitateur de la température ambiante (22-25 ° C). Laver à 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois.
Remarque : Après la gastrulation, embryons peuvent fixer mieux après dechorionation. - Permeabilize embryons à la protéinase K de 10 mg/mL à la température ambiante pour 5 min. temps d’Incubation dépendra du stade de développement où les embryons sont fixes (voir Thisse et Thisse15).
- Laver à 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois.
- Bloquer les embryons dans une solution de 5 % chèvre sérum et 2 mg/mL sérum albumine bovine (BSA) dans 1xPBST pendant 1-2 h sur un agitateur de la température ambiante.
- Préparer la solution de l’anticorps primaire en diluant des anticorps de lapin anti-laminine dans la solution du bloc à une dilution de 1 : 200.
- Incuber les embryons dans anti-laminin anticorps primaire pendant la nuit sur un agitateur de 4 ° C.
- Dechorionate embryons tel que décrit à l’étape 1.2.3, si pas déjà fait. Difficulté des embryons dans un tube de microcentrifuge à la validant désirée dans fraîchement préparés 4 % PFA pendant 2 h sur un agitateur de la température ambiante (22-25 ° C). Laver à 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois.
- Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine : jour 2
- Laver à 1 x PBST pendant 15 minutes, cinq fois.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant les anticorps de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 dans 1 x PBST à une dilution de 1/1000.
Remarque : Il est possible d’adapter cette étape en fonction des ressources disponibles à l’expérimentateur en utilisant un anticorps secondaire différent. - Incuber les embryons dans l’anticorps secondaire pendant la nuit sur un agitateur de 4 ° C. Protéger autant que possible de cette étape à partir de la lumière.
- Laver à 1 x PBST pendant 15 minutes, quatre fois. Les embryons peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine, si nécessaire.
- Dissection et montage des yeux embryonnaires
- Si vous le souhaitez, placez les embryons dans une petite boîte de Pétri et deyolk les embryons dans 1 x PBST. Cela doucement perturbant le jaune d’oeuf avec une pince fine et éliminer les cellules de jaune d’oeuf par raclage doux du sac vitellin.
- Préparer les concentrations suivantes de solutions série PBS-glycérol dans des tubes de microcentrifuge : 30 %, 50 % et 70 % de glycérol dans du PBS. Transfert des embryons dans 30 % glycérol/PBS, en veillant à placer les embryons sur le dessus de la solution et transférer aussi peu de la solution précédente que possible. Attendez que les embryons à couler au fond du tube.
- Lorsque les embryons ont coulé vers le bas, transférez-les sur 50 % glycérol/PBS. Répéter et transfert à 70 % glycérol/PBS.
- Une fois que les embryons ont sombré dans 70 % glycérol/PBS, déplacez-les vers un petit plat en plastique pour les dissections.
- Rompre l’embryon postérieur pour le cerveau postérieur et utiliser le tissu postérieur pour le génotypage, si nécessaire.
- Déplacer la tête d’une lame de verre, transfert de glycérol peu que possible. Utiliser la pince ou autre outil de dissection fine se pour tenir sur l’extrémité postérieure de garder la tête immobile. Utilisez une épingle fine minutien ou autres outils de dissection fine pour insérer dans le ventricule du cerveau antérieur de la partie antérieure et pousser vers le bas pour séparer les moitiés droite et gauche de la tête de l’autre en douceur. Répétez cette opération tout en se déplaçant vers l’arrière dans le mésencéphale et le ventricule du cerveau postérieur, essentiellement fileting la tête vers le bas de la ligne médiane. Cela minimise la manipulation manuelle de le œil et des tissus environnants, laissant ainsi intact le SOS.
- Montez chaque côté de la ligne de médiane tête vers le bas, yeux vers le haut. Position de quatre postes de graisse sous vide au niveau des coins (une distance appropriée apart pour la lamelle couvre-objet utilisé) et couvrir avec une lamelle de verre, poussant vers le bas dans l’ordre sur chaque borne jusqu'à la lamelle entre en contact avec les échantillons. Pipetter 70 % glycérol au bord de la lamelle couvre-objet pour que le glycérol est tiré sous, remplissant l’espace entre la lamelle et la diapositive.
- Échantillons d’image dans une journée, ou le joint autour de la lamelle couvre-objet avec vernis à ongles et échantillons d’image qu’une fois le vernis à ongles est sèche. Stocker dans l’obscurité à 4 ° C.
3. Protocole n° 3 : Visualisation de SOS utilisant EGFP-Alpha ARNm
- Synthèse de l’ARNm eGFP-Alpha
- Linéariser 1 mg d’Alpha-eGFP-Bureau2 plasmidique16 avec NotI dans un volume réactionnel de 40 mL pour 4 heures à 37 ° C.
- Pour arrêter la réaction de digérer de restriction, ajouter 10 mL de RNase-libre d’eau, 2,5 mL 10 % SDS et 2,0 mL 10 mg/mL protéinase K.
- Incuber 1 h à 50 ° C.
- Ajoutez le code suivant à la réaction (volume total 200 mL) et passez à l’étape suivante : 20 mL 3M sodium acétate pH 5,2 et 75,5 mL exempte de RNase eaux, 50 mL, RNase-libre
Remarque : L’eau exempte de RNase est ajouté à deux reprises afin d’éviter une dilution excessive de l’acétate de sodium.
- Purification de l’ADN par l’intermédiaire de précipitation d’extraction et d’éthanol de phénol/chloroforme
- Ajouter 200 mL d’alcool de phénol : chloroforme : isoamylique et vortex pour 20 s. séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation à 18 000 x g pendant 5 min.
- Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge, en veillant à éviter le passage de la couche organique de fond. Ajouter un volume égal de chloroforme dans le nouveau tube.
Remarque : L’ajout de chloroforme est facultatif, mais il est recommandé d’assurer le retrait complet de phénol de l’échantillon. - Vortexer pendant 20 s. séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation à 18 000 x g pendant 5 min.
- Comme avant, transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge, en veillant à éviter le passage de la couche organique de fond.
- Ajouter 1/10 volume d’acétate de sodium 3M pH 5,2.
- Précipiter l’ADN en ajoutant 3 volumes de 100 % exempt de RNase éthanol et refroidissement à-20 ° C pendant 15 min. centrifuger à 18 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Un culot doit être visible. Décanter le liquide surnageant.
- Laver le culot avec 100 mL d’eau froide de l’éthanol/RNase-libre de 70 %. Après le mélange doucement pour détacher le culot, centrifuger à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Un culot doit être visible. Décanter le liquide surnageant.
- Sécher le culot pendant 5 min et remettre en suspension l’ADN dans 7 mL d’eau.
Remarque : Le culot devrez peut-être être séchés pendant plus de 5 min selon le débit d’air disponible.
- Transcription et purification d’ADN messagère eGFP-Alpha
- D’une manière sans RNase, préparer une réaction de transcription in vitro avec un kit de polymérase ARN Sp6 disponible dans le commerce, à l’aide d’environ 1 mg de plasmide linéarisé purifiée ADN obtenu à l’étape 3.2. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
NOTE : L’ARN polymérase Sp6 doit être utilisé pour la production d’ARNm plafonnés. - Ajouter 1 mL de DNase (2 U/mL ; RNase librement) et incuber 30 min à 37 ° C.
- Purifier les ARNm avec n’importe quel kit de purification d’ARN disponible dans le commerce. Aliquote l’ARNm pour éviter le gel-dégel répété et conserver à-80 ° C.
- D’une manière sans RNase, préparer une réaction de transcription in vitro avec un kit de polymérase ARN Sp6 disponible dans le commerce, à l’aide d’environ 1 mg de plasmide linéarisé purifiée ADN obtenu à l’étape 3.2. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
- Injection et visualisation
- Obtenir des embryons comme indiqué au point 1.1 du protocole.
- En utilisant un appareil de microinjection, injecter 300 pg d’ADN messagère eGFP-Alpha au stade 1 cellule.
- Écran pour les embryons avec l’expression lumineuse d’eGFP dans les yeux à l’aide d’un stéréoscope de fluorescence.
- Les embryons d’image tel que décrit dans le protocole 1.2.
- Alternativement, les dechorionate et les embryons de fixer à la validant désirée dans 4 % PFA pendant 4 heures à température ambiante ou pendant la nuit à 4° C. Lavez les embryons dans 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois et dechorionate, si pas déjà fait. Disséquer les yeux et les monter sur des lames comme décrit au point 2.3 de protocole.
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Representative Results
Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive8. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible8. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à dissection et imagerie DIC comme une ligne mince dans l’oeil dorsale qui sépare les moitiés nasales et temporale de la rétine en développement (Figure 1). En outre, une échancrure subtile peut-être être visible dans la limite dorsale de l’oeil (Figure 1). Après coloration par immunofluorescence de laminine, la ligne mince peut être confirmée à la membrane basale (Figure 1).
Afin d’examiner les voies moléculaires résultant en retard fermeture de SOS, nous avons choisi d’observer les embryons à 28 hpf car c’est un validant qui est suffisamment éloignée de l’heure de clôture normale de SOS et, par conséquent, un marqueur fiable de retard fermeture SOS en raison expérimentale manipulations. Grâce à une visualisation directe du poisson-zèbre de hpf 28 sous le microscope à dissection, il est possible d’évaluer le retard de fermeture de SOS en raison de la manipulation expérimentale. Lorsque la fermeture de SOS est retardée, sa présence prolongée peut être considérée comme une fente prononcée dans la face dorsale de le œil sous le microscope à dissection (Figure 2). Observés au microscope composé utilisant optique DIC ou Nomarski, cette fonctionnalité n’est plus visible, et les côtés nasales et temporelles de le œil sont séparées par le SOS, qui est clairement visible, comme une ligne dans l’oeil dorsal (Figure 3).
Le SOS est bordée de composants de la lame basale, y compris la laminine. Par conséquent, l’immunofluorescence fournit une méthode complémentaire d’évaluation fermeture SOS dans des embryons de fixes. Lorsque l’oeil embryonnaire d’une vue latérale de l’imagerie, la lame basale délimite la marge extérieure de le œil, les fissures oculaires et la frontière entre le cristallin et la rétine (Figure 4). Le SOS est orientée directement en face de la fissure choroïde dans l’aspect dorsal de le œil. Embryons entiers peuvent être montés latéralement, avec une clarté optique un peu mieux réalisée si les yeux sont déjà microdissected. Par 28 hpf, chez le poisson zèbre de type sauvage, laminine coloration démontre clairement que le SOS est complètement fermé, ce qui en fait l’étape idéale pour la surveillance des retards dans la fermeture de la fissure.
Injection d’Alpha-eGFP ARNm permet la visualisation de la membrane cellulaire d’un embryon vivant ou fixe (Figure 5). Injection de succès stade unicellulaire est suffisante pour produire des embryons avec la fluorescence de la membrane de la cellule complète. Dans la vue latérale, tous les cellulaires doit être délimitée par une fluorescence GFP, et à ce titre, on observe clairement la morphologie cellulaire. Cela permet la visualisation des changements morphologiques aux cellules qui conduisent à la fermeture de SOS.
Figure 1 : Observation de SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal. Des embryons de poisson-zèbre ont été recueillies et imagés à 22 hpf. A-B. Vue latérale de 22 embryons hpf vivre imagés avec le microscope à dissection (A) et par l’intermédiaire de DIC imaging (B), respectivement. Le SOS est marquée par un astérisque rouge. C. laminine immunofluorescence d’un embryon de hpf 22. Les embryons ont été fixés à 4 % PFA et obtenu pour toute monture immunofluorescence de laminine. Les embryons ont été fileted et montés en 70 % glycérol/PBS. Seule tranche images ont été obtenues par le biais de l’imagerie confocale avec un logiciel. Le SOS est marquée par un astérisque blanche. Tous les chiffres ont été annotées et assemblés à l’aide du logiciel Adobe Illustrator. Barres d’échelle représentent 50 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : images de microscope de retard fermeture SOS chez les larves de poisson zèbre de dissection. Les embryons de type sauvage et gdf6a- / - ont été recueillis et imagés vivent à 28 hpf. A. vue latérale sur un embryon de type sauvage avec un SOS fermé. B. latérale vue d’un embryon de gdf6a- / - avec un retard de fermeture de SOS (astérisque). Une forte dépression est observable dans l’aspect dorsal de le œil en raison de l’échec du re de fermer correctement. Barres d’échelle représentent 50 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : images représentant DIC du re dans l’oeil embryonnaire zebrafish. Les embryons de type sauvage et gdf6a- / - ont été recueillis, anesthésiés et placés latéralement dans 1 % Ultrapure agarose low-melting point dans E3 sur une boîte de pétri de 35 mm. Le plat était rempli d’E3, et un microscope composé avec un 20 x objectif à pendage vers l’eau a été utilisé pour l’imagerie de la DIC. A. vue latérale sur un embryon de type sauvage avec un SOS fermé. B. latérale vue d’un embryon de gdf6a- / - avec un retard de fermeture de SOS (astérisque). Le SOS est observable comme une ligne mince dans l’aspect dorsal de le œil. Barres d’échelle représentent 50 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : images représentatives de laminine immunofluorescence souillant en œil de poisson-zèbre embryonnaires. Les embryons de type sauvage et gdf6a- / - ont été recueillies et fixés à 4 % PFA à 28 hpf. La lame basale a été immunomarquées, et les embryons étaient fileted et montés dans 70 % de glycérol/PBS pour l’imagerie confocale. Seule tranche images ont été obtenues à l’aide de logiciels de ZEN. A. vue latérale sur un embryon de type sauvage avec un SOS fermé. B. latérale vue d’un embryon de gdf6a- / - avec un retard de fermeture de SOS (astérisque). La lame basale est montrée décrivant l’oeil en vert, avec le re visible dans la partie dorsale de l’oeil chez les embryons de- / - gdf6a. Barres d’échelle représentent 50 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : imagerie de l’oeil de poisson-zèbre embryonnaire après injection d’ARNm eGFP-Alpha. Les embryons de type sauvage ont été injectés avec 300 pg d’ADN messagère eGFP-Alpha au stade 1-cellules. À 22 hpf et 28 hpf, respectivement, les embryons ont été anesthésiés et montées latéralement dans 1 % Ultrapure agarose low-melting point dans E3 sur une boîte de pétri de 35 mm. Un microscope confocal avec un 20 x objectif à pendage vers l’eau a été utilisé pour l’imagerie, et seule tranche images ont été obtenues à l’aide d’un logiciel. A. vue d’un embryon de gdf6a- / - 22 latérale hpf avec un SOS ouvert visible (astérisque). B. grande panneaux d’un embryon de gdf6a- / - 22 hpf. C. vue latérale d’un embryon de gdf6a- / - 28 hpf avec une fermeture de SOS retarder. D. agrandie panneaux d’un embryon de gdf6a- / - 28 hpf. Barres d’échelle représentent 50 mm et 10 mm en panneaux A et C et B et D, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.
Ces techniques de visualisation peuvent servir en conjonction avec une variété de techniques de manipulation génétique pour étudier les effets d’inhibition ou d’induire l’expression de certains gènes d’étudier leur rôle dans la fermeture du re. Nous avons choisi de montrer ces protocoles utilisant des embryons gdf6a- / - que nous avons précédemment montré que sa perte peut affecter la bonne fermeture du re, mais les protocoles peuvent être utilisés pour étudier les effets de la manipulation de l’expression d’un gène comme Obligatoire. Il est recommandé que les modifications morphologiques à l’oeil dorsal sont étudiées préalablement avec les observations en utilisant le microscope à dissection. Les autres techniques doivent être utilisés une fois un premier lien établi définitivement, car ils sont plus long et plus faible débit.
Alors que les protocoles peuvent être facilement modifiés en fonction des besoins de l’expérimentateur, il y a plusieurs aspects qui doivent être suivies avec attention. En raison du caractère transitoire de cette structure, il est impératif de garantir le respect que tous les embryons sont de la même étape du développement. Pour notre travail, nous jugeons important pour ne permettre qu’une petite fenêtre de temps de reproduction et périodiquement trier les embryons au cours du développement précoce. L’étape la plus importante d’égalisation des stades est à 20 hpf, quand vous pouvez compter toujours exactement somites (24)17, et nous trouvons cela est beaucoup plus fiable que les caractéristiques de mise en scène qui délimitent le temps à 28 hpf. En outre, la pigmentation doit être inhibée ou retirée pour assurer le succès visualisation de la structure. Nous avons observé la pigmentation de l’oeil commence à lancer environ 22 hpf, et il existe un modèle de pigmentation de l’oeil dorsal qui peut interférer avec la bonne visualisation du re. Par conséquent, il est fortement recommandé pour traiter les embryons avec PTU avant pigmentation pour visualisation réussie. En outre, dissection de l’oeil embryonnaire avant le montage de la lame sans causer de dommages exige peu de pratique. Il est également impératif de monter latéralement les yeux aussi parallèles que possible à la diapositive. Il est recommandé que l’expérimentateur pratiques ces techniques avec des embryons supplémentaires avant l’expérience.
À l’exception de l’immunofluorescence de la lame basale, tous les protocoles décrits ici peuvent être complétées à l’aide des embryons vivants. Cela permet la visualisation continue du re tout au long du début de l’embryogenèse, ce qui permet de l’expérimentateur de mener des études accélérés des changements morphologiques impliqués dans la fermeture du re. Dans le passé, nous avons utilisé des transgènes de rétine spécifiques, tels que Tg(rx3:eGFP), qui marque la rétine neurale au début du développement. Mais il lui manque la possibilité de visualiser des membranes cellulaires, l’utilisation de Tg(rx3:eGFP) a l’avantage de ne pas nécessiter de microinjections et a été notre principal moyen de visualiser les changements morphologiques bruts à l’architecture de SOS en temps réel. Ce protocole n’a pas été inclus ici, comme des méthodes semblables ont été discutés auparavant dans ce journal18,19. Cependant, enquête de base biologique cellule de formation de SOS et fermeture nécessitera des protéines fluorescentes de la membrane. Plus précisément, l’injection d’ADN messagère eGFP-Alpha permet la visualisation de la membrane cellulaire autour de la SOS comme on le voit à la Figure 5, qui nous permet d’étudier la dynamique des changements de forme de cellules dans le œil dorsale qui sont nécessaires à la bonne fermeture de SOS. EGFP-Alpha peut être utile pour l’exécution en direct-imagerie de la fermeture de SOS, il est rendu difficile par la présence de la couche enveloppante chez le poisson zèbre. En outre, il faut lors de l’analyse des résultats des injections d’ARNm car elle peut entraîner un mosaïcisme, rendant difficile de comparer directement les embryons basées sur la quantification de la force d’expression eGFP. Cela pourrait être amélioré grâce à l’utilisation des lignes zebrafish transgénique fluorescent étiqueter les membranes cellulaires plus précisément dans la rétine en voie de développement, tels que Tg(vsx2.2:GFP-caax).
Un des défis de nos protocoles se trouve avec un traitement qui n’est pas entièrement par ressuage. Nous avons noté précédemment que les retards SOS peuvent être vu dans environ 10 % des embryons témoins à 28 hpf8, et cette présence sous-jacente d’embryons avec un SOS au sein d’un groupe expérimental donné pourrait rendre difficile d’observer des effets subtils d’expérimentale manipulation. Cela pourrait être résolu en aveuglant l’expérimentateur pour réduire le biais de l’expérimentateur et en augmentant le nombre d’embryons utilisés au sein de chaque groupe expérimental afin d’augmenter la puissance de l’expérience. En outre, le stade de l’analyse pourrait être décalé sur hpf 29-30.
Avec cet ensemble de protocoles, nous cherchons à normaliser le moyen grâce auquel les retards fermeture SOS sont visualisées. Les techniques décrites ci-dessus ont été avérés fiable dans la détection et la visualisation des retards fermeture SOS dans une variété de configurations expérimentales et peuvent être adaptés aux besoins de l’expérimentateur. Alors que nous avons utilisé des techniques comme l’analyse au microscope électronique ou time-lapse imagerie d’embryons transgéniques pour visualiser le SOS en détail, notre objectif ici est de créer un ensemble normalisé de protocoles qui se prêtent bien à haut-débit expérimental dessins de visualiser un grand nombre d’embryons en une seule journée en mettant l’accent sur la capacité de marquer des phénotypes retard fermeture. En plus de son utilisation avec des embryons de gdf6a- / - , nous avons pu observer des phénotypes de retard fermeture SOS à l’aide de ces techniques de visualisation, aux côtés de traitements pharmacologiques, morpholino injections et études de la surexpression de RNA. Comme le rôle du re dans le développement de le œil est élucidé promouvoir par le biais de divers moyens, nous espérons que cette série de protocoles normalisés permettre à la communauté scientifique un langage commun à travers lequel on étudie cette nouvelle structure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt en conflit de déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG), Alberta Innovates Technology Futures et les femmes et Health Research Institute (WCHRI enfants).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
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