Summary
Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.
Abstract
Coloboma oculare congenita è una malattia genetica che si osserva tipicamente come una fenditura nella funzione inferiore dell'occhio derivanti dalla chiusura della fenditura coroidico incompleta. Recentemente, l'identificazione degli individui con il coloboma in funzione superiore dell'iride, retina e lente ha portato alla scoperta di una nuova struttura, indicato come la fenditura superiore o superiore del solco oculare (SOS), che è transitoriamente presente sulla dorsale aspetto della Coppa ottica durante lo sviluppo dell'occhio dei vertebrati. Anche se questa struttura è conservata in topi, pulcino, pesce e newt, nostra attuale comprensione di SOS è limitato. Per chiarire i fattori che contribuiscono alla sua formazione e chiusura, è indispensabile essere in grado di osservare e identificare le anomalie, quali ritardo nella chiusura di SOS. Qui, abbiamo deciso di creare una serie standardizzata dei protocolli che può essere utilizzato per visualizzare in modo efficiente il SOS combinando tecniche di microscopia ampiamente disponibili con comuni tecniche di biologia molecolare come macchiatura immunofluorescente e mRNA sovraespressione. Mentre questo set di protocolli si concentra sulla capacità di osservare ritardo chiusura SOS, è adattabile alle esigenze dello sperimentatore e possono essere facilmente modificato. Nel complesso, ci auguriamo di creare un metodo accessibile attraverso il quale la nostra comprensione di SOS può essere avanzato per espandere le conoscenze attuali di sviluppo dell'occhio dei vertebrati.
Introduction
La formazione dell'occhio dei vertebrati è un processo altamente conservato in cui vie di segnalazione intercellulare attentamente orchestrate stabilire i tipi di tessuto e specifica identità regionale1. Perturbazioni alla morfogenesi occhio presto causare difetti profondi all'architettura dell'occhio e sono frequentemente accecante2. Una tale malattia deriva dall'impossibilità di chiudere la fessura oculare coroidico nella parte ventrale della Coppa ottica3. Questo disturbo, noto come coloboma oculare, è stimato in 1 su 4-5000 nati vivi e causa 3-11% di cecità pediatrica, che si manifesta comunemente come una buco della serratura-come la struttura che sporge inferiorly dalla pupilla al centro dell'occhio4, 5,6. La funzione della fenditura coroidico è di fornire un punto di ingresso per primi sistema vascolare in crescita nella tazza ottica, dopo di che i lati della fenditura fonderanno per racchiudere le navi7.
Mentre coloboma oculare è stata conosciuta fin dai tempi antichi, recentemente abbiamo identificato un sottogruppo romanzo di coloboma pazienti con perdita di tessuto che interessano la funzione superior/dorsale dell'occhio. Lavoro recente nel nostro laboratorio ha portato alla scoperta di una struttura oculare nell'occhio dorsale di zebrafish, che noi definiamo il solco superiore oculare (SOS) o fenditura superiore8. È importante notare che la struttura ha le caratteristiche di un solco e di una fessura. Simile a un solco, è uno strato di tessuto continuo che si estende dal nasale alla retina temporale. Inoltre, la chiusura della struttura non è mediata da una fusione tra i due opposti della membrana dello scantinato, e sembra che richiedono un processo morfogenetico da cui la struttura è popolata dalle cellule. Tuttavia, simile a una fenditura, forma una struttura che separa il lato nasale e temporale dell'occhio dorsale con la membrana dello scantinato. Per coerenza, si farà riferimento ad esso come SOS in questo testo.
Il SOS è evolutivamente conservato in vertebrati, essendo visibile durante la morfogenesi di occhio di pesce, pulcino, newt e mouse8. In contrasto con la fenditura coroidico, che è presente da 20-60 ore post-fertilizzazione (hpf) in zebrafish, il SOS è altamente temporaneo, essendo facilmente visibile da 20-23 hpf e assente da 26 hpf8. Recenti ricerche nel nostro laboratorio ha trovato che, simile alla fenditura coroidico, il SOS svolge un ruolo nell'orientamento vascolare durante occhio morfogenesi8. Anche se i fattori che controllano la formazione e la chiusura di SOS ancora completamente non sono capiti, i nostri dati ha fatto evidenziare ruoli per dorso-ventrale occhio patterning geni8.
Zebrafish è un organismo modello eccellente per studiare il SOS. Come sistema modello, fornisce una serie di vantaggi a studiare lo sviluppo dell'occhio: si tratta di un modello di vertebrati; ogni generazione esibisce alta fecondità (~ 200 embrioni); il suo genoma è stato completamente sequenziato, che facilita la manipolazione genetica; e circa il 70% dei geni umani hanno almeno un ortologo di zebrafish, rendendolo un ideale modello basato su genetica di malattia umana9,10. La cosa più importante, lo sviluppo avviene esternamente alla madre, e le sue larve sono trasparenti, che consente la visualizzazione dell'occhio in via di sviluppo con relativa facilità11.
In questa serie di protocolli, descriviamo le tecniche attraverso le quali il SOS possono essere visualizzati nelle larve di zebrafish. La varietà di tecniche di visualizzazione utilizzati in questo report vi permetterà chiara osservazione di SOS durante lo sviluppo normale dell'occhio, così come la capacità di rilevare difetti di chiusura SOS. I nostri protocolli di esempio saranno caratterizzato da indagini di Gdf6, un BMP localizzate alla dorsale occhio e noto regolatore di chiusura SOS. Ulteriormente, queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la chiusura e la corretta formazione di SOS. Inoltre, abbiamo incluso un protocollo attraverso il quale è possibile, l'imaging fluorescente di tutte le membrane cellulari permettendo lo sperimentatore ad osservare i cambiamenti morfologici per le celle circostanti il SOS. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un insieme di protocolli standardizzati che può essere utilizzato in tutta la comunità scientifica per offrire nuove prospettive in questo romanzo struttura dell'occhio in via di sviluppo.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Alberta Animal Care e Comitato di uso.
1. protocollo 1: Visualizzazione di SOS utilizzando stereomicroscopia e imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza
- Raccolta degli embrioni
- In un serbatoio di acqua declorurata, preparare croci di zebrafish gdf6a+ /- nella sera, abbinando un zebrafish maschio con una femmina zebrafish. Assicurarsi di separare il maschio dalla femmina con un divisore per garantire che gli embrioni sono nato in un piccolo intervallo di tempo.
- La mattina seguente, tirare il divisore e consentire il danio zebrato ad allevare per non più di 30 min. raccogliere gli embrioni in capsule di Petri con E3 media, descritto in The Zebrafish libro12e metterli in un'incubatrice di 28,5 ° C.
- Rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti, che appariranno bianco e opaco.
- Preparazione e live-imaging di embrioni di zebrafish
- Alle 20 hpf, Sostituisci l'E3 media con E3 media contenente 0,004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la produzione di pigmento.
Nota: Aggiunta di PTU ad un determinato timepoint leggermente più tardi, ad esempio hpf 22-24, è improbabile che interferiscono con l'esperimento a causa dell'età precoce degli embrioni al momento di formazione immagine. Tuttavia, si consiglia di trattare gli embrioni presto per prevenire completamente la pigmentazione come c'è una banda di pigmentazione che appare nell'occhio dorsale, che può interferire con l'imaging di SOS. - Assicurarsi che tutti gli embrioni siano corrette fasi di sviluppo in vari punti che conducono al momento dell'osservazione. È consigliabile che ciò avvenga nelle fasi alle quali somite numero è chiaramente visibile come delineato da Kimmel et al.13. Rimuovere quelli che sono evolutivamente immaturo.
- Posizionare gli embrioni sotto un microscopio per dissezione e dechorionate gli embrioni tirando delicatamente il corion utilizzando una pinzetta. Visualizzare il SOS nell'occhio dorsale. Il SOS può apparire come un rientro al margine dorsale dell'occhio, e una linea deve essere visibile attraverso l'occhio dorsale. Per la normale chiusura di SOS, osservare gli embrioni a intorno a 20-23 hpf. Per l'esame dei fenotipi di chiusura ritardati SOS, osservare gli embrioni a 28 hpf o versione successiva.
- Ordinare gli embrioni che mostrano ritardo chiusura SOS da quelli che non lo fanno.
- Per fotografare questi embrioni utilizzando un microscopio per dissezione, preparare una piastra Petri contenente 1% di agarosio in E3. Pungere leggermente il centro di agarosio per creare un buco poco profondo in cui il tuorlo dell'embrione può sedersi quando l'embrione viene collocato su agarosio. Questo assicurerà che l'embrione non è in un angolo obliquo, quando essere fotografati.
- Anestetizzare gli embrioni con tricaina 0,003% in E3 e posto lateralmente su agarosio.
- Per realizzare l'immagine gli embrioni utilizzando un microscopio confocale o composto, trasferire l'embrione in 35mm di Petri contenente un piccolo bolo di non gelificato basso punto di fusione punto agarosio all'1% in E3 (w/v). Posizionare l'embrione lateralmente usando una linea di pesca bene o un ciglio e attendere l'agarosio raffreddare rapidamente. Una volta che l'agarosio è ferma, versare abbastanza E3 il piatto per coprire l'agarosio. Per ulteriori dettagli, vedere Distel e Köster14.
Nota: Se si usa un microscopio invertito, l'embrione possa essere collocata contro il vetro di un piatto fondo-vetrino coprioggetto in vetro e imaged con un standard 20x lente obiettiva. - Utilizzare un obiettivo di acqua immersione 20 x per visualizzare il SOS con un microscopio composto. Dopo la visualizzazione, delicatamente tirare l'agarosio da embrioni e difficoltà in paraformaldeide al 4% (PFA) o consentono di continuare il loro sviluppo.
- Alle 20 hpf, Sostituisci l'E3 media con E3 media contenente 0,004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la produzione di pigmento.
2. il protocollo 2: Intero-monta macchiatura immunofluorescente della laminina
- Intero-monta macchiatura immunofluorescente di laminina: giorno 1
- Dechorionate embrioni come descritto al punto 1.2.3, se non già fatto. Difficoltà embrioni in un tubo del microcentrifuge a timepoint desiderata in appena fatte 4% PFA per 2 h su un agitatore di temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavare in 1 x PBST per 5 min, quattro volte.
Nota: A seguito di gastrulazione, gli embrioni possono fissare meglio dopo dechorionation. - Permeabilize embrioni in proteinasi di 10mg/mL K a temperatura ambiente per 5 minuti tempo di incubazione dipenderà molto lo stadio di sviluppo in cui gli embrioni sono fissi (vedere Immobilier e Immobilier15).
- Lavare in 1 x PBST per 5 min, quattro volte.
- Bloccare gli embrioni in una soluzione di 5% capra 2 mg/mL e del siero albumina di siero bovino (BSA) in 1xPBST per 1-2 h su un agitatore di temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo anticorpo di coniglio anti-laminina nella soluzione di blocco ad una diluizione di 1: 200.
- Incubare gli embrioni in anticorpo primario anti-laminina durante la notte su un agitatore di 4 ° C.
- Dechorionate embrioni come descritto al punto 1.2.3, se non già fatto. Difficoltà embrioni in un tubo del microcentrifuge a timepoint desiderata in appena fatte 4% PFA per 2 h su un agitatore di temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavare in 1 x PBST per 5 min, quattro volte.
- Intero-monta macchiatura immunofluorescente di laminina: giorno 2
- Lavare in 1 x PBST per 15 min, cinque volte.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo anticorpo di capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 in 1 x PBST a una diluizione di 1: 1000.
Nota: È possibile adattare questo passaggio per soddisfare le risorse disponibili allo sperimentatore utilizzando un anticorpo secondario diverso. - Incubare gli embrioni in anticorpo secondario durante la notte su un agitatore di 4 ° C. Proteggere dalla luce quanto più possibile da questo punto in poi.
- Lavare in 1 x PBST per 15 minuti, quattro volte. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C per fino ad una settimana, se necessario.
- Dissezione e montaggio degli occhi embrionali
- Se lo si desidera, posizionare gli embrioni in un piccolo piatto di Petri e deyolk gli embrioni in 1 x PBST. Eseguire questa operazione delicatamente interrompere il tuorlo con una pinzetta e rimuovendo le cellule di tuorlo attraverso raschiatura mite del sacco vitellino.
- Preparare le seguenti concentrazioni di soluzioni di serie di PBS-glicerolo in microcentrifuga: glicerolo 30%, 50% e 70% in PBS. Trasferire gli embrioni in 30% glicerolo/PBS, assicurandosi di posizionare gli embrioni in cima la soluzione e il trasferimento come poco delle precedenti soluzioni possibili. Attendere che gli embrioni ad affondare verso il basso del tubo.
- Quando gli embrioni hanno affondato alla parte inferiore, è possibile trasferirli al 50% glicerolo/PBS. Ripetere e trasferire al 70% glicerolo/PBS.
- Una volta che gli embrioni hanno affondato nel 70% glicerolo/PBS, spostarli in un piccolo piatto di plastica per le dissezioni.
- Recidere l'embrione posteriore del hindbrain e utilizzare il tessuto posteriore di genotipizzazione, se necessario.
- Spostare la testina di un vetrino, trasferimento come glicerolo piccolo come possibile. Utilizzare pinze o altri strumenti di dissezione bene a trattenere l'estremità posteriore per mantenere ferma la testa. Utilizzare un pin di minutien bene o altri strumenti di dissezione bene delicatamente inserire nel ventricolo del forebrain da anteriore e spingere verso il basso per separare le due metà destra e sinistra della testa da altro. Ripetere questa operazione mentre si muove posteriormente attraverso il mesencefalo e nel ventricolo hindbrain, essenzialmente fileting la testa in giù la linea mediana. Questo riduce al minimo la manipolazione manuale dell'occhio e del tessuto circostante, lasciando intatto il SOS.
- Montare ogni lato della linea mediana testa giù, occhio fino. Posizione di quattro post di grasso per vuoto agli angoli (una distanza appropriata parte per il coprioggetto utilizzato) e coprire con un vetrino coprioggetti, spingendo verso il basso in modo sequenziale su ogni post fino a quando il vetrino coprioggetto entra in contatto con i campioni. Pipettare 70% glicerolo al bordo del coprivetrino affinché il glicerolo è tirato sotto, riempiendo lo spazio tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo.
- Esempi di immagine all'interno di un giorno, o guarnizione intorno il coprioggetto con smalto e campioni di immagine solo dopo che lo smalto si è asciugato. Conservare al buio a 4 ° C.
3. protocollo n. 3: Visualizzazione di SOS utilizzando eGFP-CAAX mRNA
- Sintesi del mRNA di eGFP-CAAX
- Linearizzare 1 mg di plasmidi pCS2-eGFP-CAAX16 con NotI in un volume di reazione di 40 mL per 4 ore a 37 ° C.
- Per interrompere la reazione di digest di restrizione, aggiungere 10 mL RNAsi-libera di acqua, 2,5 mL 10% SDS e 2,0 mL 10 mg/mL proteinasi K.
- Incubare per 1 ora a 50 ° C.
- Aggiungere quanto segue alla reazione (volume totale 200 mL) e procedere al passo successivo: 50 mL RNAsi-libera di acqua, acqua di 20ml 3M sodio acetato pH 5.2 e 75,5 mL RNAsi-libera
Nota: Viene aggiunta acqua RNAsi-libera in due diverse occasioni per prevenire eccessiva diluizione dell'acetato di sodio.
- Purificazione di DNA attraverso la precipitazione di estrazione ed etanolo fenolo/cloroformio
- Aggiungere 200 mL fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e vortexare per 20 s. separato le fasi acquose e organiche attraverso centrifugazione a 18.000 x g per 5 min.
- Trasferire lo strato acquoso superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge, avendo cura di evitare il trasferimento dello strato organico inferiore. Aggiungere un volume equivalente di cloroformio al nuovo tubo.
Nota: Aggiunta di cloroformio è facoltativa, ma è consigliabile per garantire la completa rimozione del fenolo dal campione. - Vortice per 20 s. separato le fasi acquose e organiche attraverso centrifugazione a 18.000 x g per 5 min.
- Come prima, è possibile trasferire lo strato acquoso superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge, avendo cura di evitare il trasferimento dello strato organico inferiore.
- Aggiungere 1/10 di volume di 3 M sodio acetato a pH 5.2.
- Precipitare del DNA con l'aggiunta di 3 volumi di etanolo al 100% privo di RNAsi e freddo a-20 ° C per 15 min. centrifuga a 18.000 x g per 20 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe essere visibile. Decantare il supernatante.
- Lavare la pallina con 100 mL di acqua fredda di etanolo/RNAsi-libera di 70%. Dopo aver mescolato delicatamente per rompere il pellet sciolto, centrifugare a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe essere visibile. Decantare il supernatante.
- Asciugare il pellet per 5 min e risospendere il DNA in 7 mL di acqua.
Nota: Il pellet potrebbe essere necessario essere essiccato per più di 5 min a seconda del flusso d'aria disponibile.
- Trascrizione e purificazione di eGFP-CAAX mRNA
- In un modo privo di RNasi, preparare una reazione di trascrizione in vitro con un kit disponibile in commercio di polimerasi Sp6 RNA, utilizzando circa 1 mg di plasmide linearizzato purificato il DNA ottenuto nel passo 3.2. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
Nota: Sp6 RNA polimerasi deve essere utilizzata per la produzione di mRNA innevate. - Aggiungere 1 mL di dnasi (2 U/mL; RNAsi libera) e incubare per 30 min a 37 ° C.
- Purificare il mRNA con qualsiasi kit di purificazione RNA disponibile in commercio. Aliquota del mRNA per evitare ripetuti di congelamento-scongelamento e conservare a-80 ° C.
- In un modo privo di RNasi, preparare una reazione di trascrizione in vitro con un kit disponibile in commercio di polimerasi Sp6 RNA, utilizzando circa 1 mg di plasmide linearizzato purificato il DNA ottenuto nel passo 3.2. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Iniezione e visualizzazione
- Ottenere gli embrioni come delineato nel protocollo 1.1.
- Utilizzando un apparato di microiniezione, iniettare 300 pg di eGFP-CAAX mRNA nella fase 1-cell.
- Schermo per gli embrioni con la brillante espressione di eGFP negli occhi utilizzando uno stereoscopio di fluorescenza.
- Immagine, gli embrioni come descritto nel protocollo 1.2.
- In alternativa, dechorionate e fissare gli embrioni al timepoint desiderata nel 4% PFA per 4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4° C. Lavare gli embrioni in 1x PBST per 5 min, quattro volte e dechorionate, se non precedentemente fatto. Sezionare gli occhi e montarli sulle diapositive come descritto nel protocollo 2.3.
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Representative Results
Zebrafish SOS appare alle 20 hpf nella retina dorsale presuntiva8. Da 23 hpf SOS transizioni dalla sua architettura stretta iniziale a una vasta rientranza e da 26 hpf non è più visibile8. Pertanto, per esaminare il SOS durante lo sviluppo dell'occhio di zebrafish normale, gli embrioni devono essere osservati fra hpf 20-23. Durante questo periodo, il SOS è osservabile attraverso il microscopio per dissezione e tramite immagini DIC come una linea sottile nell'occhio dorsale che separa le due metà nasale e temporale della retina in via di sviluppo (Figura 1). Inoltre, una rientranza sottile può essere visibile nel contorno dorsale dell'occhio (Figura 1). A seguito di macchiatura immunofluorescente della laminina, la linea sottile può essere confermata per essere la membrana dello scantinato (Figura 1).
Per esaminare le vie molecolari con conseguente chiusura di SOS in ritardo, abbiamo scelto di osservare gli embrioni a 28 hpf come questo è un timepoint che sufficientemente è rimosso dal momento della chiusura normale di SOS ed è, pertanto, un marker affidabile di ritardo chiusura SOS dovuto sperimentale manipolazioni. Attraverso la visualizzazione diretta di 28 hpf zebrafish sotto il microscopio per dissezione, è possibile valutare il ritardo di chiusura SOS a causa di manipolazione sperimentale. Quando è in ritardo chiusura SOS, sua presenza prolungata può essere visto come un cleft pronunciato nella parte dorsale dell'occhio sotto il microscopio per dissezione (Figura 2). Quando osservate al microscopio composto utilizzando ottiche DIC o Nomarski, questa caratteristica è ancora più evidente, e i lati nasali e temporali dell'occhio sono separati da SOS, che è chiaramente visibile come una linea nell'occhio dorsale (Figura 3).
Il SOS è fiancheggiato da componenti di lamina basale, tra cui la laminina. Di conseguenza, macchiatura immunofluorescente fornisce un metodo complementare di valutazione chiusura SOS in embrioni di fissi. Quando l'occhio embrionale da una vista laterale di imaging, la lamina basale delimita il margine esterno dell'occhio, sia oculare fessure e il confine tra la lente e la retina (Figura 4). Il SOS è orientato direttamente di fronte la fessura coroidico nella funzione dorsale dell'occhio. Interi embrioni possono essere montati lateralmente, con un po ' meglio chiarezza ottica raggiunto se gli occhi sono precedentemente microdissected. Da 28 hpf, nello zebrafish wildtype, laminina macchiatura dimostra chiaramente che il SOS è completamente chiuso, che rende questo il palcoscenico ideale per il monitoraggio ritardi nella chiusura della fenditura.
Iniezione di eGFP-CAAX mRNA permette la visualizzazione delle membrane delle cellule di un embrione dal vivo o fissa (Figura 5). Successo un cella fase iniezione è sufficiente a produrre embrioni con fluorescenza completo della membrana cellulare. Nella vista laterale, tutti i confini cellulari dovrebbero essere caratterizzati da fluorescenza GFP, e come tale, morfologia delle cellule è anche chiaramente osservata. Questo permette la visualizzazione delle modifiche morfologiche alle cellule che portano alla chiusura di SOS.
Figura 1: osservazione di SOS durante lo sviluppo dell'occhio di zebrafish normale. Embrioni di zebrafish sono stati raccolti ed imaged 22 hpf. A-B. Vista laterale di 22 embrioni hpf live-imaged con il microscopio per dissezione (A) e via DIC imaging (B), rispettivamente. Il SOS è contrassegnato da un asterisco rosso. C. Laminin macchiatura immunofluorescente di un embrione di hpf 22. Gli embrioni sono stati fissati in 4% PFA e ottenuti per intero-monta la macchiatura immunofluorescente di laminina. Gli embrioni sono stati fileted e montati in 70% glicerolo/PBS. Singola fetta immagini furono ottenute attraverso imaging confocale con un software. Il SOS è contrassegnato con un asterisco bianco. Tutte le figure sono state annotate e assemblati con software Adobe Illustrator. Barre della scala rappresentano 50 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini di ritardo chiusura SOS nelle larve di zebrafish microscopio di dissezione. Wildtype e gdf6a- / - embrioni sono stati raccolti e live-imaged alle 28 hpf. R. vista laterale di un embrione di wildtype con un SOS chiuso. B. vista di un embrione gdf6a- / - con un ritardo di chiusura di SOS (asterisco) laterale. Una forte depressione è osservabile nella funzione dorsale dell'occhio a causa del fallimento di SOS per chiudere in modo appropriato. Barre della scala rappresentano 50 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini di DIC rappresentante di SOS negli occhi embrionali zebrafish. Wildtype e gdf6a- / - embrioni sono stati raccolti, anestetizzati e disposti lateralmente in ultrapura basso punto di fusione punto agarosio all'1% in E3 su una piastra di Petri da 35 mm. Il piatto è stato riempito con E3, e un microscopio compound con un 20x obiettivo a immersione in acqua è stato usato per l'imaging di DIC. R. vista laterale di un embrione di wildtype con un SOS chiuso. B. vista di un embrione gdf6a- / - con un ritardo di chiusura di SOS (asterisco) laterale. Il SOS è osservabile come una linea sottile nella funzione dorsale dell'occhio. Barre della scala rappresentano 50 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini rappresentative di laminin immunofluorescenza colorazione nell'occhio di zebrafish embrionali. Wildtype e gdf6a- / - embrioni sono stati raccolti e risolto nel 4% PFA 28 hpf. La lamina basale era immunostained, e gli embrioni sono stati fileted e montati in 70% glicerolo/PBS per imaging confocale. Singola fetta immagini sono state ottenute utilizzando software ZEN. R. vista laterale di un embrione di wildtype con un SOS chiuso. B. vista di un embrione gdf6a- / - con un ritardo di chiusura di SOS (asterisco) laterale. La lamina basale è mostrata che delinea l'occhio nel verde, con il SOS visibile nella parte dorsale dell'occhio in gdf6a- / - embrioni. Barre della scala rappresentano 50 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging dell'occhio embrionale zebrafish dopo l'iniezione di mRNA di eGFP-caax. Wildtype embrioni sono stati iniettati con 300 pg di eGFP-caax mRNA allo stadio 1-cellule. Alle 22 hpf e 28 hpf, rispettivamente, gli embrioni sono stati anestetizzati e montati lateralmente in ultrapura basso punto di fusione punto agarosio all'1% in E3 su una piastra di Petri da 35 mm. Un microscopio confocale con un 20x obiettivo a immersione in acqua è stato utilizzato per l'imaging, e una sola fetta immagini sono state ottenute utilizzando un software. Vista di un embrione gdf6a- / - 22 laterale r. hpf con un visibile aperto SOS (asterisco). B. allargata pannelli di un embrione gdf6a- / - 22 hpf. C. vista laterale di un embrione gdf6a- / - 28 hpf con una chiusura di SOS ritardare. D. allargata pannelli di un embrione gdf6a- / - 28 hpf. Barre della scala rappresentano 50 mm e 10 mm nei pannelli A, B e C e D, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il SOS nell'embrione di zebrafish sviluppo. Per determinare fenotipi di ritardo di chiusura, i nostri protocolli sono concentrati sulla capacità di distinguere la separazione dei due lobi discreti del lato dorsale-nasale e dorsale-temporale dell'occhio, simile a tecniche utilizzate per visualizzare ritardo chiusura coroidico fenditura fenotipi nell'occhio ventrale.
Queste tecniche di visualizzazione possono essere utilizzate in combinazione con una varietà di tecniche di manipolazione genetica per studiare gli effetti di inibizione o induzione espressione di determinati geni per studiare i loro ruoli nella chiusura di SOS. Abbiamo scelto per illustrare questi protocolli utilizzando embrioni gdf6a- / - come abbiamo in precedenza dimostrato che sua perdita può influenzare la corretta chiusura di SOS, ma i protocolli possono essere utilizzati per studiare gli effetti di manipolare l'espressione di qualsiasi gene come richiesto. È consigliabile che le modifiche morfologiche all'occhio dorsale sono studiate preliminarmente con osservazioni con il microscopio per dissezione. Le altre tecniche devono essere utilizzate una volta che viene stabilito un collegamento iniziale definitivamente, come sono più che richiede tempo e bassa velocità di trasmissione.
Mentre i protocolli possono essere facilmente modificati per soddisfare le esigenze dello sperimentatore, ci sono diversi aspetti che devono essere seguiti attentamente. A causa della natura transitoria di questa struttura, è indispensabile per garantire che tutti gli embrioni sono della stessa fase inerente allo sviluppo. Per il nostro lavoro, troviamo importanti per consentire solo una piccola finestra di tempo di allevamento e di ordinare periodicamente gli embrioni durante lo sviluppo iniziale. Il passo più importante di equalizzazione fasi è alle 20 hpf, quando si può contare ancora accuratamente somiti (24)17, e riteniamo che questo sia molto più affidabile rispetto le caratteristiche di gestione temporanea che delineano tempo 28 hpf. Inoltre, pigmentazione deve essere inibita o rimosso per assicurare una visualizzazione successo della struttura. Abbiamo osservato la pigmentazione nell'occhio comincia a iniziare circa 22 hpf, e c'è un modello della pigmentazione dell'occhio dorsale che può interferire con la corretta visualizzazione di SOS. Pertanto, si consiglia di trattare gli embrioni con PTU prima della pigmentazione per assicurare una visualizzazione successo. Inoltre, la dissezione dell'occhio embrionale prima del montaggio di diapositiva senza causare danni richiede una certa pratica. È anche assolutamente necessario montare lateralmente gli occhi più paralleli possibili alla diapositiva. È consigliabile che lo sperimentatore pratiche queste tecniche con embrioni extra prima dell'esperimento.
Fatta eccezione per la macchiatura immunofluorescente della lamina basale, tutti i protocolli descritti qui può essere completati utilizzando embrioni dal vivo. Questo permette la visualizzazione continua di SOS durante l'embriogenesi precoce, permettendo lo sperimentatore di condurre studi di time-lapse dei cambiamenti morfologici coinvolti nella chiusura di SOS. In passato, abbiamo usato transgeni retina-specifiche, come ad esempio Tg(rx3:eGFP), che segna la retina neurale durante lo sviluppo iniziale. Anche se manca la capacità di prevedere le membrane cellulari, l'uso di Tg(rx3:eGFP) ha il vantaggio di non richiedere microiniezioni ed è stato il nostro metodo principale per visualizzare i cambiamenti morfologici lordi all'architettura di SOS in tempo reale. Tale protocollo non è stato incluso qui, come metodi simili sono stati discussi in precedenza in questa Gazzetta18,19. Tuttavia, indagine di base biologica delle cellule di formazione di SOS e chiusura richiederà fluorescente proteine di membrana. In particolare, l'iniezione di eGFP-CAAX mRNA permette la visualizzazione delle membrane cellulari nei dintorni di SOS come si vede nella figura 5, che ci permette di studiare la dinamica dei cambiamenti di forma delle cellule nell'occhio dorsale che sono necessari per la corretta chiusura di SOS. Mentre eGFP-CAAX può essere utile per l'esecuzione di live-imaging di chiusura SOS, è reso difficile dalla presenza dello strato avvolgente in zebrafish. Inoltre, è necessario prestare attenzione quando si analizzano i risultati dalle iniezioni di mRNA perché può provocare il mosaicismo, rendendo difficile confrontare direttamente gli embrioni basati sulla quantificazione della resistenza di espressione di eGFP. Ciò potrebbe essere migliorata attraverso l'uso di linee di zebrafish transgenici che etichettare fluorescente membrane cellulari specificamente nella retina in via di sviluppo, ad esempio Tg(vsx2.2:GFP-caax).
Una delle sfide dei nostri protocolli si trova con qualsiasi trattamento che non è completamente penetrante. In precedenza abbiamo notato che ritardi SOS possono essere visto in circa il 10% degli embrioni di controllo alle 28 hpf8, e la sottostante presenza di embrioni con un SOS all'interno di un dato gruppo sperimentale potrebbe rendere difficile osservare gli effetti sottili di sperimentale manipolazione. Questo potrebbe essere affrontato da accecante lo sperimentatore per ridurre i pregiudizi sperimentatore e aumentando il numero degli embrioni utilizzati all'interno di ogni gruppo sperimentale per aumentare la potenza dell'esperimento. Inoltre, la fase di analisi potrebbe essere spostata a 29-30 hpf.
Con questo set di protocolli, cerchiamo di standardizzare le modalità attraverso le quali ritardi di chiusura SOS sono visualizzati. Le tecniche sopra descritte hanno dimostrate di essere affidabile nella rilevazione e visualizzazione di ritardi di chiusura SOS in una varietà di impostazioni sperimentali e sono adattabili alle esigenze dello sperimentatore. Mentre abbiamo usato tecniche quali la scansione microscopia elettronica o time-lapse imaging di embrioni transgenici per visualizzare il SOS più dettagliatamente, il nostro obiettivo qui è per creare un set standardizzato di protocolli che sono suscettibili di alto-rendimento sperimentale disegni di visualizzare un gran numero di embrioni in un solo giorno con l'accento sulla capacità di segnare chiusura ritardo fenotipi. Oltre al suo uso con gdf6a- / - embrioni, siamo stati in grado di osservare i fenotipi di ritardo chiusura SOS utilizzando queste tecniche di visualizzazione insieme a trattamenti farmacologici, iniezioni di morpholino e studi di sovraespressione di RNA. Come il ruolo di SOS in sviluppo dell'occhio è stato chiarito ulteriormente attraverso vari mezzi, speriamo che questo set standardizzato di protocolli di fornire alla comunità scientifica un linguaggio comune attraverso il quale è studiato questa nuova struttura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR), scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC), Alberta Innova Technology Futures e donne e salute Research Institute (WCHRI bambini).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
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