Summary
在这里,我们提出了一个协议来描述在大鼠模型中膝关节固定的微创技术。这种可重复的规程,基于肌肉间隙分离方式和微型切口技术,适用于研究获得性关节收缩的基本分子机制。
Abstract
由于长期关节固定,联合收缩是骨科常见的并发症。目前,利用内部固定来限制膝关节运动是一种被广泛接受的产生实验收缩的模式。然而,植入应用将不可避免地对动物造成手术创伤。为了开发一种侵入性较低的方法,我们将肌肉间隙分离方法与先前报道的外科手术过程中的迷你切口技巧相结合:在侧大腿和腿部进行两次迷你皮肤切口,然后进行肌肉间隙分离以暴露骨骼表面。大鼠膝关节通过预构造的内部固定在约135°膝盖弯曲时逐渐固定,而不会干扰必要的神经或血管。不出所料,这种简单的技术允许在动物体内快速进行术后康复。X 射线或微 CT 扫描分析证实了内部固定的正确位置。与在反向膝关节中观察到的运动范围相比,固定膝关节的运动范围受到明显限制,这表明该模型的有效性。此外,组织学分析还揭示了后上级膝关节胶囊纤维沉积和粘连的发展。因此,这种微型侵入性模型可能适合模仿固定膝关节收缩的发展。
Introduction
联合合同被定义为在二甲苯关节1,2的被动运动范围(ROM)的限制。目前旨在预防和治疗关节收缩的疗法取得了一些成功3,4。然而,获得性联合收缩的基本分子机制在很大程度上仍不为人所知。不同社会群体联合收缩的病因差异很大,包括遗传因素、创伤后状态、慢性病和长期不动6。人们普遍认为,不动是发展获得性联合合同的一个关键问题。患有重大联合合同的人最终可能导致身体残疾8。因此,研究获得性联合收缩的潜在病理生理学机制,需要一个稳定、可重复的动物模型。
目前构建的固定诱导膝关节收缩模型主要通过使用非侵入性石膏铸造、外部固定和内部固定来实现。渡边等人9日报告说,在大鼠膝关节上使用石膏石膏固定的可能性。通过穿一件特殊的夹克,大鼠下肢关节的一侧被石膏固定。大鼠膝关节可以保持完全弯曲,没有任何手术创伤10,11。然而,髋关节和踝关节运动也受到这种形式的固定的影响,这可能增加四头肌女性或胃肠12的肌肉萎缩程度。此外,必须通过在设定的时间点更换铸件来避免后肢水肿和充血,这可能会影响不动的连续性。另一种公认的建立膝关节收缩模型的方法是使用外部手术固定。Nagai等人将基什内尔线和钢丝组合成一个外部固定器,将膝关节固定到大约140°的弯曲13。在此方法中,树脂用于覆盖表面以防止皮肤划痕。虽然外部固定固定是健壮和可靠的14,15,皮皮基什内尔线针轨道可能会增加感染的风险16。根据我们自己的经验,使用外部固定技术可能会减少大鼠的日常活动,由于条件舔行为的增加。
另外,Trudel等人描述了一种基于手术内固定17(这种方法从埃文斯和同事18使用的一种方法修改)的在大鼠膝关节中公认的联合收缩模型。值得注意的是,这种方法突出了利用小切口技术尽量减少手术伤口的重要性。联合合同的有效开发已在该模型19中得到证明。然而,关于如何进行最小解剖以暴露骨骼表面的协议仍不清楚20。此外,螺钉钻孔的精确位置尚未完全了解。通过皮下或下肌肉方式植入内部固定仍然是有争议的21。为了解决这些问题,我们修改了这种方法,包括适当的肌肉间隙分离MOD,它允许骨表面的微侵入性暴露和通过肌肉下通道的植入位置。该协议导致大鼠术后快速康复。动物在关节固定后形成有限的关节运动范围,这与组织学分析获得的帽状粘附的形态变化一致。我们还描述了通过 X 射线分析或微 CT 分析确认的钻孔螺钉的确切可能位置。因此,本研究旨在详细描述膝关节收缩模型中的微创技术,该模型由肌肉间隙分离方法与微型切口方法相结合。我们认为,微创技术既能减少动物创伤,又能有效模拟关节弯曲收缩的病理过程。
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Protocol
所有程序均按照《实验室动物护理和使用指南》进行,并经中山大学第三附属医院动物护理和使用委员会批准(许可号:02-165-01)。所有的动物实验都是按照"到达"指南进行的。
1. 术前准备
注:图1显示了外科手术的设计。
- 用塑料板和两个金属螺钉在大约 135° 弯曲处硬固定膝盖接头。
注:在不违反关节成分的情况下,在近股骨和远端骨质进行手术。 - 准备用于内部固定的材料和仪器。
- 使用手术剪刀切割5 mL注射器(图2a),以适合以下尺寸,形成医疗级聚丙烯塑料板:长度25毫米;宽度,10毫米;厚度,1 毫米 (图 2b)。用手术刀垂直平滑板的周长。用无菌盐水冲洗盘子,将碎屑冲洗三次。
- 用75%乙醇消毒4小时,然后用紫外线照射3小时。
- 塑料板上的预钻孔:准备一个手持式低速电钻,转速约为0-4000rpm(图2c)。在板的两端钻两个孔,直径分别为1毫米和0.9毫米(图2d)。将板的两端分别与 M 1.4 mm x 8 mm 和 M 1.2 mm x 6 mm 钢螺钉匹配(图 2e)。
- 使用 75% 乙醇擦拭,使用前用紫外线消毒 3 小时。
- 使用手术剪刀切割5 mL注射器(图2a),以适合以下尺寸,形成医疗级聚丙烯塑料板:长度25毫米;宽度,10毫米;厚度,1 毫米 (图 2b)。用手术刀垂直平滑板的周长。用无菌盐水冲洗盘子,将碎屑冲洗三次。
- 准备手术器械:1个直蚊子型止血钳,1个光滑弯曲钳子,2个眼睑缩子,1个针架,1个组织钳,1个缝合剪刀,1个微型组织剪刀和1个手术刀(图2f)。通过高压灭菌在121.3°C下消毒手术器械20分钟并干燥。
- 实验动物
- 使用特定无病原体 (SPF) 级骨骼成熟雄性斯普拉格-道利(或威斯塔)大鼠,在实验中重量在 250 - 350 g 之间。
注:选择雌性或雄性大鼠进行实验。 - 将大鼠关在笼子里,放在12小时光/12小时暗循环控制的实验室中。提供足够的食物和水。
- 使用特定无病原体 (SPF) 级骨骼成熟雄性斯普拉格-道利(或威斯塔)大鼠,在实验中重量在 250 - 350 g 之间。
2. 外科
- 调节温度。在恒温手术室的手术平台上放置一个加热垫。
- 麻醉和皮肤制剂
- 用电子秤和记录对老鼠进行称重。
- 抑制大鼠,进行五巴比妥钠(30毫克/千克)的腹内注射,以诱导麻醉。评估动物是否充分麻醉使用脚趾捏22。用润滑剂管理眼睛,保护角膜在手术过程中不干燥。
- 用电动钳子将大鼠的下半身包括两个后肢切开,用两次的波维酮碘和75%乙醇三次消毒。
- 将大鼠横向放置,用手术窗帘盖住一侧后腿和臀部。
- 再次用波维酮碘消毒手术区。
- 使用微型侵入性技术通过内部固定固定固定膝关节。
注:在操作过程中,用无菌盐水保持切口正确湿润。手术通常需要两个外科医生。- 标记皮肤切口的方向。在股骨大骨的远端,沿着身体表面投影的肌肉间隙绘制一条线,在巨大的侧向和二头肌的阴囊(图3a)。沿着绘图线切开表皮皮肤约 1.5 厘米(图 3b)。
- 用组织钳子模糊地解剖大侧侧和二头肌之间的肌肉间隙,直到股骨轴露出大约1厘米的长度(图3c)。使用缩回器促进肌肉间隙的连续分离。
- 切开表皮皮肤大约1厘米沿身体表面投影的肌肉间隙之间的前肢和纤维龙在远端下肢(图3d)。模糊解剖肌肉间隙,直到头骨暴露约1厘米的长度(图3e)。
- 通过伸缩器和光滑的钳子分离软组织,保持垂直,并使用电钻以 1,500 rpm 的速度钻一个直径为 1.0 mm 的孔(图 3f)。正确的钻孔位置大约在较大钻头的下边缘下方 8 mm。快速按压伤口止血。
注:适当的钻孔直径可以避免术中骨折。 - 钻一个直径为0.9毫米的孔到tibia大约4毫米以下的tibiofular聚变的边缘(图4a)。仔细进行钻孔,以防止肌肉或肌腱被压碎。
- 使用直蚊子型止血夹形成从头骨孔到股骨孔的亚肌肉过程。亚肌肉隧道通过在头骨末端的胃肠下,在谷胱甘肽上方,在股骨端的二头肌下。
- 使用一个 M 1.4 mm x 8 mm 钢螺钉将塑料板的一端(直径为 1.0 mm 的孔)固定在近端股骨上(图 4b)。使用一个 M 1.2 mm x 6 mm 钢螺钉将塑料板的另一端(直径为 0.9 mm 的孔)固定在远端(图 4c)。确保膝关节无 Varus 畸形。
- 关闭伤口:使用4-0可吸收缝合缝合膜、深筋膜和皮下组织缝合(图4d)。用聚酰胺缝合线关闭皮肤 (图 4f)。
3. 术后管理
- 在0.05毫克/千克下,通过皮下注射布丙诺啡(0.03毫克/升)应用术后性麻醉。手术后5天,将5毫克/mLNeomycin加入饮用水中。
- 在手术后至少72小时内,每天以0.05mg/kg和5mg/kg分授麻醉剂混合物(布丙诺啡和卡罗芬)。
- 检查后肢在血管损伤时是否水肿过。确保大鼠在手术过程中神经损伤时能够正常行走。
4. 术后检查
- 观察手术切口的愈合,并身体检查膝关节,以评估术后每隔一天感染的早期迹象。在持续水肿的情况下检查脚踝和元卡波巴兰关节的肿胀程度。
注:术后早期感染可导致伤口渗出、腿部肿胀和伤口愈合延迟。 - 对后肢进行 X 射线成像,以确保在术后的第一天正确放置螺钉。
注: Micro-CT 扫描分析是显示钢螺钉正确位置和方向的另一种选择。 - 测量被动运动范围(ROM),以评估合同的发展。采取膝关节ROM测量在不同的时间队列术后,如前20所述。
- 简而言之,对大鼠和皮肤的后肢实施安乐死。拆下防盗器并使用机械关节计以两个扭矩(667 或 1,060 g/cm)23 测量膝关节角。
- 根据调查目标24,分别计算总合同、造血收缩和关节性收缩的结果ROM。
注:根据研究目标设置不同的时间队列(即1、2、4、8、16和32周)。反向膝关节(非手术或假手术)可以作为控制2。
- 后膝关节胶囊组织学分析。
- 准备关节组织。解剖膝关节组织,用4%的甲醛固定。去化并嵌入石蜡,如先前报道25。在下垂平面的中孔层处切割截面(5 μm)。
注:选择根据研究目标15,在关节胶囊中为组织学研究执行不同的评估染色,包括HE、醛-富辛-马森-戈德纳(AFMG)、Elastica_Masson或免疫组织化学染色。 26. - 观察后膝关节胶囊的分形变化。拍摄膝关节的后区域。观察纤维沉积和粘附变化之间的糖尿病-synovium结和半月板6。
注:关节胶囊的病理变化被认为是膝关节收缩的致病因素。测量后胶囊的长度、厚度和盖状区域,如前所述,根据研究内容27。
- 准备关节组织。解剖膝关节组织,用4%的甲醛固定。去化并嵌入石蜡,如先前报道25。在下垂平面的中孔层处切割截面(5 μm)。
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Representative Results
我们观察到,接受微创手术的老鼠术后一天就可以恢复正常饮食。特别是,手术切口有疤痕,没有渗出物 (图5a)。与反向侧相比,手术后两天脚踝和元卡波巴兰关节的肿胀几乎完全消失(图5b)。在大鼠身上没有发现早期感染的迹象。大鼠可以站立和锻炼(图5d)。手术伤口在术后的第十二天完全愈合(图5)。
从视觉上看,固定膝盖关节在四周的固定后收缩,而小侵入性手术对反向肢体没有明显影响(图6a)。X射线图像显示钢螺钉在股骨或头骨(图6b)中的正确位置,尽管它没有显示塑料板的位置。我们还采用了高分辨率微CT扫描仪来成像固定下肢。3D重建分析表明,螺钉是横向钻孔的(图6c)。钻井位置大约在近股骨处大骨质器下边缘下8毫米,在远端骨质聚变边缘(图6c)的正下方(约4毫米)处。
我们分别在两次(28天和56天)结束时测量了6只大鼠,以比较固定膝关节和跨关节肌肉20肌tomtom后逆侧关节的ROM缺陷。反向膝关节(非手术)用作控制。在28天的固定后,延长ROM的平均关节缺陷为29.4 ± 3.3°的固定膝关节,明显高于控制(4.8 × 2.8°, P< 0.05)。在固定过程中,ROM中的关节性缺陷以时间依赖的方式增加,固定膝关节的平均关节缺陷为40.7 ± 4.3°,明显高于对照下56天11.2 ± 3.8°固定 (p < 0.05) (图 7)。
使用弹性-马森-染色,我们分析了后上级膝关节胶囊在三个点。在第一天的固定,在后方-高级关节胶囊和股骨在固定或反向侧膝关节的关节空间内未观察到粘附(图8a,d)。然而,我们观察到,在28天的固定后,在关节空间中沉积了纤维脂肪组织,并出现了粘附(图8e)。纤维组织甚至在56天的固定后部分取代了这种沉积(图8f),而这种附着力在不同的时间点在逆边侧没有观察到(图8a,b,c)。
图1:膝关节侧视图的横向图,在弯曲135°处内固定。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:将聚丙烯塑料板设计成内部固定板。(a-b)从注射器上分离了一个聚丙烯塑料板。虚线表示近似的板范围。该板的尺寸如下:长度,25 mm;宽度,10毫米;厚度,1 毫米。 (c) 手持电钻的照片。(d) 板的两端直径为0.9毫米和1.0毫米的钻头。螺钉规格分别为 1.4 x 8 mm 和 1.2 x 6 mm。(e) 预构造内部固定的最终形式.(f) 手术器械.请点击此处查看此图的较大版本。
图3:使用微创技术对中股骨和远端骨质的手术暴露的宏图。(a) 黑线表示巨大侧侧(上标区域)和二头肌(下标区域)之间的皮肤切口。虚线表示近似的肌肉范围。(b) 肌肉之间的手术切口图示.切口远离坐骨神经。黑线表示坐骨神经的方向。(c) 股骨中轴的暴露,肌肉间隙与大侧和顶椎骨的分离。(d-e)蒂比亚的暴露显示与纤维龙。(f) 股骨轴上的钻孔用巨大的侧向说明,并指示顶椎骨。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:植入内部固定。(a) 在头骨中制作的孔用纤维龙表示,柔韧性数字基图示。(b-c)拧入钻孔的塑料板与椎骨(b) 和纤维龙 (c) 有关。(d-e)伤口封闭使用维丽尔缝合。虚线 (e) 表示近似的塑料板范围.(f) 小切口的术后整体视图。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:手术切口愈合观察。(a) 手术切口在术后两天已经伤痕累累.(b-c)手术后肢体的脚踝和元卡波巴兰关节肿胀(b)在术后两天内几乎完全消失。箭头表示脚踝关节。(d) 老鼠可以正常站立.(e-f)手术后十二天,伤口已经完全愈合。黑色箭头表示手术愈合切口。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:膝关节固定的评估。(a) 宏观图像显示左膝关节在四个星期的固定后收缩。(b) 整体 X 射线图像显示螺钉的位置。(c) 固定膝关节的微观计算断层扫描分析.白色箭头表示固定螺钉。请点击此处查看此图的较大版本。
图7:关节延长运动范围(ROM)中关节缺血量的分析。数据以均值 = SEM(n = 每组 6 个)表示。固定膝关节的延长ROM的关节缺陷明显高于反向、非手术侧(作为对照组)。ROM 中的限制表示引起典型膝关节弯曲收缩的联合固定。统计分析:差异相等性是使用利文测试进行的,在两次点(28天和56天)的对照组和固定组之间的ROM差异与两个尾部学生不测试进行比较。显著性差由控制值的 P < 0.05 确定。请点击此处查看此图的较大版本。
图8:在不同时间点由Elastica-Masson-Staining分析的后上级膝关节胶囊中的组织学变化。在关节固定期间,在侧膝关节(非手术、上面板)和固定膝关节(手术、下面板)的后上级关节胶囊(手术、下面板)的代表性图像。经过一天的固定后,阴囊很厚,在后体-高级关节胶囊和股骨(用左行的星号表示)的关节空间内未观察到附着力。在28天的固定后,有纤维脂肪组织沉积在关节空间和后高级关节胶囊和股骨(箭头指示)之间形成粘附。在固定的第56天,沉积物仍然存在,并且有纤维组织越来越多地出现(用箭头表示)。左下角的黑色边框表示后缘连接舱和股骨之间关节空间的放大图像。F:股骨;T: 提比亚;M:半月板,后角;JS:联合空间。刻度条 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这项研究旨在阐明一种分步膝关节固定方法,使用一种微型侵入性技术,允许在手术后动物进行术后快速康复。按照惯例,肌肉间隙分离方法被认为是骨科手术中的微创技术。不出所料,我们发现大鼠在术后一天内就能恢复正常的饮食和活动,这与先前的研究是一致的。此外,手术后没有动脉或神经损伤,证据表明肌肉间隙分离方式确保一个充分和安全的骨暴露方法。虽然使用石膏石膏可以减少侵入性手术效果,但后肢发生水肿的可能性可能会影响不动的连续性。在这项研究中,手术后两天后,由外科手术引起的脚踝或脚趾肿胀完全消失。这些结果突出了一种可靠而稳定的关节固定模型,该模型由与快速恢复原理一致的微型侵入性技术创建。临床上,由固定引起的弹性收缩更接近于非炎症过程6。水肿可导致炎症介质4的释放。因此,使用石膏石膏诱导联合收缩确实不能无害。在本研究中,分别在股骨和骨质侧进行了两个单独的小切口(1-1.5厘米)。切口长度与 K 线钻孔所需的切口尺寸相似。因此,该方法的微创效应更有利于减少创伤到外固定。此外,以前的随机对照试验表明,外部固定(皮上)的应用与16肢感染风险增加之间可能存在相关性。考虑到研究中没有大鼠有早期感染迹象,我们假设肌肉间隙分离技术是这一模型的关键,因为它可以减少出血和不必要的切割。此外,内部固定器从注射器被修剪下来,它是低成本,最重要的是,对动物无毒。虽然横向和内侧手术方法可以建立有效的大鼠模型膝关节弯曲收缩28,但是,这种小侵入性技术,只能使用横向方法,而不是使用中联方法。
据我们所知,对近股骨或远端骨的精密螺钉钻孔位置没有完全理解。选择在头骨的中间部分钻一个洞可能会影响头骨的血液供应。微CT分析结果表明,合适的钻井位置在较大钻头下边缘以下约8毫米,在尖顶聚变边缘下方约4毫米。正确的钻孔位置有助于避免对接头部件或血液供应的影响。然而,通过皮下或下肌肉的方式植入内部固定仍然是有争议的。有趣的是,执行肌肉间隙分离技术在一定程度上便于通过肌肉下通道进行植入。
关节角测量结果与组织学分析一致,表明膝关节收缩在固定后肢中成功诱导。在28天和56天的固定化结束时,在固定膝关节上的平均关节缺陷为29.4± 3.3°,40.7 ± 4.3°,明显高于控制值(P < 0.05)。 我们还发现,在后方高级关节胶囊和固定侧膝关节的股骨之间的关节空间之间出现了典型的附着力(图8e,f),这表明使用微型侵入性技术将不干扰联合合同的发生。综合研究,该研究表明,这种微创模型产生稳定的结果,并有效地诱导获得的联合弯曲收缩。
这种微型入侵模式仍有一些局限性。首先,tibia侧螺钉将不可避免地刺激附近的肌腱,包括纤维龙。其次,钻进皮质骨可能会导致骨折。第三,仍有固定失败的可能性。我们认为,使用3D构建的个性化夹板是在未来29年建立非侵入性膝关节收缩模型的可能选择。
最后,本研究描述了一种基于肌肉间隙分离方法与小切口方法相结合的微型侵入性膝关节收缩模型。鉴于内部手术固定可以产生一个公认的关节收缩模型,这种微型侵入性技术可能有助于研究固定引起的膝关节弯曲收缩。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(第81772368号)、广东省自然科学基金(第2017A030313496号)和广东省科技计划项目(第2016A020215225号)的资助。No. 2017B090912007)。作者感谢中山大学第八附属医院骨科博士张飞博士在改造过程中的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anerdian | Shanghai Likang Ltd. | 310173 | antibacterial |
| Buprenorphine | Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd. | / | analgesia |
| Carprofen | MCE | HY-B1227 | analgesia |
| Cross screwdriver | STANLEY | PH0*125mm | tighten the screws |
| Electric drill | WEGO | 185 | drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm) |
| Microsurgical instruments | RWD | / | Orthopaedic surgical instruments for animals |
| Neomycin | Sigma | N6386 | antibacterial |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761 | anaesthetize |
| Stainless Steel screws | WEGO | m1.4*8; m1.2*6 | screw(part of internal fixation) |
| Syringe | WEGO | 3151474 | use for plastic plate(part of internal fixation) |
| μ-CT | ALOKA | Latheta LCT-200 | in vivo CT scan |
References
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