Summary
Formação da embarcação de sangue novo e inervação simpática desempenham um papel crucial na remodelação do tecido adiposo. No entanto, subsistem questões técnicas em Visualizar e medir quantitativamente o tecido adiposo. Aqui nós apresentamos um protocolo para rotular com êxito e comparar quantitativamente as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes tecidos adiposos.
Abstract
Estudos recentes têm destacado o papel crítico da angiogênese e inervação simpática no tecido adiposo remodelação durante o desenvolvimento da obesidade. Portanto, desenvolver um método fácil e eficiente para documentar as mudanças dinâmicas no tecido adiposo é necessário. Aqui, descrevemos uma abordagem de imunofluorescência modificada que eficientemente co manchas, vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo. Em comparação com métodos tradicionais e recentemente desenvolvidos, nossa abordagem é relativamente fácil de seguir e mais eficiente na rotulagem dos vasos sanguíneos e fibras nervosas com densidades maiores e menos fundo. Além disso, quanto maior a resolução das imagens ainda mais nos permite medir com precisão a área dos navios, quantidade de ramificação e comprimento das fibras por software de código aberto. Como uma demonstração usando o nosso método, mostramos que o tecido adiposo marrom (BAT) contém quantidades mais elevadas de vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao tecido adiposo branco (WAT). Podemos ainda encontrar que entre os WATs, WAT subcutâneo (sWAT) tem mais vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao epidídimo WAT (eWAT). Nosso método, portanto, fornece uma ferramenta útil para investigar a remodelação do tecido adiposo.
Introduction
Tecido adiposo tem chave metabólica e endócrina funções1. Isso dinamicamente aumenta ou diminui em resposta a diferentes nutrientes sublinha2. O tecido ativo processo de remodelação é composto por vários caminhos fisiológicas/etapas incluindo angiogênese, fibrose e formação de um microambiente inflamatório local2,3,4. Alguns estímulos físicos, tais como exposição fria e exercício, podem desencadear a ativação simpática, que em última análise, leva à formação de embarcação de sangue novo e inervação simpática em tecidos adiposos5,6. Estes processos de remodelação estão ligados firmemente a resultados metabólicos sistêmicos, incluindo a sensibilidade à insulina, a marca do tipo 2 diabetes2. Assim, a visualização dessas alterações patológicas é muito importante para compreender o estado saudável dos tecidos adiposos.
Angiogênese é o processo de formação da embarcação de sangue novo. Uma vez que os vasos sanguíneos fornecer oxigênio, nutrientes, hormônios e fatores de crescimento para o tecido, angiogênese foi considerado um passo fundamental no tecido adiposo remodelação, que tem sido documentado com diferentes técnicas6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, subsistem dúvidas sobre a resolução das imagens, eficiência de imunocoloração e métodos para a quantificação da densidade do navio. Em relação à formação da embarcação de sangue novo, inervação no tecido adiposo foi subestimada por muito tempo. Recentemente, Zeng et al. 14 usado avançados de microscopia intravital dois fotões e demonstrou que os adipócitos estão cercados por camadas de fibras nervosas14. Desde então, os pesquisadores começaram a apreciar o papel fulcral da inervação simpática no Regulamento da fisiologia do tecido adiposo. Assim, desenvolver uma abordagem fácil e prática de inervação do nervo adiposa de documento é importante.
Aqui, nós relatamos um método otimizado para a coloração co de vasos sanguíneos e fibras nervosas, com base em nossos protocolos anteriores. Com este método, podemos conseguir imagens claras de vasos sanguíneos e fibras nervosas sem fundo ruidoso. Além disso, nós obtemos uma resolução que é alta o suficiente para executar a medição quantitativa de densidades com software de código aberto. Usando esta nova abordagem, podemos comparar com sucesso as estruturas e as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes depósitos adiposos.
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Protocol
Todos os procedimentos que contenham assuntos animais foram aprovados pelo centro de Ciências de Saúde Animal Welfare Comitê da Universidade do Texas em Houston (número de protocolo animal: AWC-18-0057).
1. preparação do reagente
- 1 x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4): para fazer 1 L de PBS 1x, dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4e 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH para 7,4 e encha com água destilada para alcançar um volume final de 1 L.
- 1% paraformaldeído em PBS 1x (1% PFA, wt/vol): para obter um volume final de 50 mL, adicionar 3,125 mL de 16% PFA (ver Tabela de materiais) para 46,875 mL de 1X PBS. Misture bem e guarde a 4 ° C para uso posterior.
Atenção: Paraformaldeído é tóxico. Todos os procedimentos devem ser realizados sob uma coifa para evitar a inalação e contacto com a pele. - 0,1% polissorbato 20 (consulte a tabela de materiais) em PBS 1x (1 x PBST, pH 7,4, vol/vol): para obter um volume final de 50 mL, adicionar 0,05 mL de polissorbato 20 de 49,95 mL de 1X PBS. Vórtice e loja a 4 ° C por até 1 mês.
- 1% Octoxinol-9 (ver Tabela de materiais) em PBS 1x (1X PBS-TX, pH 7,4, vol/vol): para obter um volume final de 10 mL, adicionar 0,1 mL de Octoxinol-9 a 9,9 mL de 1X PBS. Vórtice e loja a 4 ° C por até 1 mês.
- 2% de azida sódica (wt/vol): para produzir 10 mL de 2% de azida de sódio, adicionar 0,2 g de azida de sódio a 10 mL de 1X PBS. Misture bem e guarde a 4 ° C para uso posterior.
- 90% de glicerol em 1X PBS (vol/vol): para obter um volume final de 10 mL, adicionar 1 mL de 1X PBS a 9 mL de glicerol. Vórtice e armazenar à temperatura ambiente (RT) para uso posterior.
2. animal Ddissection e coleção de tecido adiposo
- Use camundongos machos do C57BL/6J 6 semanas de idade. Anestesia os ratos com isoflurano (4-5% para indução então 1%-2% para manutenção). Uma vez anestesiado, realize um reflexo de dedo-pinch para determinar a profundidade anestésica, a julgar pela falta de pedais reflexos. Uma vez que os ratos são anestesiados profundamente, disse os ratos seguindo o protocolo como publicado anteriormente15.
- Esterilize a tesoura sem corte e área cirúrgica do tórax (sem necessidade de rapar o cabelo). Abra o baú cortando o diafragma e as costelas ao longo da superfície lateral com um tamanho de ~ 2 cm com uma tesoura sem corte. Fixar a bandeira no peito com pinça hemostática e refleti-la, colocando a pinça hemostática sobre a cabeça.
- Faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo (~0.5 cm) com uma tesoura de íris. Inserir uma agulha com ponta oliva perfusão através do local da incisão e prenda a ponta da agulha no lugar com a pinça hemostática. Conecte a agulha de uma seringa de 50 mL contendo solução de fixação paraformaldeído (1% PFA, pH 7,4).
- Abra o átrio direito pela corte de seção com uma tesoura de íris como a saída de perfusão. Iniciar a perfusão por suavemente e continuamente empurrando a seringa em uma taxa de perfusão perto de 10 mL/min. parar de empurrar quando o fluido sair da tomada está livre de qualquer sangue. Todo o processo deve exigir ~ 5 min.
Atenção: Execute estas etapas sob uma coifa para evitar toxicidade da PFA. - Disse os tecidos adiposo brancos e marrons de ratos. Use a tesoura para quebrar as amostras de tecido em pequenos pedaços de pedaços de cerca de 5 x 5 x 3 mm3. Transfira os pedaços pequenos com uma pinça esterilizada no tecido incorporação cassettes com rotulagem adequada das amostras de tecido sobre as fitas.
- Mergulhe as incorporação cassettes contendo amostras de tecido para a solução de fixação (1% PFA em 1X PBS, pH 7,4) a 4 ° C por 24 – 48 h.
Nota: A solução de fixação e o tempo de fixação variam de acordo com tamanhos dos tecidos16,17,18. - Lave as amostras com frescos 1x tampão PBS três vezes (0,5 mL/lavagem).
Atenção: Execute esta etapa sob uma coifa. Os resíduos de paraformaldeído devem ser manuseados corretamente de acordo com os procedimentos de eliminação de resíduos perigosos.
Nota: Os tecidos podem ser armazenados em 1X PBS a 4 ° C para posterior processamento.
3. incubação do anticorpo
- Corte as amostras de tecido fixo em cubos de3 aproximadamente 2 mm com a tesoura esterilizada. Para permeabilização, transferir as amostras em um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de 1 x PBS-TX (1% Octoxinol-9 em PBS 1x, consulte tabela de materiais, pH 7,4) e rodar suavemente os tubos no RT por 1h a 18 rpm.
- Remova cuidadosamente a 1 x PBS-TX por aspiração. Lavar as amostras 3 x adicionando a PBS 1x diretamente para os tubos de mesmos (sem necessidade de alterar os tubos). Durante cada lavagem, inverta os tubos várias vezes.
- Para bloquear, adicionar 0,5 mL de tampão de bloqueio (Tabela de materiais) para as amostras e incubar a RT por 2h com rotação suave.
- Para preparar a 0,4 mL da solução de anticorpo primário, diluir 2 μL de anti - endomucin (o marcador dos vasos sanguíneos) 5 (1: 200) e 2 μL de anti — anticorpos de 5 (1: 200, 1 µ g/mL) Tirosina Hidroxilase (TH, o marcador de fibras nervosas) (tabela de materiais para obter informações de anticorpo) em 396 μL de tampão de bloqueio. Vórtice e spin para baixo para recuperar o volume.
- Para a primeira incubação do anticorpo, cuidadosamente remova o tampão de bloqueio os pedaços de tecido. Adicionar 100 μL de solução de anticorpo primário, preparada no passo 3.4 para tubos e incube a 4 ° C durante a noite.
Nota: O tempo de diluição e incubação do anticorpo pode variar entre diferentes anticorpos. É recomendável adicionar 0,02% de azida de sódio para a solução de anticorpo para evitar o crescimento microbiano. Para preparar a 0,4 mL da solução de anticorpo primário com azida de sódio, adicione 4 μL de anticorpos (1 μL de cada um) e 4 μL de 2% de azida de sódio em 392 μL de tampão de bloqueio. - Recolha cuidadosamente a solução de anticorpo primário para reutilizá-las se desejado. Lavar as amostras com 1 x PBST (pH 7,4, 100 µ l/lavagem) três vezes (30 min cada) com suave rotação em rpm 18.
- Para a preparação da solução de anticorpo secundário, diluir 2 μL de fluoróforo (onda comprimento 495 nm) Conjugado IgG anticabra (1: 200) e 2 μL de fluoróforo (onda comprimento 650 nm) Conjugado IgG anticoelho (1: 200) (ver Tabela de materiais) em 396 μL de tampão de bloqueio. Vórtice e spin brevemente para recolher todo o líquido.
Nota: Protege as amostras da luz durante os procedimentos a seguir. - Para a segunda incubação do anticorpo, remova o último tampão de lavagem de amostras. Adicionar 100 μL de solução de anticorpo secundário em tubos e incubar a RT por 2h com suave rotação em rpm 18.
- Remova cuidadosamente a solução de anticorpo secundário. Lavar as amostras 3 x com 1 x PBST (pH 7,4, 30 min cada) com suave rotação em rpm 18.
Nota: Não reutilize esta solução de anticorpo secundário, como que possam estar contaminado com os vestígios de anticorpos primários trazidos por tecidos. - Para a compensação óptica, mergulhe as amostras em 1 mL de glicerol de 90% e manter as amostras em 4 ° C na escuridão, até ficarem transparentes.
Nota: A duração da imersão depende do tipo de tecido e tamanho. Normalmente, um cubo de3 de 2 mm de tecido adiposo branco precisa de incubação durante a noite, enquanto as mesmo tamanho marrom tecido adiposo amostra necessidades mais tempo. - Aderir a um isolador de silicone para o slide para criar um bem para a imagem latente de volume. Alternativamente, anexar várias camadas de fita adesiva transparente para os slides e cortar um quadrado do meio para criar um poço (Figura 2).
Nota: Ajuste a profundidade bem para caber o tamanho da amostra. Neste protocolo, uma profundidade de 1 mm bem é usada. - Cuidadosamente, transferir as amostras para o bem e encha-o com o meio de montagem (ver Tabela de materiais). Colocar uma lamínula sobre a superfície e os cantos da lamínula com média viscosidade elevada do selo (ver Tabela de materiais). Deixe a cura médio de montagem para 24 h no RT na escuridão.
Nota: Certifique-se de que nenhum espaço é deixado entre a amostra e a lamínula. Evite bolhas sob a lamínula. Evite colocar pressão excessiva sobre as amostras.
4. aquisição de imagem
- Adquira imagens de Z-pilha (consulte os passos 4.2 – 4.7) com o objetivo de 20x de um microscópio confocal/software.
- Inicie o sistema. Clique na guia <configuração> e ativar o laser de argônio e laser de 633 aqui vai. Clique na guia <Acquire>. No painel de linhas do laser <Visible>, subir as barras de intensidade correspondente para escolher as linhas de laser de 488 nm e 633 nm. Inicialmente, as intensidades podem ser definidas para 20%-30%. Selecione o espelho triplo dichoric 488/561/633. Ative os PMTs clicando sobre as caixas de seleção <ativo>, escolhendo PMT1 para emissão animada por 488 nm laser e PMT3 para da 633 nm laser. Defina o intervalo de comprimento de onda para 500 – 550 nm para PMT1 e 650-750nm para PMT3. Selecione o psudocolor a ser usado para exibição de imagem dupla clicando no retângulo colorido ao lado de cada PMT e escolhendo uma cor no menu pop-up.
- Clique no <Live> para verificar a imagem de amostras. Use o botão z-posição para selecionar um plano de foco dentro da região XY de interesse. Ajuste o brilho das imagens por meio do ajuste da intensidade do laser, ganho inteligente e deslocamento. Para cada canal de fluorescência, realizar este ajuste sob o modo de exibição de <QLUT> (veja acima tabela rápida). Clique no botão <QLUT> para entrar no modo QLUT, na qual os pixels saturados são exibidos em azul para auxiliar a configuração do nível de brilho adequado. Clique duas vezes no botão <QLUT> para voltar ao modo de exibição pseudocolorida.
Nota: Os valores numéricos da configuração podem variar entre cada experimento. - Ao fazer a varredura, gire o botão de Z-posição para a esquerda para mover o plano de foco para uma extremidade do volume de interesse e, em seguida, clique na seta para definir a posição final digitalização <final>. Em seguida, gire o botão de Z-posição para a direita para mover o plano de foco através da amostra para a outra extremidade do volume de interesse e, em seguida, clique na seta <Begin> para definir a posição de começar a varredura.
Nota: Para a comparação entre diferentes amostras, defina o mesmo Z-volume de amostras diferentes. - Ajuste o tamanho de z-passo de 3 µm. alterar a qualidade de imagem, selecionando um formato de 1024 x 1024, velocidade de 100 Hz e linha média de 2.
- Selecione <Iniciar > para iniciar a aquisição de imagem de z-pilha.
- Para a projeção máxima da pilha imagem adquirida, clique na guia <processo> e <ferramenta>, selecione <projeção 3D> e digite <máxima> na lista de método sem alterações para X, Y e z Set <Limiar> 0. Clique no <aplicar>. A intensidade máxima do Z-volume vai ser empilhada em uma imagem 2D que será mostrada (Figura 4A).
5. análise de redes de fibras nervosas e vasos sanguíneos
-
Análise de 2D imagens através do software de fonte aberta (ver tabela de materiais)19
- Abra as imagens empilhadas no software. Ajuste a intensidade e o diâmetro do vaso até que todas as estruturas do navio podem ser adequadamente selecionado (Figura 4B).
- Selecione executar análise e exportar os dados seguindo orientação do software.
-
Análise de 3D imagens através do software licenciado (consulte a tabela de materiais)
- Abra os dados brutos de imagens com o software. Ajustar o limiar e outros parâmetros, até as estruturas de navio em cada camada do z-volume são corretamente selecionadas (consulte o guia do usuário para detalhes no software) (Figura 4).
- Analisar os caracteres selecionados segmentos e exportar os dados a seguir a orientação do software.
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Representative Results
A região distal do epidídimo tecido adiposo branco (eWAT), região medial do dorsolombar branco tecido adiposo subcutâneo (sWAT) e região medial da interscapulaire tecido adiposo marrom (BAT) foram coletados. Os locais de recolha desses tecidos são indicados na Figura 1.
Figura 1: Anatomia do tecido adiposo branco subcutâneo (sWAT), epidídimo de tecido adiposo branco (eWAT) e tecido adiposo marrom (BAT) indica regiões utilizadas para coletar as amostras. (A) as regiões delineadas por linhas tracejadas brancas representam sWAT, e a localização de asterisco branco realçado é o local de recolha da sWAT. Regiões delineadas por linhas tracejadas pretas são eWAT, e a localização de asterisco preto realçado é o site para a coleta de eWAT. (B) as regiões delineadas por linhas tracejadas pretas são morcego, e a região de coleta de tecido é realçada pelo asterisco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Depois toda a montagem da coloração, os pedaços de tecido foram montados em um poço de 1 mm de profundidade (Figura 2)
e a imagem com o microscópio confocal. Primeiro testamos o efeito da etapa de limpeza com incubação de glicerol de 90% na qualidade das imagens. Achamos que mais vasos sanguíneos positivamente foram corados com anticorpo de α-endomucin em sWAT o glicerol incubados, sugerindo que a etapa de compensação é crítica para a coloração completa dos vasos sanguíneos (Figura 3, comparar os painéis A e B).
Figura 2: diagramas dos poços para a imagem latente volume. (A) diagrama de um slide com um isolador de silicone. (B) diagrama de um poço com várias camadas de fita feita pelo nosso laboratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: comparação de IF imagens de vasos sanguíneos acquiredwith ou sem compensação óptica passo com 90% de glicerol. (A) toda a montagem imunofluorescência (IF), coloração com anticorpos anti-endomucin (verde) em sWAT. A amostra não foi submetida para o compensação óptica passo (3.10). (B) toda a montagem se manchar com anticorpo anti-endomucin em sWAT. A amostra foi submetida para o compensação óptica passo (3.10) antes do montagem passos (3.11 e 3.12). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No entanto, a etapa de limpeza com glicerol não afetou a integridade ou a forma dos vasos sanguíneos (Figura 3). Tendo em conta estes efeitos benéficos, nos experimentos seguintes, realizou-se a etapa de limpeza.
Além disso comparamos os resultados das análises 2D e 3D usando o software diferente (ver Tabela de materiais). Nós achamos que, enquanto as imagens 3D forneceram aparentemente mais detalhadas informações estruturais, os dois métodos analíticos eventualmente não apresentaram diferenças significativas em termos de número de comprimento e ramificação dos vasos (Figura 4).
Figura 4: comparação das análises 2D e 3D na estrutura do navio. (A) o efeito de projeção máxima nas imagens. (B) os resultados analíticos pelo software 2D (ver Tabela de materiais). Particularmente, as linhas vermelhas indicam esqueleto selecionado, enquanto os pontos azuis indicam os pontos de identidade visual. (C) a analítica de resultados pelo software 3D (ver Tabela de materiais). A área cinza é a região selecionada para análise. A linha verde indica os medida de segmentos e pontos verdes indicam os nós medidos. (D) a comparação do comprimento do navio, os números do segmento, ramificação números de nó e nó terminal números analisados por métodos 2D ou 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Publicações anteriores demonstraram que diferentes depósitos adiposos possuem propriedades heterogêneos1,18. Aqui procuramos determinar se os vasos sanguíneos e fibras nervosas apresentam diferentes padrões entre os depósitos utilizando nosso método recentemente desenvolvido. Para conseguir isso, foram realizadas co se manchar com α-endomucin (para as embarcações de sangue) e anticorpos do α-TH (para fibras nervosas) no tecido adiposo. Curiosamente, os resultados mostraram que houve significativamente mais os vasos sanguíneos e fibras nervosas em morcego em comparação com WATs (Figura 5, pistas de fundo comparar para faixas superiores e médios)
Figura 5: comparação dos vasos sanguíneos e fibras nervosas adquiridas de diferentes depósitos adiposos. Toda a montagem se manchar com anti-endomucin (verde) e anti-Tirosina Hidroxilase (TH) (vermelho) anticorpos em eWAT (A, B, mescladas em C), sWAT (D, E, se fundiu em F) e bastão (G, H, fundiu-se em eu). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Entre os WATs, a sWAT exibiu a maior densidade de vasos sanguíneos do que o eWAT (Figura 5, comparar o médio a superior lane). Da nota, enquanto as fibras nervosas expandida-se em paralelo com os vasos sanguíneos, não demonstravam localização co significativa (Figura 5, mesclado de pistas). Nós medimos mais quantitativamente a área do navio, número de cruzamentos e o comprimento do tubo com o método 2D e encontrados resultados semelhantes como o descrito acima (Figura 6).
Figura 6: análise quantitativa de vascular e das redes de fibras nervosas. (A) a porcentagem de área de vaso sanguíneo nas amostras de eWAT, sWAT e morcego. (B) o número de junções do vascular redes em eWAT, sWAT e BAT. (C) o navio total comprimento de redes vasculares em eWAT, sWAT e morcego. Área de fibra (D) a porcentagem da neve nas amostras de eWAT, sWAT e BAT. (E) o número de junções das fibras do nervo em eWAT, sWAT e morcego. (F), o total comprimento de fibras nervosas em eWAT, sWAT e morcego. As análises foram realizadas com o software 2D. Os resultados foram obtidos a partir das imagens apresentadas na Figura 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em resumo, essa abordagem com êxito co manchadas de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes tecidos adiposo.
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Discussion
Remodela o tecido adiposo está diretamente ligada à desregulação metabólica durante o desenvolvimento de obesidade1,2. Angiogênese e inervação simpática são essenciais para a dinâmica remodela processo2,12. Portanto, desenvolver uma abordagem aplicável para visualizar os novos vasos sanguíneos, bem como as fibras nervosas são de grande importância. Métodos anteriores têm sido relatados para documentar a angiogênese no tecido adiposo. No entanto, algumas questões permanecem com essas abordagens, incluindo a baixa eficiência, resolução exigente e fundo ruidoso. Enquanto isso, inervação simpática só foi reconhecida recentemente como um passo crítico no tecido adiposo patologia14. Apesar das conclusões relacionadas são interessantes, métodos aplicados requerem ferramentas avançadas de microscopia e são demorados. Aqui, nós relatamos uma abordagem fácil-à-siga modificada do nosso protocolo anterior para co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras de nervo simpáticas. Curiosamente, nós manchado com êxito os vasos sanguíneos e fibras nervosas com alta resolução, e a coloração tem qualidades comparáveis ao relatado anteriormente imagens18.
Nós anteriormente manchado os vasos sanguíneos em tecidos adiposos por imuno-histoquímica ou imunofluorescência com o anticorpo de α-CD31, um marcador de células endoteliais, na parafina slides8,13,20. Enquanto o método nos permite distinguir a densidade de vasos sanguíneos entre os diferentes grupos, os vasos microvasculares que foram corados positivamente não estavam completos. Aqui, optamos por um método de montagem em conjunto e realizado se manchar com um anticorpo de α-endomucin, outro marcador para os vasos sanguíneos. Com esta abordagem otimizada, éramos capazes de atingir a coloração com mais vasos sanguíneos, especialmente os vasos microblood. Além disso, nesse método, desde que evitamos passos tais como fixação de incorporação e formalina de parafina, que têm o potencial de prejudicar a integridade dos vasos sanguíneos, obtivemos imagens com maior resolução e mais vasos intactos. A estrutura inquebrantável dos vasos mais nos permitiu medir e comparar seus comprimentos, ramificações e áreas. Digno de nota, nós adicionamos um passo de clareira com glicerol, então os pedaços de tecido podem se tornar mais transparentes, e este passo simples, mas crítico significativamente melhorado a eficiência da coloração18,21.
Devido aos altos níveis de conteúdo de lipídios no tecido adiposo, que pode limitar a acessibilidade dos anticorpos para as regiões do interiores do tecido, cortamos os depósitos em pedaços pequenos, para garantir a ligação de anticorpo adequado para as proteínas alvo. Portanto, nosso método com êxito as manchas mais vasos sanguíneos e fibras nervosas do que manchas em tecidos. No entanto, pode perder informações espaciais e, portanto, afetar a integridade das fibras nervosas. Para resolver esse problema aparente e garantir que as imagens são comparáveis entre ratos individuais, sugere-se para coletar os pedaços pequenos das mesmas regiões em depósitos de tecido adiposos. Se mais informação espacial é mais necessário, pedaços maiores devem ser obtidos para a coloração. Para amostras maiores, fixação mais vezes com doses maiores de FPA, altas concentrações de detergentes para a permeabilização, e longos períodos de incubação do anticorpo podem ser necessária.
Inervação do tecido adiposo foi investigada recentemente. Foram aplicadas várias técnicas avançadas para visualizar as fibras nervosas14,17. Esses métodos são caros ou demorados. Aqui, simplesmente realizamos uma mancha se com α-TH (um marcador do nervo simpático) e com sucesso manchado as fibras de nervo simpáticas em uma alta qualidade. Mais importante, realizamos a coloração co com α endomucin e α-TH para investigar como os vasos sanguíneos interplay com fibras de nervo simpáticas durante a remodelação do tecido adiposo.
Digno de nota, comparamos os resultados das análises 2D e 3D usando o software diferente. Verificou-se que, enquanto as imagens 3D forneceram mais detalhadas informações estruturais, os dois métodos analíticos não apresentaram diferença significativa em termos de comprimento e ramificação dos vasos. Eventualmente, ao analisar com o método 3D, o software em si pode detectar alguns sinais falsos que precisam ser ajustado manualmente. Dado que o software 2D é propositadamente concebido para análise de navio, assim, sugere-se usar esse método para medir quantitativamente a estrutura dos vasos.
Com esse método, os vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferente tecido adiposo foram co manchadas, e suas densidades, ramificação e comprimentos foram comparados19. Verificou-se que tanto os vasos sanguíneos e fibras nervosas são muito mais espessas em morcego em comparação com o WAT, sugerindo que o morcego é um depósito de tecido adiposo mais metabolicamente ativo. Além disso, o vaso sanguíneo e densidades de nervo em sWAT eram superiores na eWAT, indicando que diferentes WATs têm diferentes perfis de remodelação.
Em conclusão, este método eficiente co manchas de vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo5. Além disso, ele serve como uma ferramenta útil para estudar as mudanças dinâmicas no tecido adiposo durante o desenvolvimento da obesidade.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de saúde (NIH) grant R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
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