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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Coloration des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le tissu adipeux

Published: February 13, 2019 doi: 10.3791/59266
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, the Brown Foundation of Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston, 2Microscopy Core, the Brown Foundation of Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

La formation de vaisseaux sanguins et une innervation sympathique jouent un rôle essentiel dans le remodelage du tissu adipeux. Cependant, il reste des aspects techniques de visualisation et de mesurer quantitativement le tissu adipeux. Nous présentons ici un protocole pour étiqueter correctement comparer quantitativement les densités des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans différents tissus adipeux.

Abstract

Des études récentes ont mis en évidence le rôle crucial de l’angiogenèse et l’innervation sympathique dans le tissu adipeux se transformant au cours du développement de l’obésité. Donc, il est nécessaire d’élaborer une méthode simple et efficace afin de documenter les changements dynamiques dans le tissu adipeux. Nous décrivons ici une approche modifiée par immunofluorescence qui efficacement les taches conjointement les vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans les tissus adipeux. Par rapport aux méthodes traditionnelles et récemment développés, notre approche est relativement facile à suivre et plus efficaces dans les vaisseaux sanguins et fibres nerveuses avec des densités plus élevées et moins de fond de l’étiquetage. En outre, la plus haute résolution des images plus permet de mesurer avec précision la zone des vaisseaux, montant de ramification et la longueur des fibres de logiciels open source. Comme une démonstration à l’aide de notre méthode, nous montrons que le tissu adipeux brun (TAB) contient des quantités plus élevées de vaisseaux sanguins et fibres nerveuses comparés au tissu adipeux blanc (WAT). Nous avons en outre trouver que parmi les WATs, WAT sous-cutanée (sWAT) a plus de vaisseaux sanguins et fibres nerveuses par rapport au WAT épididymaire (eWAT). Notre méthode fournit donc un outil utile pour étudier le remodelage du tissu adipeux.

Introduction

Le tissu adipeux a clé métabolique et endocriniens fonctions1. Il dynamiquement se dilate ou se contracte en réponse aux différents nutriments souligne2. Le tissu actif, transformant le processus se compose de multiples chemins/étapes physiologiques dont l’angiogenèse, fibrose et façonnage des micro-environnements inflammatoire local2,3,4. Certains stimuli physiques, comme l’exposition au froid et l’exercice, peuvent déclencher l’activation sympathique, qui conduit finalement à la formation de vaisseaux sanguins et une innervation sympathique dans le tissus adipeux5,6. Ces processus de remodelage sont liées étroitement aux résultats métaboliques systémiques, y compris la sensibilité à l’insuline, le signe distinctif du type 2 diabète2. Ainsi, la visualisation de ces changements pathologiques est très importante pour comprendre la bonne situation de l’ensemble des tissus adipeux.

L’angiogenèse est le processus de la formation de vaisseaux sanguins. Puisque les vaisseaux sanguins fournissent l’oxygène, des nutriments, hormones et facteurs de croissance des tissus, l’angiogenèse a été considérée comme une étape clé dans le remodelage de tissu adipeux, qui a été documentée avec différentes techniques6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Cependant, il reste des questions sur la résolution des images, l’efficacité d’immunomarquage et de méthodes pour la quantification de la masse volumique de navire. Par rapport à la formation de vaisseaux sanguins, innervation dans le tissu adipeux a été sous-estimé pendant une longue période. Récemment, Zeng et al. 14 utilisé la microscopie intravitale deux photons de pointe et a démontré que les adipocytes sont entourés de couches de fibres nerveuses14. Depuis lors, les chercheurs ont commencé à apprécier le rôle pivot de l’innervation sympathique dans le règlement de la physiologie du tissu adipeux. Ainsi, il est important d’élaborer une approche simple et pratique d’innervation du nerf adipeuse document.

Nous rapportons ici une méthode optimisée pour le co de la souillure des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses selon nos protocoles précédents. Avec cette méthode, nous pouvons obtenir des images claires des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses sans fond bruyant. En outre, nous obtenons une résolution assez élevée pour effectuer une mesure quantitative des densités avec logiciel open source. Grâce à cette nouvelle approche, nous pouvons comparer avec succès les structures et les densités des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans différents dépôts adipeux.

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Protocol

Toutes les procédures contenant des sujets animaux ont été approuvés par l’Animal Welfare Commission du University of Texas Health Science Center à Houston (numéro de protocole animale : AWC-18-0057).

1. préparation du réactif

  1. 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) : pour faire 1 L de solution PBS 1 x, dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4et 0,24 g de KH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,4 et remplir d’eau distillée pour obtenir un volume final de 1 L.
  2. paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS 1 x (1 % PFA, wt/vol) : pour atteindre un volume de 50 mL, ajouter mL 3,125 % 16 PFA (voir Table des matières) à 46,875 mL de PBS 1 x. Bien mélanger et conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
    Mise en garde : Paraformaldéhyde est toxique. Toutes les procédures devraient être effectuées sous une hotte aspirante pour éviter toute inhalation et contact avec la peau.
  3. 0,1 % de polysorbate 20 (voir Table des matières) dans du PBS 1 x (1 x PBST pH 7,4, vol/vol) : pour atteindre un volume de 50 mL, ajouter 0,05 mL de polysorbate 20 à 49,95 mL de PBS 1 x. Vortex et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  4. 1 % octoxynol-9 (voir Table des matières) dans du PBS 1 x (1 x PBS-TX, pH 7,4, vol/vol) : pour obtenir un volume final de 10 mL, ajouter 0,1 mL d’octoxynol-9 à 9,9 mL de PBS 1 x. Vortex et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  5. 2 % d’azide de sodium (wt/vol) : pour produire 10 mL de 2 % d’azide de sodium, ajouter 0,2 g d’azide de sodium à 10 mL de PBS 1 x. Bien mélanger et conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
  6. 90 % de glycérol dans du PBS 1 x (vol/vol) : pour atteindre un volume de 10 mL, ajouter 1 mL de PBS 1 x dans 9 mL de glycérol. Vortex et conserver à température ambiante (RT) pour une utilisation ultérieure.

2. animale Ddissection et Collection de tissu adipeux

  1. Utiliser des souris mâles C57BL/6J 6 semaines. Anesthésier les souris à l’isoflurane (4 à 5 % pour l’induction puis 1 à 2 % pour l’entretien). Une fois anesthésié, effectuer un réflexe d’orteil-pincée pour déterminer la profondeur anesthésique, à en juger par l’absence de réflexes pédales. Une fois que les souris sont profondément anesthésiés, disséquer les souris suivant le protocole comme précédemment publiées15.
  2. Stériliser les ciseaux émoussé et la zone chirurgicale de la poitrine (pas besoin de se raser les cheveux). Ouvrir la poitrine en coupant le diaphragme et les côtes le long de la surface latérale avec une taille d’environ 2 cm à l’aide de ciseaux émoussé. Fixer le drapeau de la poitrine avec pince hémostatique et il reflète en plaçant la pince hémostatique au-dessus de la tête.
  3. Faire une petite incision dans le ventricule gauche (~0.5 cm) avec des ciseaux de l’iris. Insérer une aiguille de perfusion à bout d’olive via le site d’incision et fixez l’extrémité de l’aiguille en place avec la pince hémostatique. Fixer l’aiguille d’une seringue de 50 mL contenant la solution de fixation de paraformaldéhyde (1 % PFA, pH 7,4).
  4. Ouvrez l’oreillette droite en coupe de section avec des ciseaux iris comme le débouché de la perfusion. Commencer la perfusion par doucement et continuellement en poussant la seringue à un taux de perfusion proche de 10 mL/min. relâcher la pression lorsque le liquide sortant de la prise est libre de n’importe quel sang. L’ensemble du processus devrait exiger environ 5 min.
    Mise en garde : Effectuez ces opérations sous une hotte aspirante pour éviter la toxicité de la PFA.
  5. Disséquer les tissus adipeux blanc et brun des souris. Utiliser des ciseaux pour briser les échantillons de tissus en petits morceaux de morceaux environ 5 x 5 x 3 mm,3. Transférer les petits morceaux avec la pince à épiler stérilisée dans le tissu incrustation des cassettes dans un étiquetage adéquat des échantillons de tissus sur les cassettes.
  6. Immergez l’encastrement cassettes contenant des échantillons de tissus dans la solution de fixation (1 % PFA dans du PBS 1 x, pH 7,4) à 4 ° C pendant 24 à 48 h.
    Remarque : La solution de fixation et le temps de fixation varient en fonction des tailles des tissus16,17,18.
  7. Laver les échantillons avec frais 1 x tampon PBS trois fois (0,5 mL/lavage).
    Mise en garde : Effectuez cette étape sous une hotte aspirante. Les déchets de paraformaldéhyde doivent être correctement manipulés selon les modalités d’élimination des déchets dangereux.
    Remarque : Les tissus peuvent être stockées dans du PBS 1 x à 4 ° C pour un traitement ultérieur.

3. anticorps Incubation

  1. Couper les échantillons de tissu fixe en cubes de3 environ 2 mm avec des ciseaux stérilisés. Pour perméabilisation, transférer les échantillons dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de 1 x PBS-TX (1 % octoxynol-9 dans du PBS 1 x, voir Table des matières, pH 7,4) et tourner doucement les tubes à RT pendant 1 h à 18 tours/minute.
  2. Retirer délicatement le 1 x PBS-TX par aspiration. Laver les échantillons 3 x en ajoutant le PBS 1 x directement dans les tubes de mêmes (pas besoin de changer les tubes). Lors de chaque lavage, il faut inverser les tubes plusieurs fois.
  3. Pour le blocage, ajouter 0,5 mL de tampon de blocage (Table des matières) pour les échantillons et incuber à RT pendant 2 h avec une légère rotation.
  4. Pour préparer de 0,4 mL de solution d’anticorps primaire, diluer 2 μL d’anti - endomucin (le marqueur des vaisseaux sanguins) 5 (1 : 200) et 2 μL d’anti — anticorps de tyrosine hydroxylase (TH, le marqueur des fibres nerveuses) 5 (1 : 200, 1 µg/mL) (Table des matières pour plus d’informations de l’anticorps) en 396 μL de tampon de blocage. Vortex et rotation vers le bas pour récupérer le volume.
  5. Pour la première incubation d’anticorps, retirer délicatement le tampon de blocage des morceaux de tissu. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps primaire préparée à l’étape 3.4 dans des tubes et incuber une nuit à 4 ° C.
    Remarque : Le temps de dilution et d’incubation des anticorps peuvent varier entre les différents anticorps. Il est recommandé d’ajouter 0,02 % d’azide de sodium à la solution d’anticorps pour empêcher la croissance microbienne. 0,4 mL de solution d’anticorps primaire avec l’azoture de sodium, ajoutez 4 μL d’anticorps (1 μL de chacune) et 4 μL de 2 % d’azide de sodium en 392 μL de tampon de blocage.
  6. Soigneusement collecter la solution d’anticorps primaire pour être réutilisés si vous le souhaitez. Laver les échantillons avec 1 x PBST (pH 7,4, 100 µL/lavage) avec rotation douce à 18 tr/min, trois fois (30 min chacun).
  7. Pour la préparation de la solution d’anticorps secondaire, diluer 2 μL de fluorophore (onde longueur 495 nm) conjugué IgG anti-goat (1 : 200) et 2 μL de fluorophore (onde longueur 650 nm) conjugué IgG anti-lapin (1 : 200) (voir la Table des matières) en 396 μL de tampon de blocage. Vortex et un essorage brièvement pour recueillir tout le liquide.
    Remarque : Protéger les échantillons de lumière pendant les procédures suivantes.
  8. Pour la seconde incubation d’anticorps, retirer le dernier tampon de lavage des échantillons. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps secondaire dans des tubes et incuber à RT pendant 2 h avec rotation douce à 18 tours/minute.
  9. Retirez soigneusement la solution d’anticorps secondaire. Laver les échantillons 3 x avec 1 x PBST (pH 7,4, 30 min chacun) avec rotation douce à 18 tours/minute.
    Remarque : Ne pas réutiliser cette solution d’anticorps secondaire, car il pourrait être contaminé par les traces d’anticorps primaires par les tissus.
  10. Pour l’autorisation de l’optique, immergez les échantillons dans 1 mL de 90 % de glycérol et conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à ce qu’ils deviennent transparents.
    Remarque : La durée d’immersion dépend du type de tissu et de la taille. En règle générale, un cube de3 mm 2 du tissu adipeux blanc a besoin au jour le jour d’incubation, alors que les mêmes taille marron tissu adipeux échantillon besoins plus longtemps.
  11. Respecter un isolateur de silicone à la diapositive pour créer un puits pour l’imagerie de volume. Vous pouvez attacher plusieurs couches de ruban adhésif transparent aux diapositives et découper un carré au milieu pour créer un puits (Figure 2).
    Remarque : Ajuster la profondeur du puits pour s’adapter à la taille de l’échantillon. Dans ce protocole, une profondeur du puits 1 mm est utilisée.
  12. Soigneusement, transférer les échantillons dans le puits et remplissez-le avec le milieu de montage (voir Table des matières). Poser une lamelle couvre-objet sur la surface et sceller les coins de la lamelle couvre-objet avec moyen de haute viscosité (voir Table des matières). Laissez la cure moyenne montage à RT pendant 24 h dans l’obscurité.
    Remarque : S’assurer qu’aucun espace n’est laissé entre l’échantillon et la lamelle couvre-objet. Éviter les bulles sous la lamelle couvre-objet. Evitez de poser une pression excessive sur les échantillons.

4. Acquisition d’images

  1. Acquisition d’images de Z-pile (se référer aux étapes 4,2 à 4,7) avec l’objectif de 20 x d’un microscope confocal/logiciel.
  2. Démarrer le système. Cliquez sur l’onglet <Configuration> et activer le laser à argon et un laser HeNe 633. Cliquez sur l’onglet <Acquire>. Dans le panneau de lignes laser <Visible>, déplacer les curseurs intensité correspondante jusqu'à choisir les lignes laser de 488 nm et 633 nm. Au départ, l’intensité peut être réglée à 20 à 30 %. Sélectionnez le miroir 488/561/633 dichoric triple. Activer la PMT en cliquant sur les cases à cocher <Active>, choisissant PMT1 pour l’émission excitée par 488 nm laser et PMT3 pour celui du laser 633 nm. Valeur la gamme de longueur d’onde 500 – 550 nm pour PMT1 et 650-750nm pour PMT3. Sélectionnez le psudocolor à utiliser pour l’affichage des images en double cliquant sur le rectangle coloré à côté de chaque PMT et choisir une couleur dans le menu contextuel.
  3. Cliquez sur <Live> pour vérifier l’image des échantillons. Utilisez le bouton z-Position à sélectionner un plan de mise au point au sein de la région XY d’intérêt. Régler la luminosité des images par le réglage de l’intensité du laser, la smart gain et l’offset. Pour chaque canal de fluorescence, effectuez ce réglage sous le mode d’affichage de <QLUT> (Quick Look Up Table). Cliquez sur le bouton <QLUT> pour accéder au mode QLUT, dans lequel les pixels saturés sont affichés en bleu pour faciliter le réglage du niveau de luminosité appropriées. Cliquez deux fois sur le bouton <QLUT> pour revenir au mode d’affichage pseudo-couleur.
    Remarque : Les valeurs numériques du réglage peut varier entre chaque expérience.
  4. Pendant le balayage, tournez le bouton de Z-Position vers la gauche pour déplacer le plan de mise au point à une extrémité du volume d’intérêt, puis cliquez sur la flèche de <fin> pour définir la position de fin numérisation. Puis tourner le bouton Z-Position pour déplacer le plan de mise au point par le biais de l’échantillon à l’autre extrémité du volume d’intérêt et puis cliquez sur la flèche de <Begin> pour définir la position de début numérisation.
    Remarque : Pour la comparaison entre les différents échantillons, définir le même Z-volume pour les différents échantillons.
  5. Ajuster la taille de z-étape 3 µm. changement de la qualité de l’image en sélectionnant un format de 1024 x 1024, vitesse de 100 Hz et la moyenne de la ligne de 2.
  6. Sélectionnez <Démarrer > pour démarrer l’acquisition d’image de z-pile.
  7. Pour une projection maximale de la pile d’images acquises, cliquez sur l’onglet <processus> et <outil>, sélectionnez <Projection 3D> puis entrez <maximale> dans la liste méthode sans changement de X, Y et Z. Set <Seuil> 0. Cliquez sur <appliquer>. L’intensité maximale du Z-volume va être empilée en une image 2D qui apparaît (Figure 4 a).

5. analyse des vaisseaux sanguins et les réseaux de fibres nerveuses

  1. Analyse de 2D images par l’intermédiaire de logiciels open source (voir Table des matières)19
    1. Ouvrez les images superposées dans le logiciel. Ajuster l’intensité et le diamètre du vaisseau jusqu'à ce que toutes les structures du navire peuvent être correctement sélectionné (Figure 4 b).
    2. Sélectionnez exécuter l’analyse et exporter les données en suivant les instructions du logiciel.
  2. Analyse de 3D images via le logiciel sous licence (voir Table des matières)
    1. Ouvrir les données brutes d’images avec le logiciel. Ajustez le seuil et autres paramètres jusqu'à ce que les structures de bâtiment dans chacune des couches du z-volume sont correctement sélectionnés (se reporter au guide d’utilisation pour plus de détails sur le logiciel) (Figure 4).
    2. Analyser les caractères de certains segments et exporter les données en suivant les instructions du logiciel.

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Representative Results

La partie distale du tissu adipeux blanc épididymaire (eWAT), région médiale de la dorso blanc tissu adipeux sous-cutané (sWAT) et région médiale du tissu adipeux brun interscapulaire (BAT) ont été recueillis. Les endroits pour la collecte de ces tissus sont indiqués à la Figure 1.

Figure 1
Figure 1 : anatomie du tissu adipeux blanc sous-cutané (sWAT), le tissu adipeux blanc épididymaire (eWAT) et tissu adipeux brun (TAB) indique les régions utilisées pour collecter les échantillons. (A) les régions décrites par des lignes pointillées blanches représentent sWAT, et l’emplacement de l’astérisque blanche a mis en évidence est le site de collecte de sWAT. Les régions décrites par des pointillés noirs sont eWAT, et l’emplacement d’astérisque noir a mis en évidence est le site de collecte eWAT. (B) les régions décrites par des pointillés noirs sont BAT, et la région de collection de tissus est mis en évidence par l’astérisque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Après entier-Montez la souillure, les morceaux de tissu ont été montées dans un puits de 1 mm de profondeur (Figure 2)

et imagés avec la microscopie confocale. Tout d’abord, nous avons testé l’effet de l’étape de compensation avec l’incubation 90 % glycérol sur la qualité des images. Nous avons constaté que plus les vaisseaux sanguins ont été positivement colorées avec le α-endomucin anticorps dans le sWAT de glycérol-incubés, suggérant que l’étape de compensation est critique pour la coloration complète des vaisseaux sanguins (Figure 3, comparer des panneaux A et B).

Figure 2
Figure 2 : diagrammes des puits pour l’imagerie volume. (A) diagramme d’une diapo avec un balancier de silicone. (B) schéma d’un puits avec de multiples couches de ruban faite par notre laboratoire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : comparaison des cas les images des vaisseaux sanguins acquiredwith ou sans compensation optique étape avec 90 % de glycérol. (A) ensemble monture immunofluorescence (IF) coloration avec anticorps anti-endomucin (vert) à sWAT. L’échantillon n’était pas soumis à l’étape de compensation optique (étape 3.10). (B) entier-montent si la coloration avec l’anticorps anti-endomucin à sWAT. L’échantillon est soumis à l’étape de la compensation optique (étape 3.10) avant les étapes de montage (étapes 3.11 et 3.12). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Cependant, l’étape de compensation avec le glycérol n’a pas affecté l’intégrité ou la forme des vaisseaux sanguins (Figure 3). Compte tenu de ces effets bénéfiques, dans les expériences suivantes, l’étape de nettoyage a été effectuée.

Nous avons en outre comparé les résultats d’analyses 2D et 3D à l’aide de différents logiciels (voir Table des matières). Nous avons constaté que, tandis que les images 3D apparemment fourni plus d’informations structurelles, les deux méthodes analytiques finalement n’a pas démontré des différences significatives en termes de longueur et la direction générale de la nombre des vaisseaux (Figure 4).

Figure 4
Figure 4 : comparaison des analyses 2D et 3D sur la structure du navire. (A) l’effet de projection maximum sur les images. (B) les résultats d’analyse par le logiciel 2D (voir Table des matières). En particulier, les lignes rouges indiquent squelette sélectionné, tandis que les points bleus indiquent les points de l’image de marque. (C) l’analyse des résultats par le logiciel 3D (voir la Table des matières). La zone grise est la région sélectionnée pour l’analyse. La ligne verte indique les segments mesurés et points verts indiquent les nœuds mesurées. (D) la comparaison de la longueur du bateau, les numéros de segment, ramification nombre de noeuds et noeud terminal numéros analysés par les méthodes 2D ou 3D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Publications antérieures ont démontré que les différents dépôts adipeux possèdent des propriétés hétérogènes1,18. Ici, nous avons cherché à déterminer si les vaisseaux sanguins et fibres nerveuses présentent différents modèles parmi les dépôts en utilisant notre méthode nouvellement développé. Pour ce faire, nous avons réalisé IF co marquage avec des anticorps de α-TH (pour les fibres nerveuses) dans le tissu adipeux et α-endomucin (pour les vaisseaux sanguins). Fait intéressant, les résultats ont montré qu’il y a beaucoup plus de vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le BAT par rapport au WATs (Figure 5, voies bas comparer à voies supérieurs et moyens)

Figure 5
Figure 5 : comparaison des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses acquis auprès de différents dépôts adipeux. Entier-montez si coloration avec anti-endomucin (vert) et anti-tyrosine hydroxylase (TH) (rouge) anticorps dans eWAT (A, B, a fusionné en ut), sWAT (D, E, a fusionné en fa) et BAT (G, H, ont fusionné en j’ai). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Entre le WATs, le sWAT présentait une densité plus élevée de vaisseaux sanguins que l’eWAT (Figure 5, comparer le milieu et la top lane). À noter, alors que les fibres nerveuses développée en parallèle avec les vaisseaux sanguins, ils n’ont pas montré co-localisation importante (Figure 5, voies fusionnées). De plus, nous avons mesuré quantitativement la zone du navire, nombre de jonctions et de longueur de tube avec la méthode 2D et trouvé des résultats similaires comme décrit ci-dessus (Figure 6).

Figure 6
Figure 6 : analyse Quantitative de vasculaire et de réseaux de fibre nerveuse. (A) le pourcentage de superficie de vaisseaux sanguins dans les échantillons d’eWAT, sWAT et BAT. (B) le nombre de jonctions de vasculaire réseaux dans eWAT, sWAT et BAT. (C) le navire total longueur des réseaux vasculaires dans eWAT, sWAT et BAT. (D), le pourcentage de neve surface des fibres dans les échantillons d’eWAT, sWAT et BAT. (E) le nombre de jonctions des fibres nerveuses dans eWAT, sWAT et BAT. (F) total longueur des fibres nerveuses chez eWAT, sWAT et BAT. Les analyses ont été réalisées avec le logiciel 2D. Les résultats ont été obtenus à partir des images présentées à la Figure 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

En résumé, cette approche teinté avec succès conjointement les vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans différents tissus adipeux.

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Discussion

Remodelage du tissu adipeux est directement liée à la dysrégulation métabolique au cours de l’obésité développement1,2. Angiogenèse et innervation sympathique sont toutes deux essentielles pour la retouche dynamique processus2,12. Développement d’une approche applicable pour visualiser les nouveaux vaisseaux sanguins, mais aussi les fibres nerveuses sont donc d’une grande importance. Méthodes précédentes ont été rapportés pour documenter l’angiogenèse dans le tissu adipeux. Toutefois, certaines questions restent avec ces approches, notamment la faible efficacité de la résolution tatillonne et fond bruyant. Pendant ce temps, une innervation sympathique a seulement été reconnue récemment comme une étape cruciale dans le tissu adipeux pathologie14. Même si les résultats connexes sont intéressants, méthodes appliquées nécessitent des outils avancés de microscopie et prennent du temps. Nous rapportons ici une approche facile à suivre, modifiée par rapport à notre protocole précédent pour la coloration des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses sympathiques. Fait intéressant, nous avons teinté avec succès les vaisseaux sanguins et fibres nerveuses avec une haute résolution, et la coloration a des qualités comparables aux images rapportées antérieurement,18.

Nous avons précédemment teinté les vaisseaux sanguins dans les tissus adipeux par immunohistochimie ou par immunofluorescence avec l’anticorps de le α-CD31, un marqueur des cellules endothéliales, les diapositives de paraffine8,13,20. Alors que la méthode permet de distinguer les vaisseaux sanguins de densité entre les différents groupes, les vaisseaux microvasculaires qui ont été colorées positivement n’étaient pas terminées. Ici, nous avons choisi une méthode d’entier-montent et effectuée si la coloration avec un anticorps de α-endomucin, un nouveau marqueur pour les vaisseaux sanguins. Avec cette approche optimisée, nous avons pu réaliser la coloration avec plus les vaisseaux sanguins, en particulier les navires de microblood. En outre, dans cette méthode, étant donné que nous avons évité les étapes comme la fixation de l’incorporation et de formol de paraffine, qui sont susceptibles de porter atteinte à l’intégrité des vaisseaux sanguins, nous avons obtenu des images avec une résolution plus élevée et plus les vaisseaux intacts. La structure irréprochable des vaisseaux plus loin nous a permis de mesurer et de comparer leurs longueurs, ramification et zones. À noter, nous avons ajouté une étape de compensation avec le glycérol, alors les morceaux de tissus pourraient devenir plus transparentes, et cette étape simple mais critique augmenté de manière significative l’efficacité de la coloration de18,21.

En raison des niveaux élevés de la teneur en lipides dans le tissu adipeux, susceptibles de limiter l’accessibilité des anticorps dirigés contre les régions intérieures du tissu, nous avons coupé les dépôts en petits morceaux pour assurer les anticorps adéquats se liant aux protéines cibles. Par conséquent, notre méthode de taches avec succès plus de vaisseaux sanguins et fibres nerveuses que les taches sur les tissus entiers. Toutefois, il peut perdre l’information spatiale et donc de compromettre l’intégrité des fibres nerveuses. Pour résoudre ce problème apparent et s’assurer que les images sont comparables chez les souris individuels, il est suggéré de recueillir les petits morceaux de ces mêmes régions dans les dépôts adipeux. Si il faut encore plus d’informations spatiales, plus épaisses doivent être obtenues pour la coloration. Pour plus grands échantillons, fixation plus longue temps avec des doses plus élevées de la FPA, des concentrations plus élevées de détergents pour perméabilisation, et plus longues périodes d’incubation des anticorps peuvent être nécessaire.

Le tissu adipeux innervation a été étudiée récemment. Plusieurs avancées techniques ont été appliquées afin de visualiser les fibres nerveuses14,17. Ces méthodes sont coûteuses ou de longue durée. Ici, nous avons simplement effectué une tache IF avec α-e (un marqueur de nerf sympathique) et avec succès teinté les fibres nerveuses sympathiques à une haute qualité. Plus important encore, nous avons effectué la coloration conjointement avec le α-endomucin et α-TH pour étudier comment les vaisseaux sanguins corrélation avec les fibres nerveuses sympathiques au cours de remodelage du tissu adipeux.

À noter, nous avons comparé les résultats d’analyses 2D et 3D à l’aide de différents logiciels. Il a été constaté que, tandis que les images 3D fourni plus d’informations structurelles, les deux méthodes analytiques n’ont pas montré de différence significative en fonction de la longueur et la ramification des vaisseaux. Finalement, lors de l’analyse avec la méthode 3D, le logiciel lui-même peut détecter certains signaux erronés qui ont besoin d’être ajusté manuellement. Étant donné que le logiciel 2D est conçu pour l’analyse de navire, il est donc suggéré d’utiliser cette méthode pour mesurer quantitativement la structure des navires.

Avec cette méthode, les vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le tissu adipeux différent ont été conjointement colorées, et leurs densités, ramification et les longueurs ont comparé19. Il a été constaté que les vaisseaux sanguins et fibres nerveuses sont beaucoup plus épais dans le BAT par rapport au WAT, suggérant que la chauve-souris est un dépôt adipeux plus métaboliquement actif. En outre, les vaisseaux sanguins et les densités de nerf dans le sWAT étaient plus élevées que dans l’eWAT, indiquant que les différentes WATs ont des profils différents de retouche.

En conclusion, cette méthode efficacement conjointement les taches des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le tissu adipeux5. En outre, il constitue un outil utile pour étudier les changements dynamiques dans le tissu adipeux au cours du développement de l’obésité.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par le National Institute of Health (NIH) subvention R01DK109001 (K.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

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References

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Coloration des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le tissu adipeux
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Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K.… More

Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

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