Summary
Udfordringen ved epilepsi forskning er at udvikle nye behandlinger for patienter, hvor klassisk terapi er utilstrækkelig. Ved hjælp af en ny protokol — ved hjælp af et implantabelt lægemiddel levering system — vi er i stand til at kontrollere anfald i bedøvet mus ved elektroforetisk levering af GABA i epileptiske fokus.
Abstract
Epilepsi er en gruppe af neurologiske lidelser, som påvirker millioner af mennesker i hele verden. Selv om behandling med medicin er nyttigt i 70% af tilfældene, alvorlige bivirkninger påvirker patienternes livskvalitet. Desuden er en høj procentdel af epileptiske patienter resistente over for lægemidler; i deres tilfælde, Neurokirurgi eller neurostimulation er nødvendige. Derfor er det vigtigste mål for epilepsi forskning at opdage nye terapier, som enten er i stand til at helbrede epilepsi uden bivirkninger eller forebygge tilbagevendende anfald hos lægemiddelresistente patienter. Neuro teknik giver nye tilgange ved at bruge nye strategier og teknologier til at finde bedre løsninger til at helbrede epileptiske patienter i fare.
Som en demonstration af en ny forsøgsprotokol i en akut musemodel af epilepsi anvendes et direkte in situ-elektroforetisk lægemiddel udbringningssystem. Nemlig en neurale sonde, der inkorporerer en mikrofluidic ion pumpe (μFIP) for on-demand lægemiddel levering og samtidig registrering af lokal neurale aktivitet implanteres og påvises at være i stand til at kontrollere 4-aminopyridin-induceret (4AP-induceret) beslaglæggelse-lignende hændelse (SLE). Den γ-aminosmørsyre (GABA) koncentrationen holdes i det fysiologiske område ved den præcise kontrol af GABA levering at nå frem til en antiepileptisk effekt i beslaglæggelse fokus, men ikke at forårsage over hæmning-induceret rebound brister. Metoden gør det muligt både påvisning af patologisk aktivitet og intervention for at stoppe anfald ved at levere hæmmende neurotransmittere direkte til epileptisk fokus med præcis spatiotemporal kontrol.
Som et resultat af udviklingen til den eksperimentelle metode, SLEs kan induceres i en meget lokaliseret måde, der giver beslaglæggelse kontrol af den præcist indstillede GABA levering på anfald debut.
Introduction
Epilepsi er den fjerde mest almindelige neurologiske lidelse: ca. 1% af befolkningen lider af epilepsi, og omkring en tredjedel af de berørte har tilbagevendende anfald. I de fleste tilfælde kan krampeanfald styres med medicin. Men, Drug behandling skal indstilles for hver patient individuelt, hvor korrekt dosering kan tage år at finde1,2. Derudover, de fleste af medicinen har alvorlige bivirkninger, der reducerer livskvaliteten3,4,5,6,7. Endelig, i 30% af tilfældene patienter er resistente over for medicin, og i tilfælde af en konstant enkelt anfald generator locus, kun reective Neurokirurgi kan dæmpe forekomsten af krampeanfald8. Derfor er et stort initiativ i moderne epilepsi forskning at opdage nye strategier, som kan forhindre tilbagevendende anfald hos patienter i risiko, og samtidig reducere behovet for stærke Drug terapier og invasive reektive operationer.
Epileptiske anfald opstår, når der er en ubalance i excitatoriske og hæmmende kredsløb enten i hele hjernen (generaliseret epilepsi) eller i en lokaliseret del af hjernen (fokal epilepsi), således at neuroner udledning i en unormal måde9 , 10 stk. , 11. antiepileptiske lægemidler kan optræde på to forskellige måder i forebyggelse af krampeanfald: enten faldende excitation eller øget hæmning12. Specifikt, de kan enten ændre den elektriske aktivitet af neuronale celler ved at påvirke Ionkanaler i cellemembranen13 eller handle på kemisk transmission mellem neuroner ved at påvirke den hæmmende neurotransmitter GABA eller excitatoriske glutamat i synapserne14,15. For nogle medikamenter, virkningsmåden er ukendt18. Også, Drug behandlinger har en kontinuerlig effekt på patienter og kan ikke tilpasse sig udbredelsen dynamik af anfald. Ideelt set ville narkotika med specifikke virkningsmekanismer handle på de underliggende epileptiske processer. En optimal behandling ville ikke røre hjernen interictally, men ville handle straks, når et anfald begynder at udvikle. I modsætning hertil, i alle tilfælde af epilepsi, medicin nu betyder en systematisk behandling, der påvirker hele hjernen og hele kroppen af patienten9.
Epileptiske anfald kan forekomme mange år efter den indledende fornærmelse, såsom hjernen traumer. Perioden mellem den indledende fornærmelse og forekomsten af de første spontane anfald er karakteriseret ved betydelige molekylære og cellulære reorganisationer, herunder neuronal død med forsvinden af neuronal netværksforbindelser og axonal sprouting/neosynaptogenesis med fremkomsten af nye forbindelser19,20,21. Når anfald bliver tilbagevendende, deres hyppighed og sværhedsgrad tendens til at stige, involverer mere hjernen regioner. Det er vigtigt at skelne mellem steder af anfald debut (epileptogene regioner) fra formering netværk, som reglerne for beslaglæggelse Genesis og formering kan afvige. Forskning udført på humane væv og eksperimentelle modeller af epilepsi har givet vigtige data vedrørende reorganisering af kredsløb og deres evne til at generere krampeanfald20,21,22, 23. det er imidlertid vanskeligt at afgøre, om disse reorganisationer er adaptiv respons, eller om de er kausalt relateret til epileptogenesis eller beslaglæggelse Genesis og formering12.
At lokalisere det epileptiske fokus og anvende antiepileptiske lægemidler lokalt er derfor en af de største udfordringer i den samtidige epilepsi forskning. Flere eksperimenter ved hjælp af animalske modeller af epilepsi og nogle kliniske undersøgelser havde til formål at finde udbrud af anfald og definere de underliggende mekanismer i hjernen24,25,26,27. Med henblik herpå har vi udviklet en ny forsøgsprotokol ved hjælp af 4ap-induceret epilepsi model28,29,30,31 i en akut mus forberedelse, som giver mulighed for præcis indsættelse af tre enheder i det givne område af hippocampus, hvor netværksaktivitet in vivo manipuleres på en meget lokaliseret måde. Lokaliseret 4AP injektion af en glas mikropipette hjælper med at inducere epileptiske SLEs i en lokaliseret plet i hippocampus, mens ved hjælp af den roman polymer-baserede μFIP sonde kontrol af beslaglæggelses aktiviteten opnås samtidig ved at optage neuronal elektrisk aktivitet med enhedens optagelsessteder. Hippocampal lokal felt aktivitet overvåges også med en multikanals silicium sonde i en lagspecifik måde i cortex og i hippocampus samtidig.
De nyligt opfandt μFIP sonder arbejde ved hjælp af en anvendt elektrisk felt til at skubbe ladede lægemidler lagret i en mikrofluidic kanal på tværs af en ionbytter membran (IEM) og ud til det omgivende væv (figur 1). IEM over transporterer selektivt kun én type ion (kation eller anion) og arbejder således på at begrænse både passiv diffusion i "slukket" tilstand og transport af modsætninger ladede arter fra det omgivende væv ind i anordningen. Det elektriske felt skabes efter behov ved at anvende en lille spænding (< 1 V) mellem kilde elektroden, som er intern i den mikrofluidiske kanal, og en målelektrode, som er udvendig for anordningen (i dette tilfælde hoved skruen på dyre modellen). Hastigheden af lægemiddel levering er proportional med den anvendte spænding og den målte strøm mellem kilde-og målelektroderne. Den præcise tunbarhed af narkotika levering er en af de primære fordele ved μFIP. En anden kritisk fordel, sammenlignet med Fluidic eller tryk-baserede narkotika Delivery systemer, er, at i μFIP er der kun en ubetydelig trykstigning på lægemidlet levering Outlet som stoffer leveres på tværs af IEM uden deres Carrier løsning.
Der er en lille mængde af passiv lækage af GABA, når μFIP er "off", men dette blev fundet ikke at gennemføre SLEs. ΜFIP er skræddersyet efter konventionelle mikrofabrikations metoder, som vi rapporterede tidligere31.
Da en måde at forhindre tilbagevendende anfald er blokaden af nettet udledninger i begyndelsen eller endda før den første beslaglæggelse begivenhed, den præsenterede metode til at levere den hæmmende neurotransmitter GABA i epileptiske fokus har stor terapeutiske potentiale for beslaglæggelse kontrol hos patienter med fokal epilepsi. Da GABA er en endogene substrat, det efterlader iboende neuronal egenskaber uændret i fysiologiske koncentrationer. Den lokale anvendelse af lave niveauer af GABA vil kun påvirke celler naturligt lydhør over for hæmning, og vil kun forårsage lignende effekter til fysiologiske hæmning, i modsætning til dyb hjerne stimulation (DBS), som har uspecifikke handlinger ved at stimulere alle celler af neuronal netværk i sit miljø, forårsager en blandet respons involverer både excitation og hæmning. Konklusionen er, at den foreslåede metode giver en mere specifik tilgang til beslaglæggelse kontrol end DBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført i henhold til de etiske retningslinjer for Institut de neurosciences des Systèmes og godkendt af de lokale etiske komitéer og veterinær kontorer.
Bemærk: 17 voksne mandlige OF1 mus blev brugt til forsøgene. Mus blev oplært til en 12 h lys/mørk cyklus med mad og vand til rådighed ad libitum.
1. anæstesi
- Injicer intraperitonealt en blanding af ketamin og xylazin (100 mg/kg legemsvægt og 10 mg/kg legemsvægt) for at bedøve dyret.
-
Kontroller niveauet af anæstesi ved at observere respiratorisk hastighed og røring og ved at kontrollere musens respons på smerte.
Bemærk: når musens vejrtrækning bliver regelmæssig, ingen røring kan observeres, og dyret reagerer ikke på hale klemte, anæstesi er dyb nok til at fortsætte.- Anbring dyret på en elektrisk programmerbar varmepude. Dæk den rektal temperatur sonde med et olie gelé-baseret produkt (Se tabel over materialer) og læg det forsigtigt ind i endetarmen (1 – 2 cm dyb) af musen for at overvåge dens kropstemperatur. Hold en kropstemperatur mellem 36,5 og 37,5 °C under de kirurgiske procedurer og eksperimentelle optagelser.
- Overvåge anæstesiniveau ved at kontrollere musens reflekser, hale bevægelser, og dens hyppighed af vejrtrækning. Under hensyntagen til niveauet af anæstesi registreret mindst hver 30 min, give en lille dosis af en ketamin-xylazin cocktail (20 – 50 μL, den samme koncentration, der anvendes som før) intramuskulært.
2. kirurgi/kraniotomi
- Fastgør muse hovedet i en stereotaxatisk ramme. Brug en 30 G kanyle, Injicer lokal analgetisk ropivacain (5 μl, 7,5 mg/ml, se tabel over materialer) subkutant på den planlagte indsnit site. Tillad 5 min for at træde i kraft.
- Lav en lige skåret midterlinje i huden over kraniet med en skalpel. Træk forsigtigt huden mod siderne med fine pincet og klem den til side med bulldog serfinere klemmer til at forlade kraniet udsat for yderligere arbejde.
- Rengør kraniet af fascia med en skalpel eller et lignende værktøj. I tilfælde af overfladisk blødning, fjerne blodet med vatpinde eller små stykker papir håndklæde.
- Tag en poly (3,4-ethylenedioxythiophene) polystyren sulfonat (PEDOT: PSS)-belagt jord skrue (størrelse: #00, diameter: 0,047 i, længde: 1/8 i, se tabel over materialer) med en loddet ledning og Tilslut den med en konnektor til forstærkeren hovedscenen.
- Fugt kraniet på det ønskede hulsted, og bor et hul ved høj hastighed med en fin, rund borekrone (med en diameter på 0,4 mm) på kraniet over cerebellum, indtil Dura er synlig. Sæt jord skruen i hullet og skru den ind med en præcisions skruetrækker, indtil den når toppen af cerebellum.
Bemærk: Hoved skruen blev dip-belagt med en PEDOT: PSS-opløsning, der indeholder 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) efter vægt efterfulgt af bagning ved 140 °C i 90 min. PEDOT: PSS er en konjugeret polymer med en volumetrisk kapacitans, der vides at være biokompatibel. GOPS er en cross-linker blandet med PEDOT: PSS for at øge stabiliteten i vandige medier (figur 2). - Ved hjælp af den stereotaxatiske ramme, måle de stereotype koordinater for den ønskede hjerneregion. For eksempel er den region af interesse er hippocampus, anteroposterieller (AP)-1,8 mm og mediolaterale (ML) 1,8 mm fra Bregma punkt baseret på hjernen Atlas for mus32.
Bemærk: Disse er koordinater for den højre halvkugle (figur 2). - Tynd en ca. 1 til 2 mm diameterområde af kraniet over målområdet ved hjælp af en pålidelig dental boremaskine (Se tabel over materialer), der er indstillet på en hurtig hastighed, indtil en tynd, velpoleret, gennemsigtig knogle membran forbliver.
- Derefter, hvis tykkelsen af knogle membranen er tynd nok (< 200 μm), lave et lille hul med tynde pincet og forsigtigt fjerne det tynde lag af knoglen33. Brug Specialsyet nål-tippet kanyle til at fjerne Dura. Minimer størrelsen af kraniotomi og durotomi for at forhindre udvikling af ømmer og for at minimere hjernens og/eller respiratoriske pulsationer i hjernen.
Bemærk: Kraniotomi skal fyldes med en dråbe saltvandsopløsning for at forhindre tørring og derefter regelmæssigt genopfyldes under forsøget (figur 2).
3. indsættelse af Multichannel Silicon Probe
- Brug stereotaxic arme i en lille AP vinkel (20 °) for silicium sonde til at give rigelig plads til positionering af de to andre implantater og at have optagelsen og injektionsstederne af elektrode, Ion pumpe, og mikropipetten så tæt som muligt.
Bemærk: Elektroder, sprøjter, og ion pumper blev dækket med en dråbe DiI Stain opløsning (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perchlorat [DiI]), for post hoc visualisering af implantations spor (0,5 mg/ml DiI i dimethylsulfoxid). - Anbring silikone sonden på den stereotaxoniske arm, der er fastgjort til en magnetisk holder, og anbring den ved siden af den stereotaxatiske ramme. Indstil AP-vinklen (20 °), og tilslut derefter sonden til hovedscenen og til jord skruen.
-
Sænk langsomt silicium sonden ind i hippocampus ved hjælp af den mikron-præcise stereotaxiske arm eller en motoriseret micromanipulator for at undgå side bevægelser (figur 2 og figur 3).
- Start indspilnings softwaren, og Optag – med hovedscenen, den tilsluttede forstærker og en computer – elektriske neuronale signaler, mens du flytter multikanals silicium sonde fra toppen af cortex, indtil den målrettede dorsoventral (DV) position er nået (- 1.800 μm fra den kortikale overflade). Optag og se det lokale felt potential signal (LFP) under penetration på computerskærmen.
Bemærk: Kontroller nedstigning af sonden, så den bevæger sig langsomt og kontinuerligt under optagelsen, for at have bedre visuel kontrol for indtrængning og for at nå målzonen. - Brug ripple-aktiviteten i det pyramideformede lag af hippocampaldannelsen i det indspillede LFP som markør for målzonen.
Bemærk: Ripple aktivitet er synlig på en eller to tilstødende kanaler af multikanal silicium (SI) sonde med en 100 μm afstand mellem optagelsessteder (figur 4). - Optag LFP-signaler fra lagene i cortex og hippocampus samtidig gennem multikanal forstærkeren software (Se tabel over materialer) ved hjælp af multikanal si sonder (figur 4).
- Start indspilnings softwaren, og Optag – med hovedscenen, den tilsluttede forstærker og en computer – elektriske neuronale signaler, mens du flytter multikanals silicium sonde fra toppen af cortex, indtil den målrettede dorsoventral (DV) position er nået (- 1.800 μm fra den kortikale overflade). Optag og se det lokale felt potential signal (LFP) under penetration på computerskærmen.
4. indsættelse af μFIP
- Tilslut rørene (Se tabel over materialer) til indgangen af μFIP og fylde sonden med 0,05 M GABA opløsning. Fjern rørene og luk indløbet med paraffin film indpakning. Tilslut elektriske ledninger til kilde målings enheden.
- Isæt μFIP ved hjælp af den stereotaxoniske arm ved en mediolaterisk (MP) vinkel (20 °). Si-sonden forbliver indsat under hele processen.
Bemærk: μfip er meget fleksibel og kan drage fordel af støtte fra en lille og ren pensel til at holde det lige, indtil det når hjernen overflade. Efter dette trin kan μFIP sænkes forsigtigt med aksiale bevægelser. - Sænk μFIP langsomt med aksiale bevægelser og lad det aldrig bøje under banen, indtil det når dorsoventral (DV) koordinaten (-1.200 μm fra den kortikale overflade).
Bemærk: Prøv at sætte de to enheder (μFIP og silicium sonde) så tæt på hinanden som muligt, i betragtning af 300 μm afstand fra stikkontakten fra μFIP spidsen.
Forsigtig: undgå mekaniske problemer mellem enhederne og deres konnektorer under isætning (figur 2b og figur 3b).
5. klargøring af anordninger til induktion af krampeanfald
- Udskift sprøjtens metalnål (10 μL) (Se tabel over materialer). Fjern nåle-Holding metaldelen, Anbring og fastgør mikropipetten (udvendig diameter [OD]: 1,2 mm, indvendig diameter [ID]: 0,75 mm, spids diameter: 20 – 50 μm med ± 0,5 cm af skaftet), og Udskift derefter nåle-holde elementet.
- Anbring sprøjten og den vedlagte borosilicat-mikropipette ved en 20 ° lateromedial (LM) vinkel til injektion af 4AP (50 mM i kunstig cerebrospinalvæske [ACSF]).
Forsigtig: Brug ikke sprøjtens metalnål eller en mikropipette med et spids, der er større end 50 μm. - Tegn 500 nL – 1 μL 50 mM 4AP ved hjælp af en automatiseret mikroinjektionspumpe.
6. isætning af glas pipette fastgjort til en sprøjte til 4AP injektion
- Sænk glas mikropipetten, der er fastgjort til sprøjten, til den mål-DV-position (-1.500 μm), og Injicer derefter 250 nL af 4AP-opløsningen (figur 2 og figur 3). Start optagelsen med optagelses softwaren. Se skærmen og vente på den første interictal Spike til at dukke op.
- Start GABA levering af μFIP straks med udseendet af den første interictal Spike. Levere GABA ved at anvende 1 V mellem kilde og mål for 100 s efterfulgt af 1 s off, for 30 cyklusser. Ved hjælp af optagelsen software, rekord for et minimum af 2 timer.
Bemærk: Den samlede masse af den leverede GABA er omkring 1 nmol (figur 5). - I slutningen af eksperimentet, forsigtigt fjerne de indsatte sonder og jorden skrue, og fjerne dyret fra stereotaxic udstyr. Dyr blev euthaniseret ved hjælp af en overdosis af lægemidlet (i. p. 100mg/kg pentobarbital). Døden blev bekræftet ved ophør af åndedræt og cirkulation.
7. evaluering af placeringen af implantaterne
- Efter euthanizing dyret, perfuse det transcardially, først med 50 mL saltvand og derefter med 150 mL af en iskold fikserings opløsning indeholdende 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB)34.
Forsigtig: PFA er farlig og skal håndteres med omhu. - Halshugge dyret, og derefter fjerne huden og musklen fra toppen og siderne af kraniet. Startende fra foramen magnum, gør laterale snit i kraniet mod ørerne og en sagittale midterlinje indsnit, idet der udvises stor omhu for ikke at beskadige hjernen. Fjern forsigtigt kraniet med en knogle trimmer. Fjern hjernen, og skær derefter en vævs blok fra det område af interesse (fra Bregma punkt,-1 til-3 mm AP) ved hjælp af en hjerne matrix (Se tabel over materialer).
- Lim vævs blokken til præparatholderen af en vibratome, sæt stativet i det, og sæt vibratome til 40 μm tykkelse i et PB bad gøre 40 μm koronale sektioner.
- Vask grundigt med 0,1 M PB. Følg histologisk protokol for glia fibrillær syreholdigt protein (GFAP) farvning31.
- Monter sektioner på rutsjebaner, og dæk dem med et monterings medium, der indeholder 2-(4-amidinophenyl)-1H-indol-6-carboxamidin (DAPI) (Se tabel over materialer).
8. Konfokal mikroskopi
- Anbring diasene med de farvede koronale sektioner under et 20x mål for et confokalt mikroskop. Vælg målområdet.
- Vælg den optimale excitation og emission (exc/EMS) filtersæt til farvestofferne som følger: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm, og fluorescein (Se tabel over materialer) = 490/525 nm.
Bemærk: Da farvning varierer pr. afsnit, skal der fastlægges et passende interval af minimal og maksimal excitation og detektion for hvert afsnit, hvor de mindst tætte og mest tætte regioner begge viser emission. - Vælg den mindst tætte region, og Indstil laser intensiteten og detekteringen til høje værdier, og bekræft derefter ved de tætteste områder, om disse værdier forårsager overmætning af den fundne emission. Hvis det er tilfældet, skal du sænke værdierne og kontrollere dem igen med den mindst tætte region. Gentag disse trin, indtil du ankommer til den højest mulige opdagelse ved lave farvnings niveauer og korrekt, ikke overmættede niveauer på meget farvede områder. Gentag denne proces for alle farvestoffer.
- Brug felt scanningsfunktionen i mikroskopet med 512 x 512 pixels pr. flise for at få et stort overblik over sonde indsættelses stederne med en passende opløsning til post hoc-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her med en 4AP epilepsi model i bedøvede mus, kan kontrol af epileptiske anfald opnås i det epileptiske fokus. Den præcise lokalisering af implantater (figur 2) hjalp til at registrere hippocampus lokale felt potentialer (lfp'er, figur 4), at fremkalde små hippocampus anfald og at levere GABA på anfald debut. Lokaliseringen af implantaterne blev verificeret efter hvert forsøg med post hoc-histologi (figur 3).
I tilfælde, hvor SLEs kun var til stede i hippocampus, blev epileptisk aktivitet sat under fuld kontrol. Figur 5 viser et repræsentativt eksempel på, hvornår SLES kunne stoppes med leveringen af GABA af romanen neuronal sonde, der inkorporerer en μFIP. Når 4AP blev injiceret i et større område eller på toppen af cortex, epileptiske anfald blev generaliseret, så den leverede GABA var ikke i stand til at ændre omfanget af epileptiske anfald (figur 6). Leveringen af natrium ioner havde ikke en mærkbar effekt på 4AP-induceret aktivitet (figur 7).
Figur 1: Oversigt for μFIP-sonden. Skematisk visning og virkelige størrelse af μFIP-sonden. (a) skematisk af den implanterede ende af en μFIP-sonde, der viser primære egenskaber. b) foto af en μFIP-sonde med en nål-lignende implanteret ende, der peger opad. Den røde blok er til Fluidic tilslutninger. Skaleringsbar = 1 cm. (c) mikroskop billede af en μFIP sonde spids uden IEM. Skaleringsbar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cranio-durotomi og lokalisering af implantaterne i musens hjerne. (A) Skematisk visning af kirurgi, kraniotomi, og målet for implantaterne i muse hjernen. (B) anvendte stereotype koordinater og vinkler til implantation af de tre enheder. μFIP = 20 ° mediolaterale (ML),-1.200 μm DV (grøn). Multikanals silicium sonde = 20 ° AP,-1.800 μm DV (blå). Mikropipette med sprøjte = 20 ° LM,-1.500 μm DV (rød). Midten af kraniotomi er 1,8 mm ML,-1,8 mm AP til højre halvkugle. Dette tal er blevet ændret fra Proctor et al.31 (Copyright distribueret under Creative Commons Attribution-ikke-kommerciel licens 4,0 (CC by-NC). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: histologisk vurdering af implantations placeringen. Panel (a) viser en skematisk 3D-figur på lokalisering af hippocampus dannelsen i musens hjerne (grøn). Paneler (B, C og D) viser sporene af de implanterede enheder — μfip, mikropipette med sprøjte og multikanal silicium sonde (DiI, rød, pile), henholdsvis31. Paneler (BA, ca, da) viser et højt forstørrelses billede; paneler (BB, CB, DB) viser den tilsvarende side af Paxinos og Franklin Mouse Brain Atlas, hvorimod (BC, CC, DC) viser et lavt forstørrelses billede på hele den koronale del af højre Halvkugle. Skaleringsbar = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Multikanal optagelse fra cortex og hippocampus. LFP-optagelse med en multikanals silicium sonde med en 100 μm afstand mellem optagelsessteder, fra lagene i cortex (hvid) og hippocampus formation (lilla, CARBID = Cornu Ammonis område 1; blå, DG = dentate gyrus. Læg mærke til den bølge aktivitet, der er i CARMIN pyramide. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kontrol af en 4AP-induceret beslaglæggelse af GABA. Repræsentative Elektrofysiologi optagelser fra hippocampus. (A) optagelse i fravær af μFIP-behandling med sles, der starter ca. 30 minutter efter en 4ap-injektion, efterfulgt af status epilepticus. (B) registrering af en sag, hvor μFIP-behandlingen blev initieret umiddelbart efter den første SLE. Optagelsen viser ingen yderligere patologiske hændelser efter behandlingens start. (C) optagelse, hvor μFIP-behandling blev initieret før en 4ap injektion, som ikke udviste patologiske hændelser. De røde pile indikerer en 4AP injektion. Konstant grønne pile angiver starten på μFIP-behandlingen, og åbne grønne pile markerer enden af μFIP-behandlingen. Skarpe toppe ved 100 s intervaller efter en grøn pil er artefakter fra μFIP behandling31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: svigt af kontrol af en 4AP-induceret beslaglæggelse af GABA. Repræsentativ elektrofysiologisk optagelse fra hippocampus i tilfælde, hvor 4AP blev injiceret med den metalliske nål i sprøjten, så epileptiske anfald påvirkede et større hjerneområde. Bemærk, at GABA levering påvirkede ikke beslaglæggelses intensiteten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: køretøjets eksperiment. Kontrol eksperimenter leverer en ækvivalent dosis af natrium ion (na+) i stedet for GABA havde ikke en bemærkelsesværdig effekt på 4ap-induceret aktivitet, viser, at det ikke er den anvendte strøm fra ionpumpen, der moduserer elektrofysiologiske aktivitet, men snarere de leverede molekyler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved at udvikle en ny forsøgsprotokol i en akut musemodel af epilepsi, kunne SLEs med succes styres ved hjælp af en μFIP implanteret i det epileptiske fokus. Takket være sin evne til at levere GABA med tidsmæssig og rumlig præcision, 4AP-induceret SLEs blev kontrolleret ved begyndelsen af anfald. Behandling af epilepsi er teoretisk muligt, hvis kontrollen af de neurale netværk udledninger er opnået på stedet for beslaglæggelse start. Den præsenterede protokol viste sig at være muligt, hvis lokalisering af den injicerede hæmmende neurotransmitter, GABA, er præcis nok til at nå det epileptiske fokus i tide. Men i de tilfælde, hvor epileptiske anfald påvirker større områder af hjernen, beslaglæggelse kontrol af præcis lokaliseret GABA levering er ikke muligt. ΜFIP-sondens indflydelsesområde blev estimeret med en radius på ca. 550 μm fra stikkontakten. Det blev bevist, at SLEs kun kunne blive påvirket, hvis 4AP injektion var lokaliseret til dette område31.
Derfor er metoden nyttig, når epileptiske anfald er lokaliseret, men det var ikke muligt at kontrollere eller stoppe epilepsi, når beslaglæggelserne blev multifoci eller generaliseret. Også, metoden er blevet bevist i bedøvet gnavere; i frit bevægende dyr, er kroniske anvendelser stadig nødvendige for at undersøge effektiviteten af denne protokol.
Mens epilepsi har flere former og er forårsaget af forskellige underliggende mekanismer, er det bevist, at ca. 60% af patienterne har et enkelt epileptisk knudepunkt35. Fordelen ved den lokale administration af en endogene hæmmende neurotransmitter er derfor et nyttigt værktøj til yderligere eksperimentelle dyrestudier og præsenterer en ny strategi til behandling af fokal epilepsi. Den beskrevne metode viste nytten af μFIP behandling i en akut mus undersøgelse og banet vejen for yderligere teknologiske udviklinger for at sikre dens kroniske anvendelse. Vi mener, at netop målrettede elektroforetiske Drug levering enheder kan yderligere tilpasses til at behandle ikke kun epilepsi, men andre neurodegenerative sygdomme samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
C.M.P. anerkender støtte fra et Whitaker International Scholar-stipendium administreret af Institut for international uddannelse. A.K. blev sponsoreret af Marie Curie IEF (nr. 625372). A.W. anerkender finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under eu's Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 716867). A.W. anerkender desuden Excellence-initiativet fra Aix-Marseille Universitet-A * MIDEX, et fransk "Investissements d'Avenir"-program. Forfatterne anerkender Dr. ilke Uguz, Dr. Sahika Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, og Zsófia Maglóczky for deres deltagelse i frugtbare diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J.
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B.
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
