Summary
てんかん研究の課題は、古典療法が不十分な患者のための新しい治療法を開発することです。新しいプロトコルを使用して-移植可能な薬物送達システムの助けを借りて、我々は、てんかんの焦点に GABA の電気泳動配信によって麻酔をかけられたマウスの発作を制御することができます。
Abstract
てんかんは、世界中の何百万人もの人々に影響を与える神経疾患のグループです。薬による治療は 70% の症例で有用であるが、重篤な副作用は患者の生活の質に影響を与える。さらに, てんかん患者の高い割合は、薬剤耐性であります;彼らの場合、脳神経外科または神経刺激が必要です。したがって、てんかん研究の主な目的は、副作用のないてんかんを治療するか、薬剤耐性患者における再発発作を予防することができるいずれかの新しい治療法を発見することです。Neuroengineering は、新たな戦略と技術を使用して、リスクのあるてんかん患者を治療するためのより良いソリューションを見つけることによって、新しいアプローチを提供します。
てんかんの急性マウスモデルにおける新規な実験的プロトコルの実証として、直接現場での電気泳動薬物送達システムが用いられている。すなわち、局所的な神経活動のオンデマンドの薬物送達と同時記録のためにマイクロ流体イオンポンプ (μFIP) を組み込んだ神経プローブを移植し、4-アミノピリジン誘発性 (4AP 誘発) の発作様を制御できることを実証した。イベント (SLE) のアクティビティ。Γ-アミノ酪酸 (GABA) 濃度は、発作の焦点で抗てんかん効果に到達するが、overinhibition 誘発リバウンドバーストを引き起こさない GABA 送達の正確な制御によって生理的範囲に保持されます。この方法は、病理学的活性および介入の両方を検出し、正確な時空制御を用いて阻害性神経伝達物質をてんかん焦点に直接送達することによって発作を停止させる。
実験方法への開発の結果として、SLEs は、発作発症時に正確に調整された GABA 送達による発作制御を可能にする高度に局在化した方法で誘導することができる。
Introduction
てんかんは、第4の最も一般的な神経障害である: 人口の約 1% がてんかんに罹患し、そして約3分の1の罹患者が再発発作を有する。ほとんどの場合、発作は投薬で制御することができます。しかし、薬物治療は個々に患者ごとに設定する必要があり、適切な投薬には1,2を見つけるのに何年もかかることがあります。さらに, 薬のほとんどは、生活の質を低下させる重篤な副作用を持っています3,4,5,6,7.最後に、症例の 30% において、患者は投薬に耐性であり、かつ一定の単一発作発生器遺伝子座の場合には、resective 脳神経外科のみが発作8の発生を減弱させることができる。したがって、現代のてんかん研究における主要なイニシアチブは、強力な薬物療法および侵襲的 resective 手術の必要性を低減しつつ、リスクのある患者の再発発作を防ぐことができる新しい戦略を発見することである。
脳全体 (全身性てんかん) または脳の局在化した部分 (集中型てんかん) の興奮性および阻害回路内で不均衡がある場合に、神経細胞が異常な方法で排出するようなてんかん発作が発生する9,10,11.抗てんかん薬は、発作予防において2つの異なる方法で作用することができる: 刺激を減少させるか、または阻害を増強する12.具体的には、それらは、細胞膜13におけるイオンチャネルに影響を与えることによって神経細胞の電気的活性を改変するか、または抑制性神経伝達物質 GABA または興奮性に影響を及ぼすニューロン間の化学伝達に作用することができるシナプスにおけるグルタミン酸14,15.いくつかの薬について, 行動様式は不明です18.また、薬物治療は患者に継続的な影響を及ぼし、発作の罹患率ダイナミクスに適応することはできません。理想的には、特定の作用機序を有する薬物が、根底にあるてんかんプロセスに作用するであろう。最適な治療は、脳の interictally には触れませんが、発作が発症し始めるとすぐに作用します。それとは対照的に、てんかんのすべての場合において、投薬は、現在、全身の脳および患者9の全身に影響を及ぼす系統的な治療を意味する。
てんかん発作は、脳外傷などの初期の侮辱の後に何年も現れることがあります。初期の侮辱と最初の自発的な発作の発生の間の期間は、ニューロンのネットワーク接続および軸索の消滅によるニューロン死を含む、かなりの分子および細胞の再編成によって特徴付けられる萌芽/neosynaptogenesis 新しい接続の外観19,20,21.発作が再発すると、その頻度と重症度が増加する傾向があり、より多くの脳領域が関与する。発作起源および伝播の規則が異なる場合があるので、伝播ネットワークからの発作発症 (epileptogenic 領域) の部位を区別することが重要である。ヒト組織およびてんかんの実験モデルに対して行われた研究は、回路の再編成および発作を発生させる能力に関する重要なデータを提供している20、21、22、 23. しかし、これらの再編成が適応応答であるか、または epileptogenesis または因果に関連しているかどうかを判断することは困難である。
したがって、てんかんの焦点をローカライズし、抗てんかん薬を局所的に適用することは、現代のてんかん研究における主な課題の1つです。てんかんおよびいくつかの臨床研究の動物モデルを用いたいくつかの実験は、発作事象の発症を見つけ、脳24、25、26、27における根本的なメカニズムを定義することを目的とした。この目的のために、我々は、急性マウス調製において4AP 誘発てんかんモデル28、29、30、31を用いて新しい実験プロトコールを開発し、3つの正確な挿入を可能にする。デバイスは、海馬の所定の領域に、インビボでネットワーク活動が非常に局所的に操作される。ガラスマイクロピペットによる局在4AP 注入は、海馬内の局在したスポットにおけるてんかん SLEs の誘導に役立ち、一方、新規のポリマーベースのμFIP プローブの助けを借りて、発作活性の制御は、ニューロンを記録することによって同時に達成されるデバイスの記録サイトでの電気的活動。海馬局所活性は、また、皮質および海馬における層特異的な方法で、マルチチャンネルのシリコンプローブで同時に監視されます。
最近発明されたμFIP プローブは、応用電界を使用して、イオン交換膜 (IEM) を介したマイクロ流体チャネルに保管され、周囲の組織に帯電した薬物を押し出すことによって動作します (図 1)。IEM は、1種類のイオン (カチオンまたはアニオン) のみを選択的に輸送するため、「オフ」状態での受動拡散と、周囲の組織からデバイスへの反対の荷電種の輸送の両方を制限する働きがあります。電界は、マイクロ流体チャネルの内部にあるソース電極と、デバイスの外部にあるターゲット電極 (この場合は、動物モデル上のヘッドスクリュー) の間に小さな電圧 (< 1 V) を印加することによって、オンデマンドで作成されます。薬物送達の速度は、供給元電極とターゲット極との間の印加電圧および測定電流に比例する。薬物送達の正確な同調は、μFIP の主要な利点の1つである。もう一つの重要な利点は、流体または圧力ベースの薬物送達システムと比較して、μFIP では、薬物がそのキャリア・ソリューションなしで IEM を越えて送達されるため、薬剤送達出口での圧力上昇はごくわずかであるということです。
ΜFIP が「オフ」の場合、GABA の受動的な漏出の少量があります, これは、SLEs を作用しないことが見出されました.ΜFIP は、我々が以前31を報告した従来の微細加工法に従ってオーダーメイドされています。
再発発作を防止する1つの方法は、最初の発作イベントの初めまたは前でのネットワーク放電の遮断であるため、てんかんの焦点に抑制性神経伝達物質 GABA を送達するための提示された方法は偉大な病巣性てんかんを有する患者における発作制御のための治療電位。GABA は内因性の基質であるので, 生理的濃度に変化せず内因性の神経特性を残します.GABA の低レベルのローカルアプリケーションは、阻害に自然に反応する細胞にのみ影響を与える, 脳深部刺激に反して、生理的阻害に類似した効果を引き起こすだけ, (DBS), すべての細胞を刺激することによって非特異的のアクションを持っています。、その環境における神経ネットワークの、励起および阻害の両方を含む混合応答を引き起こす。結論として、提案された方法は、DB よりも焼付き制御に対してより具体的なアプローチを提供する。
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Protocol
すべての実験手順は、インスティテュート・デ・ Neurosciences ・デ・システムズの倫理的指針に従って実施され、地元の倫理的委員会と獣医事務所によって承認される。
注:実験には17人の成人男性OF1マウスを用いた。マウスを、食事および水を自由に利用できるようにして12時間の光/暗サイクルに連行した。
1. 麻酔
- 腹腔内注射して、ケタミンとキシラジンの混合物 (100 mg/kg 体重と 10mg/kg 体重) を麻酔して動物に注入する。
-
呼吸数と whisking を観察し、痛みに対するマウスの反応を確認することによって麻酔のレベルを確認します。
注意:マウスの呼吸が規則的になると、whisking は観察されず、動物は尾のピンチに反応しないので、麻酔は続行するのに十分な深さである。- 電気的にプログラム可能な加熱パッドの上に動物を置きます。直腸の温度プローブを油性ゼリーベースの製品で覆い (材料の表を参照)、マウスの直腸 (1 〜2センチの深さ) に優しく入れて体温をモニターします。外科的処置および実験記録の間に36.5 そして37.5 ° c 間の体温を保ってください。
- マウスの反射、ウィスカの動き、呼吸の頻度を確認して麻酔レベルを監視します。少なくとも30分ごとに記録された麻酔のレベルを考慮に入れて、キシラジンカクテル (20 〜50μ l、前として用いられる同じ濃度) の小線量を筋肉内に与える。
2. 手術/開頭術
- マウスの頭を stereotaxic フレームに固定します。30グラムの針を使用して、局所鎮痛ロピバカイン (5 μ l、7.5 mg/mL、材料のテーブルを参照) を計画された切開部位に注射する。有効にするには5分かかります。
- メスで頭蓋骨の上の皮膚の中線をまっすぐに切ってください。細かい鉗子で側面に向かってゆっくりと皮膚を引っ張り、さらなる作業のために露出した頭蓋骨を残すためにブルドッグの serrefine クランプで脇にクランプします。
- メスまたは同様のツールで筋膜の頭蓋骨をきれいにします。表面的な出血の場合は、綿棒またはペーパータオルの小片で血液を除去します。
- ポリ (3, 4-ethylenedioxythiophene) ポリスチレンスルホン酸 (PEDOT: PSS) コーティングされたアーススクリュー (サイズ: #00、直径: 0.047 in、長さ: 1/8 in、材料の表を参照)、半田ワイヤーを使用してコネクタをアンプ headstage に接続します。
- 目的の穴の部位で頭蓋骨を湿らせ、小脳の上にある微細な丸いドリルビット (0.4 mm の直径) を使用して、硬膜が見えるまで高速で穴を開けます。地面ねじを穴の中に入れ、精密ドライバーで小脳の頂部に達するまでねじ込みます。
注:ヘッドスクリューは、PEDOT: 1% 3-glycidyloxypropyl を含有する PSS 溶液) trimethoxysilane (GOPS) 140 重量によるディップコーティングされ、90 min. PEDOT: PSS は、生体適合性であることが知られている体積キャパシタンスを持つ共役ポリマーです。GOPS は PEDOT: PSS と混合したクロスリンカーで、水性媒体の安定性を高めます (図 2)。 - Stereotaxic フレームの助けを借りて、目的の脳領域の stereotaxic 座標を測定します。例えば、対象となる領域は、海馬、前後 (AP)-1.8 mm および mediolateral (ML) 1.8 mm、マウス32についての脳アトラスに基づく Bregma 点からのものである。
注:これらは右半球の座標です (図 2)。 - 標的領域上の頭蓋骨の約 1 ~ 2 mm の直径の領域を、信頼性の高い歯科用ドリル (材料の表参照) を使用して、薄い、よく磨かれた透明な骨膜が残るまで高速で設定します。
- その後、骨膜の厚さが十分に薄い (< 200 μ m) 場合は、薄い鉗子で小さな穴を作り、骨33の薄層をそっと取り除いてください。カスタムメイドのフック先端の針を使用して、硬膜を除去します。浮腫の発達を防ぎ、脳の心臓および/または呼吸脈動を最小限に抑えるために、開頭術および durotomy のサイズを最小限に抑えます。
注:開頭術は、乾燥を防ぎ、実験中に定期的に補充するために、生理食塩水の液滴で満たされなければなりません (図 2)。
3. マルチチャンネルシリコンプローブの挿入
- シリコンプローブが他の2つのインプラントの位置決めのために十分なスペースを残し、電極、イオンポンプ、およびマイクロピペットの記録と注入部位をできるだけ近づけるために、わずかに AP 角度 (20 °) で stereotaxic アームを使用します。
注:電極、シリンジ、およびイオンポンプは、DiI 染色液 (1、1 '-ジオクタデシル-3、3、3 '、3 '-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 [DiI]) の滴で覆われ、移植痕跡の事後の可視化のため (0.5 mg/ml DiI ジメチルスルホキシド)。 - 磁気ホルダに取り付けられた stereotaxic アームにシリコンプローブを置き、stereotaxic フレームの隣に置きます。AP の角度 (20 °) を設定し、プローブを headstage とアーススクリューに接続します。
-
水平方向の動きを避けるために、ミクロン精度の stereotaxic アームまたは電動マイクロ・マニュピュレーターの助けを借りて、シリコンプローブを海馬にゆっくりと下げます (図 2および図 3)。
- Headstage、接続されたアンプ、およびコンピュータで録音ソフトウェアと録音を開始する—マルチチャネルシリコンプローブを皮質の上から移動させながら、標的 dorsoventral (DV) 位置に到達するまで (-皮質表面からの1800μ m)。コンピュータ画面での侵入中にローカルフィールド電位信号 (LFP) を記録して監視します。
注:記録しながら、それがゆっくりと連続して移動するようにプローブの降下を制御し、浸透のために、ターゲットゾーンに到達するためのより良い視覚的なコントロールを持っています。 - 記録された LFP の海馬形成のピラミッド層におけるリップル活動をターゲットゾーンのマーカーとして使用します。
注:リップル活性は、記録サイト間の距離が100μ m のマルチチャンネルシリコン (Si) プローブの1つまたは2つの隣接チャンネルで見ることができます (図 4)。 - マルチチャネル Si プローブの助けを借りて、マルチチャンネルアンプのソフトウェア (「材料の表」を参照) を介して、皮質と海馬の層からの LFP 信号を同時に記録します (図 4)。
- Headstage、接続されたアンプ、およびコンピュータで録音ソフトウェアと録音を開始する—マルチチャネルシリコンプローブを皮質の上から移動させながら、標的 dorsoventral (DV) 位置に到達するまで (-皮質表面からの1800μ m)。コンピュータ画面での侵入中にローカルフィールド電位信号 (LFP) を記録して監視します。
4. μFIP の挿入
- ΜFIP の入口にチューブ (材料の表を参照) を接続し、0.05 M の GABA 溶液でプローブを満たします。チューブを取り外し、パラフィンフィルムラッピングでインレットを閉じます。電気リード線をソース測定ユニットに接続します。
- Mediolateral (MP) 角度 (20 °) で stereotaxic アームの助けを借りてμFIP を挿入します。Si プローブは、プロセス全体にわたって挿入されたままになります。
注: μFIP は非常に柔軟で、それが脳の表面に到達するまでまっすぐに保つために小さくてきれいな絵筆のサポートから利益を得ることができます。そのステップの後で、μFIP は軸動きと穏やかに下げることができる。 - 軸方向の動きでゆっくりとμFIP を下げ、dorsoventral (DV) 座標 (皮質表面から-1200 μ m) に達するまで、軌跡の間に曲がりません。
注:ΜFIP 先端からの出口の300μ m の間隔を考慮して2つの装置 (μFIP およびケイ素の調査) をできるだけ近くに置くことを試みなさい。
注意: 挿入時にデバイスとコネクタ間の機械的な問題を避けてください (図 2bおよび図 3b)。
5. 発作誘導用デバイスの調製
- シリンジ (10 μ l) の金属製針を交換する (材料表参照)。針を保持する金属部分を取り除き、マイクロピペットを固定します (外径 [OD]: 1.2 mm、内径 [ID]: 0.75 mm、先端径:20 ~ 50 μ m、± 0.5 cm のシャンク)、ニードル保持要素を交換します。
- 4AP (人工髄液中の 50 mM [ACSF]) の注射のために20° lateromedial (LM) の角度でシリンジと付着したホウケイ酸マイクロピペットを配置します。
注意:50μ m 以上の先端を持つシリンジまたはマイクロピペットの金属製の針は使用しないでください。 - 500 nL-1 μ l の 50 mM 4AP を自動注入ポンプの助けを借りて引きます。
6. 4AP 注射用シリンジに取り付けられたガラスピペットの挿入
- シリンジに取り付けたガラスマイクロピペットを目的の DV 位置 (-1500 μ m) に下ろし、250 nL の4AP を注入します (図 2および図 3)。記録ソフトウェアで記録を開始します。画面を見て、最初の発作スパイクが表示されるのを待ちます。
- 最初の発作スパイクの出現ですぐにμFIP によって GABA の配信を開始します。.ソースとターゲットの間に 1 V を適用することによって GABA を提供 100 s の後に 1 s オフ, 30 サイクル.記録ソフトウェアの助けを借りて、最低2時間を記録します。
注:提供された GABA の総質量は 1 nmol の周り (図 5). - 実験の最後に、挿入されたプローブとアーススクリューを静かに取り出し、stereotaxic 装置から動物を取り出します。動物は、薬物の過剰摂取 (i. p. 100mg/kg ペントバルビタール) を使用して安楽死された。死は、息と循環の停止によって確認されました。
7. インプラントの配置の評価
- 動物を euthanizing した後、perfuse を目、最初に 50 mL の食塩水を加え、次いで 0.1 M リン酸緩衝液 (PB)34中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を含む氷冷定着性溶液の 150 ml を用いた。
注意:PFA は危険であり、注意して取り扱わなければなりません。 - 動物を斬るし、頭蓋骨の上面と側面から皮膚と筋肉を除去する。円孔開マグナムから開始して、耳と矢状正中切開に向かって頭蓋骨に横切開を行い、脳に損傷を与えることのないように細心の注意を取る。頭蓋骨をゆっくりと骨トリマーで取り除いてください。脳を除去し、(Bregma 点から-1 から-3 mm AP) 脳マトリックスの助けを借りて、関心のある領域から組織ブロックを切断します (材料の表を参照してください)。
- ティッシュブロックをビブラトームの試料ホルダーに接着し、その中に台を入れ、40μ m のコロナ部分を作る PB 浴でビブラトームを40μ m の厚さに設定します。
- 0.1 M PB で広範囲に洗浄します。グリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) 染色31の組織学的プロトコルに従う。
- スライド上のセクションをマウントし、2-(4-amidinophenyl)-1H-インドール-6-carboxamidine (DAPI) を含む土台媒体でそれらをカバーします (材料の表を参照してください)。
8. 共焦点顕微鏡
- 共焦点顕微鏡の20倍の目的の下で染色されたコロナセクションとスライドを置きなさい。ターゲット領域を選択します。
- 次のように、染料用の最適な励起および発光 (exc/ems) フィルタセットを選択します: DAPI = 358/461 nm、DiI = 551/569 nm、およびフルオレセイン (材料の表参照) = 490/525 nm。
注:染色はセクションごとに異なるため、最小かつ最大の励起および検出の適切な範囲を各セクションについて決定する必要があり、最も密度の低い領域と最も密集している地域は両方とも放出を示します。 - 最も密度の低い領域を選択し、レーザー強度と検出を高い値に設定し、これらの値が検出された放出の oversaturation を引き起こすかどうかを最も密領域で確認します。その場合は、値を下げて、最も密集していない領域で再確認します。高度に染色された領域で過飽和レベルではなく、低染色レベルで最高の検出に到達するまで、これらのステップを繰り返します。すべての染料に対してこのプロセスを繰り返します。
- 512 x 512 ピクセルの顕微鏡のタイルスキャン機能を使用して、事後処理のための適切な分解能でプローブ挿入部位の大規模な概観を得ることができます。
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Representative Results
麻酔をかけたマウスにおいて4AP てんかんモデルを用いてここに提示された手順を使用して、てんかんの発作の制御を、てんかん焦点において達成することができる。インプラントの正確な局在化 (図 2) は、海馬の局所電界電位 (LFPs,図 4) を記録し、小さな海馬発作を誘発し、発作発症時に GABA を送達するのに役立った。インプラントの局在化を、事後組織学による各実験の後に検証した (図 3)。
SLEs が海馬内にのみ存在した場合、てんかん活性は完全な制御下に置かれた。図 5は、μFIP を組み込んだ新規なニューロンプローブによる GABA の送達によって SLEs が停止しうる場合の代表的な例を示す。4AP がより大きな領域または皮質の上に注入されたとき、てんかん発作は一般化したので、送達 GABA はてんかん発作の程度を変更することができなかった (図 6)。ナトリウムイオンの送達は、4AP 誘発活性に顕著な影響を及ぼしなかった (図 7)。
図 1: μFIP プローブの概要ΜFIP プローブの概略図と実サイズ。(a) 主な特徴を示すμFIP プローブの注入された末端の概略図。(b) 写真を針状にしたμFIP プローブを上向きにしたもの。赤いブロックは流体接続用です。スケールバー = 1 cm. (c) IEM を使用しないμFIP プローブチップの顕微鏡画像。スケールバー = 100 μ mこの図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 頭蓋-マウス脳内のインプラントの durotomy と局在化(A) 手術の概略図、開頭術、およびマウス脳内のインプラントの標的。(B) 3 つの装置の注入のために stereotaxic 座標および角度を使用した。μFIP = 20 ° mediolateral (ML)、-1200 μ m DV (緑)。マルチチャンネルシリコンプローブ = 20 ° AP、-1800 μ m DV (ブルー)シリンジ付きマイクロピペット = 20 ° LM,-1500 μ m DV (赤)開頭術の中心部は 1.8 mm ML で、右半球の 1.8 mm AP です。この図は、プロクター et al.31 (クリエイティブ・コモンズ表示非商用ライセンス 4.0 (CC by NC) に基づいて配布されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 移植配置の組織学的評価パネル (A) は、マウス脳 (緑色) における海馬形成の局在に関する概略的な3d 図を示す。パネル (B、 CおよびD) は注入された装置の跡を示す-μFIP、マイクロピペットが付いているスポイトおよび多重チャンネルのシリコーンの調査 (DiI、赤い、矢)、それぞれ31。パネル (Ba、 Ca、 Da) は、高倍率の画像を表示します。パネル (Bb、 Cb、 Db) は、Paxinos とフランクリンマウス脳アトラスの対応するページを示し、一方 (Bc、 Cc、 Dc) は、右のコロナ部分全体に低倍率の画像を表示します半球。スケールバー = 500 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:皮質と海馬からのマルチチャンネル録音。CA1 (白) と海馬形成 (パープル、= ・コルニュ Ammonis エリア 1; ブルー、DG = 歯状今回の間の距離が100μ m のマルチチャネルシリコンプローブによる LFP 記録。CA1 ストラタム pyramidale のリップルアクティビティに注目してください。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: GABA による4AP 誘導発作の制御.海馬からの代表的な電気生理学録音。(A) 4AP 注射後約30分後に SLEs を用いたμFIP 処理がない状態での記録、ステータス重積が続く。(B) 第 1 SLE の直後にμFIP 処理を開始した場合の記録。この記録は、治療開始後の病理学的事象を示さない。(C) μFIP 治療が4AP 注射の前に開始された記録であり、病理学的事象を示さない。赤い矢印は4AP 注射を示しています。緑色の矢印は、μFIP 処理の開始を示し、緑色の矢印はμFIP 処理の終了を示す。緑色の矢印の後の 100 s の間隔での鋭いピークは、μFIP 治療31からのアーチファクトである。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: GABA による4AP 誘導発作の制御の失敗.4AP がシリンジの金属製の針を注射した場合の海馬からの代表的な電気生理学的記録は、てんかん発作がより大きな脳領域に影響を与えた。なお、GABA 送達は発作強度に影響を与えなかった。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 車両実験GABA の代わりにナトリウムイオン (Na+) の等価線量を送達する対照実験は、4AP 誘発活性に顕著な影響を与えなかったが、電気生理学的に調節するイオンポンプからの適用電流ではないことを実証した活性が、むしろ送達された分子である。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
てんかんの急性マウスモデルに新しい実験的プロトコルを開発することによって、SLEs は、てんかん焦点に移植されたμFIP の助けを借りて首尾よく制御することができた。時間的および空間的精度で GABA を送達する能力のおかげで、4AP 誘導 SLEs は、発作の発症時に制御された。てんかんの治療は、発作開始の場所でニューラルネットワークの放電の制御が達成された場合に理論的に可能である。提示されたプロトコルは、注入された抑制性神経伝達物質の局在化が、GABA、時間におけるてんかん焦点に到達するのに十分正確であるならば、これを可能に証明した。しかし、てんかん発作が脳のより大きな領域に影響を及ぼす場合、GABA 送達を正確に局在させることによる発作制御は不可能である。ΜFIP プローブの影響範囲は、出口から半径約550μ m と推定された。4AP インジェクションがこのエリア31に局在している場合にのみ、SLEs が影響を受ける可能性があることが証明されました。
したがって、この方法は、てんかん発作が局在する場合に有用であるが、発作が multifoci または一般化したときにてんかんを制御または停止することはできなかった。また、この方法は、げっ歯類の麻酔で証明されている。自由に移動する動物では、このプロトコルの効率を調査するために、慢性的な応用が依然として必要である。
てんかんはいくつかの形態を有し、異なる基礎メカニズムによって引き起こされるが、患者の約 60% が単一のてんかん焦点35を有することが証明されている。したがって、内因性抑制性神経伝達物質の局所投与の利点は、さらなる実験動物研究のための有用なツールを提供し、焦点てんかんの治療における新たな戦略を提示する。記述された方法は、急性マウス研究でμFIP 治療の有用性を証明し、その慢性的な適用を確保するために、さらなる技術開発のための道を開きました.我々は、正確に標的化された電気泳動薬物送達装置は、てんかんだけでなく他の神経変性疾患の治療にも適応できると考えている。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
C.M.P. は、国際教育研究所によって管理されているウィテカー国際学者助成金からの資金を認めています。A.K. は、マリー・キュリー IEF (625372) によって後援されました。A.W. 欧州研究評議会 (ERC) の資金は、欧州連合 (eu) のホライゾン2020研究・イノベーションプログラム (助成契約第716867号) の下で認めています。A.W. はさらに、エクス・マルセイユ大学-A * MIDEX、フランスの「Investissements d'Avenir」プログラムのエクセレンス・イニシアティブを認めています。著者らは、Uguz Ilke 博士、Sahika Inal 博士、ヴィンチェンツォ Curto 博士、メアリー・ドナヒュー博士、マルク・フェロー、Zsófia Maglóczky が実りある議論に参加したことを認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
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