Summary
De uitdaging van epilepsie onderzoek is het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor patiënten waar klassieke therapie ontoereikend is. Met behulp van een nieuw protocol-met de hulp van een implanteerbare Drug Delivery System-zijn we in staat om aanvallen in verdoofd muizen controle door de elektroforetische levering van GABA in de epileptische focus.
Abstract
Epilepsie is een groep van neurologische aandoeningen die miljoenen mensenwereld wijd treft. Hoewel de behandeling met medicatie is nuttig in 70% van de gevallen, ernstige bijwerkingen van invloed op de kwaliteit van leven van patiënten. Bovendien is een hoog percentage epileptische patiënten resistent tegen drugs; in hun geval, Neurochirurgie of neurostimulatie zijn noodzakelijk. Daarom is het belangrijkste doel van epilepsie onderzoek is het ontdekken van nieuwe therapieën die ofwel kunnen genezen epilepsie zonder bijwerkingen of het voorkomen van terugkerende aanvallen in resistente patiënten. Neuroengineering biedt nieuwe benaderingen met behulp van innovatieve strategieën en technologieën om betere oplossingen te vinden om epileptische patiënten in gevaar te genezen.
Als een demonstratie van een nieuw experimenteel protocol in een acuut muismodel van epilepsie, wordt een direct in situ elektroforetische drug delivery systeem gebruikt. Namelijk, een neurale sonde waarin een microfluidische ion pomp (µ FIP) voor on-demand drugs levering en gelijktijdige opname van lokale neurale activiteit wordt geïmplanteerd en aangetoond te kunnen controleren 4-aminopyridine-geïnduceerde (4AP-geïnduceerde) inbeslagneming-achtige evenement (SLE) activiteit. De γ-aminoboterzuur zuur (GABA) concentratie wordt bewaard in de fysiologische bereik door de precieze controle van GABA levering aan een epilepticum effect in de inbeslagneming focus te bereiken, maar niet te veroorzaken overremming-geïnduceerde rebound uitbarstingen. De methode maakt zowel de opsporing van pathologische activiteit en interventie om epileptische aanvallen te stoppen door het leveren van remmende neurotransmitters rechtstreeks aan de epileptische focus met precieze spatiotemporal controle.
Als resultaat van de ontwikkelingen aan de experimentele methode, kan SLEs in een hoogst gelokaliseerde manier worden veroorzaakt die beslaglegging controle door de precies gestemde GABA levering bij het beslag leggings begin toestaat.
Introduction
Epilepsie is de vierde meest voorkomende neurologische aandoening: ongeveer 1% van de bevolking lijdt aan epilepsie, en ongeveer een derde van de getroffen hebben terugkerende aanvallen. In de meeste gevallen, epileptische aanvallen kunnen worden gecontroleerd met medicatie. Nochtans, moet de drugbehandeling voor elke patiënt individueel worden geplaatst, waar de juiste dosering jaren kan vergen om1,2te vinden. Bovendien, de meeste van de medicatie heeft ernstige bijwerkingen die de kwaliteit van leven te verminderen3,4,5,6,7. Ten slotte, in 30% van de gevallen patiënten resistent zijn tegen medicatie, en in het geval van een constante enkele inbeslagneming Generator Locus, alleen resektieve Neurochirurgie kan het optreden van aanvallen te dempen8. Daarom is een belangrijk initiatief in de moderne epilepsie onderzoek is het ontdekken van nieuwe strategieën die kunnen voorkomen dat terugkerende aanvallen bij patiënten in gevaar, terwijl het verminderen van de noodzaak van sterke drugs therapieën en invasieve resektieve operaties.
Epileptische aanvallen optreden wanneer er sprake is van een onbalans binnen prikkelende en remmende circuits, hetzij in de hersenen (gegeneraliseerde epilepsie) of in een gelokaliseerde deel van de hersenen (focale epilepsie), zodanig dat neuronen kwijting in een abnormale mode9 , 10 , 11. epilepticum drugs kunnen handelen op twee verschillende manieren in inbeslagneming preventie: ofwel afnemende excitatie of verbetering van remming12. Specifiek, kunnen zij of de elektroactiviteit van neuronale cellen wijzigen door ionenkanalen in celmembraan13 te beïnvloeden of op chemische transmissie tussen neuronen te handelen door de remmende neurotransmitter Gaba of de prikkelende te beïnvloeden glutamaat in de synapsen14,15. Voor sommige medicijnen, de wijze van actie is onbekend18. Ook drugsbehandelingen hebben een continu effect op patiënten en kunnen zich niet aanpassen aan de prevalentie dynamiek van epileptische aanvallen. Idealiter, drugs met specifieke mechanismen van de actie zou handelen op de onderliggende epileptische processen. Een optimale behandeling zou niet raken de hersenen interictally, maar zou onmiddellijk handelen wanneer een aanval begint te ontwikkelen. In tegenstelling tot dat, in alle gevallen van epilepsie, medicatie betekent nu een systematische behandeling, die de hele hersenen en het hele lichaam van de patiënt9.
Epileptische aanvallen kunnen verschijnen vele jaren na de eerste belediging, zoals hersentrauma. De periode tussen de aanvankelijke belediging en het voorkomen van de eerste spontane aanvallen wordt gekenmerkt door aanzienlijke moleculaire en cellulaire reorganisaties, met inbegrip van neuronale dood met de verdwijning van neuronale netwerkverbindingen en axonale kiemen/neosynaptogenesis met de verschijning van nieuwe verbindingen19,20,21. Zodra epileptische aanvallen worden terugkerende, hun frequentie en ernst de neiging om te verhogen, waarbij meer hersengebieden. Het is belangrijk om te onderscheiden van de sites van inbeslagneming begin (epileptogenic regio's) van propagatie netwerken, zoals de regels van inbeslagneming Genesis en voortplanting kan verschillen. Onderzoek uitgevoerd op menselijk weefsel en experimentele modellen van epilepsie hebben belangrijke gegevens over de reorganisatie van circuits en hun vermogen om epileptische aanvallen te genereren20,21,22, 23. het is echter moeilijk om te bepalen of deze reorganisaties zijn adaptieve reacties of dat ze causaal verband houden met epileptogenese of inbeslagneming Genesis en voortplanting12.
Daarom is het lokaliseren van de epileptische focus en het toepassen van epilepticum drugs lokaal een van de belangrijkste uitdagingen in het hedendaagse epilepsie onderzoek. Verschillende experimenten met behulp van dierlijke modellen van epilepsie en een aantal klinische studies gericht op het begin van de inbeslagneming gebeurtenissen te vinden en de onderliggende mechanismen in de hersenen24,25,26,27te definiëren. Hiertoe ontwikkelden we een nieuw experimenteel protocol met behulp van de 4AP epilepsie model28,29,30,31 in een acute muis voorbereiding, die het mogelijk maakt de precieze invoeging van drie apparaten in het gegeven gebied van de hippocampus, waar de netwerkactiviteit in vivo op een hoogst gelokaliseerde manier wordt gemanipuleerd. Gelokaliseerde 4AP injectie door een glazen micropipet helpt bij het induceren van epileptische SLEs in een gelokaliseerde plek in de hippocampus, terwijl met behulp van de nieuwe polymeer-gebaseerde µ FIP sonde de controle van de inbeslagneming activiteit wordt bereikt gelijktijdig door het opnemen van de neuronale elektrische activiteit met de opnamelocaties van het apparaat. Hippocampale lokale veld activiteit wordt ook gecontroleerd met een multichannel silicium sonde in een laag-specifieke wijze in de cortex en in de Hippocampus gelijktijdig.
De onlangs uitgevonden µ FIP sondes werken met behulp van een toegepast elektrisch veld te duwen geladen drugs opgeslagen in een microvloeiende kanaal over een ion-uitwisseling membraan (Internet Explorer-onderhoud) en naar het omliggende weefsel (Figuur 1). Het Internet Explorer-onderhoud vervoert selectief slechts één type van ionen (kation of anion) en, dus, werkt om beide passieve verspreiding in de "van" staat en vervoer van tegengestelde geladen soorten van het omringende weefsel in het apparaat te beperken. Het elektrisch veld wordt op aanvraag gemaakt door een kleine spanning (< 1 V) toe te passen tussen de bron elektrode die inwendig is voor het microfluidische kanaal en een doel elektrode die buiten het apparaat ligt (in dit geval de hoofd schroef op het diermodel). Het tarief van de toediening van geneesmiddelen is evenredig aan de toegepaste spanning en de gemeten stroom tussen de bron-en doel elektrodes. De precieze tunability van de druglevering is een van de belangrijkste voordelen van de µ FIP. Een ander kritisch voordeel, in vergelijking met vloeibare of op druk gebaseerde systemen voor de levering van medicijnen, is dat in de µ FIP is er slechts een verwaarloosbare druk te verhogen bij de drug delivery Outlet als drugs worden geleverd over de Internet Explorer-onderhoud zonder hun carrier-oplossing.
Er is een kleine hoeveelheid van passieve lekken van GABA wanneer de µ FIP is "off", maar dit bleek niet te SLEs effect. De µ FIP zijn op maat gemaakt naar aanleiding van conventionele microfabricage methoden die we eerder hebben gerapporteerd31.
Aangezien een manier van het voorkomen van terugkerende aanvallen is de blokkade van het netwerk lozingen aan het begin of zelfs voor de eerste aanval evenement, de gepresenteerde methode voor het leveren van de remmende neurotransmitter GABA in de epileptische focus heeft grote therapeutisch potentieel voor inbeslagneming controle bij patiënten met focale epilepsie. Aangezien GABA is een endogene substraat, het laat intrinsieke neuronale eigenschappen ongewijzigd in fysiologische concentraties. De lokale toepassing van lage niveaus van GABA zal alleen van invloed op cellen die van nature reageren op remming, en zal alleen leiden tot soortgelijke effecten op fysiologische remming, in tegenstelling tot diepe hersenstimulatie (DBS), die onspecifieke acties heeft door het stimuleren van alle cellen van het neuronale netwerk in zijn omgeving, waardoor een gemengde reactie waarbij zowel excitatie en remming. Tot slot, de voorgestelde methode biedt een meer specifieke benadering van inbeslagneming controle dan DBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van het Institut de neurosciences des systèmes en goedgekeurd door de lokale ethische comités en veterinaire kantoren.
Opmerking: Zeventien volwassen mannelijke OF1 muizen werden gebruikt voor de experimenten. Muizen werden meegevoerd naar een 12 h licht/donker cyclus met voedsel en water beschikbaar ad libitum.
1. anesthesie
- Injecteer ze intraperitoneaal een mengsel van ketamine en xylazine (100 mg/kg lichaamsgewicht en 10 mg/kg lichaamsgewicht, respectievelijk) aan verdoven het dier.
-
Controleer het niveau van de anesthesie door het observeren van de ademhalingsfrequentie en het kloppen en door het controleren van de muis reactie op pijn.
Opmerking: wanneer de ademhaling van de muis regelmatig wordt, geen zwaaien kan worden waargenomen, en het dier niet reageert op staart knijpt, de anesthesie is diep genoeg om verder te gaan.- Plaats het dier op een elektrisch programmeerbare verwarmingskussen. Bedek de rectale temperatuursonde met een vaseline-gebaseerde product (Zie tabel van materialen) en plaats het zachtjes in de endeldarm (1-2 cm diep) van de muis om de lichaamstemperatuur te controleren. Handhaven van een lichaamstemperatuur tussen 36,5 en 37,5 °C tijdens de chirurgische ingrepen en experimentele opnames.
- Monitor de anesthesie niveau door het controleren van de muis reflexen, zwaaibewegingen, en de frequentie van de ademhaling. Rekening houdend met het niveau van de anesthesie geregistreerd ten minste om de 30 min, geven een kleine dosis van een ketamine-xylazine cocktail (20-50 µ L, dezelfde concentratie gebruikt als voorheen) intramusculair.
2. chirurgie/Craniotomie
- Bevestig het hoofd van de muis in een stereotaxische frame. Met behulp van een 30 G naald, injecteren lokale pijnstillende ropivacaine (5 µ L, 7,5 mg/mL, Zie tabel van materialen) onderhuids op de geplande incisieplaats. Laat 5 min voor het van kracht worden.
- Maak een rechte snede middellijn in de huid boven de schedel met een scalpel. Trek voorzichtig de huid naar de zijkanten met fijne Tang en klem het opzij met Bulldog serrefine klemmen om de schedel blootgesteld voor verder werk te verlaten.
- Reinig de schedel van de fascia met een scalpel of een soortgelijk instrument. In het geval van oppervlakkige bloeden, verwijder het bloed met wattenstaafjes of kleine stukjes papieren handdoek.
- Neem een poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) polystyreen sulfonaat (PEDOT: PSS)-met een laag bedekte gemalen schroef (grootte: #00, diameter: 0,047 binnen, lengte: 1/8 in, Zie lijst van materialen) met een gesoldeerde draad en sluit het aan een schakelaar aan de versterker headstage.
- Bevochtig de schedel op de gewenste plaats van het gat en boor een gat op hoge snelheid met behulp van een fijne, ronde boor (met een diameter van 0,4 mm) op de schedel boven de kleine hersenen tot de Dura zichtbaar is. Zet de grond schroef in het gat en schroef het in met een precisie schroevendraaier tot het de top van de kleine hersenen bereikt.
Opmerking: De hoofd schroef was onderdompeling met een PEDOT: PSS-oplossing met 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOP'S), gevolgd door het bakken bij 140 °C voor 90 min. PEDOT: PSS is een geconjugeerd polymeer met een volumetrische capaciteit waarvan bekend is dat ze biocompatibel zijn. GOP'S is een cross-linker gemengd met PEDOT: PSS om de stabiliteit in waterige media te verhogen (Figuur 2). - Meet met behulp van het stereotaxische frame de stereotaxische coördinaten voor het gewenste hersengebied. Bijvoorbeeld, de regio van belang is de hippocampus, achterwaartse (AP)-1,8 mm en mediolateral (ML) 1,8 mm van de Bregma punt op basis van de hersenen Atlas voor muizen32.
Opmerking: Dit zijn coördinaten voor de rechter halfrond (Figuur 2). - Dun een ongeveer 1 tot 2 mm diameter gebied van de schedel boven de doelregio met behulp van een betrouwbare tandheelkundige boor (Zie tabel van materialen) ingesteld op een hoge snelheid tot een dun, goed gepolijst, transparant bot membraan blijft.
- Dan, als de dikte van het bot membraan is dun genoeg (< 200 µm), maak een klein gaatje met dunne Tang en voorzichtig verwijderen van de dunne laag van het bot33. Gebruik Custom-Made Hook-getipt naald om de Dura te verwijderen. Minimaliseer de grootte van craniotomie en durotomy om de ontwikkeling van oedeem te voorkomen en om hart-en/of Ademhalings pulsen van de hersenen te minimaliseren.
Opmerking: De craniotomie moet worden gevuld met een druppel zoutoplossing om te voorkomen dat het drogen en vervolgens regelmatig bijgevuld tijdens het experiment (Figuur 2).
3. inbrengen van de Multikanaal silicium sonde
- Gebruik stereotaxische armen in een lichte AP hoek (20 °) voor de silicium sonde om voldoende ruimte te laten voor de positionering van de andere twee implantaten en om de opname en de injectieplaatsen van de elektrode, ion pomp, en micropipet zo dicht mogelijk.
Opmerking: De elektroden, de spuiten, en de ionen pompen werden behandeld met een daling van DiI vlek oplossing (1, 1 '-Dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perchloraat [DiI]), voor de post-hoc visualisatie van de implantatie sporen (0,5 mg/ml DiI in dimethyl sulfoxide). - Plaats de silicium sonde op de stereotaxische arm bevestigd aan een Magneethouder en plaats deze naast het stereotaxische frame. Stel de AP hoek (20 °) in en sluit de sonde aan op de headstage en op de grond schroef.
-
Langzaam lager de silicium sonde in de Hippocampus met de hulp van de micron-nauwkeurige stereotaxische arm of een gemotoriseerde micromanipulator om zijwaartse bewegingen te voorkomen (Figuur 2 en Figuur 3).
- Initiëren van de opname-software en opnemen-met de headstage, de aangesloten versterker, en een computer-elektrische neuronale signalen tijdens het verplaatsen van de multichannel silicium sonde vanaf de top van de cortex totdat de gerichte dorsoventral (DV) positie is bereikt (- 1.800 µm van de corticale oppervlakte). Opnemen en kijken naar de lokale veld potentiaal signaal (LFP) tijdens penetratie op het computerscherm.
Opmerking: Controle van de afdaling van de sonde, zodat het beweegt langzaam en continu tijdens het opnemen, om een betere visuele controle voor de penetratie en voor het bereiken van de doelzone. - Gebruik de rimpel activiteit in de piramidevormige laag van de hippocampale formatie in de opgenomen LFP als een marker van de doelzone.
Opmerking: Rimpel activiteit is zichtbaar op een of twee naburige kanalen van de multichannel silicium (SI) sonde met een 100 µm afstand tussen de opname-sites (Figuur 4). - Record LFP signalen van de lagen van de cortex en de Hippocampus gelijktijdig via de multichannel versterker software (Zie tabel van materialen) met de hulp van de multichannel si probes (Figuur 4).
- Initiëren van de opname-software en opnemen-met de headstage, de aangesloten versterker, en een computer-elektrische neuronale signalen tijdens het verplaatsen van de multichannel silicium sonde vanaf de top van de cortex totdat de gerichte dorsoventral (DV) positie is bereikt (- 1.800 µm van de corticale oppervlakte). Opnemen en kijken naar de lokale veld potentiaal signaal (LFP) tijdens penetratie op het computerscherm.
4. invoeging van µ FIP
- Sluit de tubes (Zie de materiaallijst) aan op de inlaat van de µ FIP en vul de sonde met 0,05 M Gaba oplossing. Verwijder de buizen en sluit de inlaat met paraffine folieverpakking. Sluit de elektrische verbinding tot de bron meeteenheid.
- Plaats de µ FIP met behulp van de stereotaxische arm bij een mediolateral (MP) hoek (20 °). De si-sonde blijft tijdens het hele proces ingevoegd.
Opmerking: µ FIP is zeer flexibel en kan profiteren van de steun van een kleine en schone kwast om het recht te houden totdat het de hersen oppervlak bereikt. Na die stap kan µ FIP voorzichtig verlaagd worden met axiale bewegingen. - Verlaag de µ FIP langzaam met axiale bewegingen en laat het nooit buigen tijdens het traject totdat het de dorsoventral (DV) coördinaat bereikt (-1.200 µm van de corticale oppervlakte).
Opmerking: Probeer de twee apparaten (µ FIP en silicium sonde) zo dicht mogelijk bij elkaar te zetten, gezien de 300 μm afstand van de uitlaat van de µ FIP tip.
Let op: Vermijd mechanische problemen tussen de apparaten en hun aansluitingen tijdens het inbrengen (Figuur 2b en Figuur 3b).
5. bereiding van hulpmiddelen voor inbeslagneming inductie
- Wijzig de metalen naald van de spuit (10 µ L) (Zie de lijst van materialen). Verwijder de naald-Holding metalen deel, plaats en bevestig de micropipet (buitendiameter [OD]: 1,2 mm, binnendiameter [ID]: 0,75 mm, tip diameter: 20 – 50 µm met ± 0,5 cm van taps toelopend van de schacht), en vervang vervolgens de naald-Holding element.
- Plaats de spuit en de bijgevoegde borosilicaatglas-micropipet bij een lateromedial (LM) hoek van 20 ° voor de injectie van 4AP (50 mM in kunstmatige hersenvloeistof [ACSF]).
Let op: Gebruik de metalen naald van de spuit of een micropipet niet met een tip groter dan 50 µm. - Teken 500 nL – 1 µ L van 50 mM 4AP met behulp van een geautomatiseerde Microinjection pomp.
6. het inbrengen van de glazen pipet die aan een injectiespuit is bevestigd voor 4AP injectie
- Verlaag de glazen micropipet die aan de spuit is bevestigd aan de gestreefde DV-positie (-1.500 µm) en Injecteer vervolgens 250 nL van de 4AP-oplossing (Figuur 2 en Figuur 3). Start de opname met de opname software. Bekijk het scherm en wacht tot de eerste interictal Spike te verschijnen.
- Start de GABA levering door µ FIP onmiddellijk met de verschijning van de eerste interictal Spike. Leveren GABA door het toepassen van 1 V tussen bron en doel voor 100 s, gevolgd door 1 s uit, voor 30 cycli. Met behulp van de opname software, record voor een minimum van 2 uur.
Opmerking: De totale massa van de geleverde GABA is ongeveer 1 nmol (Figuur 5). - Aan het einde van het experiment, verwijder voorzichtig de ingevoegde sondes en de gemalen schroef, en verwijder het dier uit de stereotaxische apparatuur. De dieren werden euthanized gebruikend een overdosis van drug (i. p. 100mg/kg pentobarbital). De dood werd bevestigd door onderbreking van adem en omloop.
7. evaluatie van de plaatsing van de implantaten
- Na euthanizing het dier, perfuse het transcardially, eerst met 50 mL zout en vervolgens met 150 mL van een ijskoude fixatieve oplossing met 4% Paraformaldehyde (middel) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB)34.
Let op: Het is gevaarlijk en moet met zorg behandeld worden. - Onthoofd het dier, en verwijder vervolgens de huid en de spieren van de bovenkant en de zijkanten van de schedel. Vanaf het foramen magnum, maken laterale incisies in de schedel in de richting van de oren en een sagittale middellijn incisie, waarbij grote zorg niet om de hersenenschade. Verwijder voorzichtig de schedel met een been trimmer. Verwijder de hersenen, en snijd een weefsel blok uit de regio van belang (van de Bregma punt,-1 tot-3 mm AP) met de hulp van een hersen matrix (Zie tabel van materialen).
- Lijm het weefsel blok aan het specimen houder van een vibratome, zet de stand in, en zet de vibratome tot 40 µm dikte in een PB bad te maken 40 µm coronale secties.
- Was uitgebreid met 0,1 M PB. Volg de histologische protocol voor glial vezelachtig zure eiwitten (GFAP) kleuring31.
- Mount secties op dia's en bedek ze met een montage medium met 2-(4-amidinophenyl)-1U-indool-6-carboxamidine (DAPI) (Zie de lijst van materialen).
8. confocale microscopie
- Plaats de dia's met de gekleurde coronale secties onder een 20x doelstelling van een confocale Microscoop. Selecteer het doelgebied.
- Kies de optimale excitatie en emissie (exc/EMS) filter sets voor de kleurstoffen als volgt: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm, en fluoresceïne (Zie tabel van materialen) = 490/525 nm.
Opmerking: Aangezien de kleuring varieert per sectie, een goede reeks van minimale en maximale excitatie en detectie moet worden vastgesteld voor elke sectie, waar de minst dichte en meest dichte regio's beide show emissie. - Kies de minst dichte regio en stel de laser intensiteit en detectie in op hoge waarden en controleer vervolgens in de dichtste regio's of deze waarden oververzadiging van gedetecteerde emissies veroorzaken. Als dat zo is, lager de waarden en controleer ze met de minst dichte regio. Herhaal deze stappen tot het aankomen bij de hoogst mogelijke opsporing bij lage het bevlekken niveaus en juiste, niet oververzadigde niveaus bij hoogst bevlekt gebieden. Herhaal dit proces voor alle kleurstoffen.
- Gebruik de tegel scanfunctie van de microscoop met 512 x 512 pixels per tegel om een groot overzicht van de sonde insertie sites met een adequate resolutie voor post-hoc verwerking te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedure hier gepresenteerd met een 4AP epilepsie model in verdoofd muizen, de controle van epileptische aanvallen kan worden bereikt in de epileptische focus. De precieze lokalisatie van de implantaten (Figuur 2) hielp om hippocampale lokale veld potentialen (LFPs, Figuur 4) op te nemen, om kleine hippocampale aanvallen te veroorzaken en om Gaba bij het begin van de inbeslagneming te leveren. De localisatie van de implantaten werd na elk experiment geverifieerd door de post hoc histologie (Figuur 3).
In het geval toen SLEs slechts in het zeepaardje aanwezig waren, werd de epileptische activiteit gezet onder volledige controle. Figuur 5 toont een representatief voorbeeld van wanneer SLEs zou kunnen worden gestopt met de levering van Gaba door de nieuwe neuronale sonde waarin een µ FIP. Toen 4AP werd geïnjecteerd in een groter gebied of op de top van de cortex, epileptische aanvallen werd veralgemeend, zodat de geleverde GABA niet in staat was om de omvang van de epileptische aanvallen te wijzigen (Figuur 6). De levering van natriumionen had geen noemenswaardig effect op de 4AP activiteit (Figuur 7).
Figuur 1: overzicht van de µ FIP sonde. Schematische weergave en werkelijke grootte van de µ FIP sonde. aschematische weergave van het geïmplanteerde uiteinde van een µ FIP sonde met primaire kenmerken. (b) foto van een µ FIP sonde met een naald-achtige geïmplanteerde uiteinde omhoog. Het rode blok is voor vloeibare verbindingen. Schaalbalk = 1 cm. (c) Microscoop beeld van een µ FIP sonde Tip zonder het Internet Explorer-onderhoud. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Cranio-durotomy en lokalisatie van de implantaten in de muis hersenen. (A) Schematische weergave van de operatie, de craniotomie, en het doelwit van de implantaten in de muis hersenen. (B) gebruikte stereotaxische coördinaten en hoeken voor de implantatie van de drie apparaten. µ FIP = 20 ° mediolateral (ML),-1.200 µm DV (groen). Multichannel Silicon probe = 20 ° AP,-1.800 µm DV (blauw). Micropipet met spuit = 20 ° LM,-1.500 µm DV (rood). Het centrum van craniotomie is 1,8 mm ML,-1,8 mm AP voor de juiste hemisfeer. Dit cijfer is gewijzigd van Proctor et al.31 (auteursrecht verdeeld onder de Creative Commons Naamsvermelding niet-commerciële licentie 4,0 (CC by-nc). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: histologische evaluatie van de plaatsing van de implantatie. Panel (a) toont een schematische 3D-figuur op de lokalisatie van de hippocampale vorming in de muis hersenen (groen). Panelen (B, C en D) tonen de sporen van de geïmplanteerde apparaten — µ FIP, micropipet met spuit en multichannel silicium sonde (DiI, rood, pijlen), respectievelijk31. Panelen (BA, CA, da) tonen een hoge vergroting beeld; panelen (BB, CB, db) tonen de overeenkomstige pagina van de Paxinos en Franklin Mouse Brain Atlas, terwijl (BC, CC, DC) tonen een lage vergroting beeld op de hele coronale gedeelte van de rechter Halfrond. Schaalbalk = 500 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Multichannel opname van de cortex en de hippocampus. LFP opname met een multichannel silicium sonde met een 100 µm afstand tussen de opname-sites, uit de lagen van de cortex (wit) en de hippocampale formatie (paars, CA1 = Cornu Ammonis gebied 1; blauw, DG = dentate gyrus. Let op de rimpel activiteit van de CA1 stratum pyramidale. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: controle van een 4AP-geïnduceerde inbeslagneming door Gaba. Representatieve elektrofysiologisch opnames van de hippocampus. (A) opname bij afwezigheid van µ FIP behandeling met SLEs vanaf ongeveer 30 minuten na een 4AP injectie, gevolgd door Status epilepticus. Bhet registreren van een geval waarin de behandeling van µ FIP onmiddellijk na de eerste SLE werd geïnitieerd. De opname toont geen verdere pathologische gebeurtenissen na de behandeling begint. (C) opname waarbij de behandeling van µ FIP is gestart vóór een 4AP injectie, waarbij geen pathologische gebeurtenissen zijn opgenomen. De rode pijlen geven een 4AP injectie. Effen groene pijlen geven de start van de µ FIP-behandeling aan, en open groene pijlen markeren het einde van de µ FIP behandeling. Scherpe pieken op 100 s tussenpozen na een groene pijl zijn artefacten van de µ FIP behandeling31. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: falen van de controle van een 4AP-geïnduceerde inbeslagneming door Gaba. Representatieve elektrofysiologische opname van de Hippocampus in een geval waar 4AP werd geïnjecteerd met de metalen naald van de spuit, dus epileptische aanvallen getroffen een groter hersengebied. Merk op dat GABA levering heeft geen invloed op de inbeslagneming intensiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: voertuig experiment. Controle experimenten het leveren van een equivalente dosis van natrium-ion (na+) in de plaats van Gaba had geen opmerkelijk effect op de 4AP-geïnduceerde activiteit, waaruit blijkt dat het niet de toegepaste stroom van de ion pomp die moduleert elektrofysiologische activiteit, maar eerder de geleverde moleculen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door het ontwikkelen van een nieuw experimenteel protocol in een acuut muizenmodel van epilepsie, zou SLEs met succes kunnen worden gecontroleerd met behulp van een µ FIP geïmplanteerd in de epileptische focus. Dankzij zijn vermogen om GABA te leveren met temporele en ruimtelijke precisie, 4AP-geïnduceerde SLEs werden gecontroleerd bij het begin van de aanvallen. Behandeling van epilepsie is theoretisch mogelijk als de controle van het neurale netwerk lozingen wordt bereikt op de plaats van de inbeslagneming te starten. Het gepresenteerde protocol bleek dit mogelijk als de lokalisatie van de geïnjecteerde remmende neurotransmitter, GABA, is nauwkeurig genoeg om de epileptische focus te bereiken in de tijd. Echter, in die gevallen waarin epileptische aanvallen invloed hebben op grotere gebieden van de hersenen, inbeslagneming controle door precies gelokaliseerde GABA levering is niet mogelijk. Het gebied van invloed van de sonde van µ FIP werd geschat met een straal van ongeveer 550 μm van de afzet. Men bewees dat SLEs slechts kon worden beïnvloed als de 4AP injectie aan dit gebied31werd gelokaliseerd.
Daarom is de methode nuttig wanneer epileptische aanvallen zijn gelokaliseerd, maar het was niet mogelijk om te controleren of te stoppen met epilepsie toen de aanvallen werden multifoci of veralgemeend. Ook is de methode bewezen in verdoofd knaagdieren; bij vrij bewegende dieren zijn er nog steeds chronische toepassingen nodig om de efficiëntie van dit protocol te onderzoeken.
Terwijl epilepsie heeft verschillende vormen en wordt veroorzaakt door verschillende onderliggende mechanismen, is het bewezen dat ongeveer 60% van de patiënten een enkele epileptische focal point35hebben. Daarom is het voordeel van de lokale toediening van een endogene remmende neurotransmitter biedt een nuttig instrument voor verdere experimentele dierstudies en presenteert een nieuwe strategie in de behandeling van focale epilepsie. De beschreven methode bleek het nut van µ FIP behandeling in een acute muis studie en opende de weg voor verdere technologische ontwikkelingen om de chronische toepassing te waarborgen. Wij zijn van mening dat juist gerichte elektroforetische middelen voor de levering van medicijnen verder kunnen worden aangepast om niet alleen epilepsie, maar ook andere neurodegeneratieve ziekten te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
C.M.P. erkent de financiering van een Whitaker International Scholar Grant beheerd door het Instituut voor internationaal onderwijs. AIT werd gesponsord door de Marie Curie IEF (nr. 625372). AW erkent de financiering van de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoek-en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 716867). AW erkent bovendien het Excellence Initiative van Aix-Marseille University-A * MIDEX, een Frans "Investissements d'Avenir" programma. De auteurs erkennen Dr. Ilke Uguz, Dr. smetsers Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, en Zsófia Maglóczky voor hun participatie in vruchtbare besprekingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
