Summary
Le défi de la recherche sur l’épilepsie est de développer de nouveaux traitements pour les patients où la thérapie classique est insuffisante. En utilisant un nouveau protocole — avec l’aide d’un système implantables de délivrance de médicaments — nous sommes en mesure de contrôler les saisies chez les souris anesthésiées par l’administration électrophorétique du GABA dans la mise au point épileptique.
Abstract
L’épilepsie est un groupe de troubles neurologiques qui touchent des millions de personnes dans le monde. Bien que le traitement avec des médicaments est utile dans 70% des cas, les effets secondaires graves affectent la qualité de vie des patients. En outre, un pourcentage élevé de patients épileptiques sont résistants aux médicaments; dans leur cas, la neurochirurgie ou la neurostimulation sont nécessaires. Par conséquent, l’objectif principal de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir de nouvelles thérapies qui sont soit capables de guérir l’épilepsie sans effets secondaires ou prévenir les crises récurrentes chez les patients pharmacorésistants. La neuroingénierie offre de nouvelles approches en utilisant des stratégies et des technologies novatrices pour trouver de meilleures solutions pour guérir les patients épileptiques à risque.
En guise de démonstration d’un nouveau protocole expérimental dans un modèle aigu de souris d’épilepsie, on utilise un système d’administration électrophorétique direct in situ. À savoir, une sonde neuronale incorporant une pompe ionique microfluidique (μFIP) pour la délivrance de médicaments à la demande et l’enregistrement simultané de l’activité neuronale locale est implantée et démontrée pour être capable de contrôler la capture induite par la 4-aminopyridine (induite par 4AP) activité de l’événement (SLE). La concentration d’acide γ-aminobutyrique (GABA) est maintenue dans la gamme physiologique par le contrôle précis de la livraison de GABA pour atteindre un effet antiépileptique dans la mise au point de saisie, mais pas pour provoquer des rafales de rebond induite par la surinhibition. La méthode permet à la fois la détection de l’activité pathologique et l’intervention pour arrêter les crises en livrant des neurotransmetteurs inhibiteurs directement à la focalisation épileptique avec un contrôle spatio-temporel précis.
À la suite de l’évolution de la méthode expérimentale, SLEs peut être induit d’une manière hautement localisée qui permet le contrôle des crises par la livraison de GABA précisément accordé au début de la crise.
Introduction
L’épilepsie est le quatrième trouble neurologique le plus fréquent: environ 1% de la population souffre d’épilepsie, et environ un tiers des personnes touchées ont des crises récurrentes. Dans la plupart des cas, les crises peuvent être contrôlées par des médicaments. Cependant, le traitement médicamenteux doit être fixé pour chaque patient individuellement, où le dosage approprié peut prendre des années pour trouver1,2. En outre, la plupart des médicaments a des effets secondaires graves qui réduisent la qualité de vie3,4,5,6,7. Enfin, dans 30% des cas, les patients sont résistants aux médicaments, et dans le cas d’un locus de générateur de convulsions unique constant, seule la neurochirurgie régénératrice peut atténuer l’occurrence des saisies8. Par conséquent, une initiative majeure dans la recherche moderne sur l’épilepsie consiste à découvrir de nouvelles stratégies qui peuvent prévenir les crises récurrentes chez les patients à risque, tout en réduisant la nécessité de thérapies médicamenteuses fortes et de chirurgies réactives invasives.
Des crises épileptiques surviennent lorsqu’il y a un déséquilibre dans les circuits excitateurs et inhibiteurs dans tout le cerveau (épilepsie généralisée) ou dans une partie localisée du cerveau (épilepsie focale), de sorte que les neurones se déchargent de façon anormale9 , le 10 , 11. antiépileptiques peuvent agir de deux façons différentes dans la prévention des crises: soit la diminution de l’excitation ou l’amélioration de l’inhibition12. Plus précisément, ils peuvent soit modifier l’activité électrique des cellules neuronales en affectant les canaux ioniques dans la membrane cellulaire13 ou agir sur la transmission chimique entre les neurones en affectant le neurotransmetteur inhibiteur GABA ou l’excitateur glutamate dans les synapses14,15. Pour certains médicaments, le mode d’action est inconnu18. En outre, les traitements médicamenteux ont un effet continu sur les patients et ne peuvent pas s’adapter à la dynamique de prévalence des crises épileptiques. Idéalement, les médicaments avec des mécanismes d’action spécifiques agirait sur les processus épileptiques sous-jacents. Un traitement optimal ne touchera pas le cerveau interictally mais agirait immédiatement quand une crise commence à se développer. Contrairement à cela, dans tous les cas d’épilepsie, les médicaments signifient maintenant un traitement systématique, affectant tout le cerveau et tout le corps du patient9.
Les crises épileptiques peuvent apparaître plusieurs années après l’insulte initiale comme le traumatisme cérébral. La période entre l’insulte initiale et l’occurrence des premières saisies spontanées est caractérisée par des réorganisations moléculaires et cellulaires considérables, y compris la mort neuronale avec la disparition des connexions de réseau neuronale et de l’axonale germination/néosynaptogenèse avec l’apparition de nouvelles connexions19,20,21. Une fois que les saisies sont récurrentes, leur fréquence et leur sévérité tendent à augmenter, impliquant plus de régions cérébrales. Il est important de distinguer les sites d’apparition des crises (régions épileptogéniques) des réseaux de propagation, car les règles de la Genèse et de la propagation des crises peuvent différer. Les recherches effectuées sur les tissus humains et les modèles expérimentaux d’épilepsie ont fourni des données importantes concernant la réorganisation des circuits et leur capacité à générer des saisies20,21,22, 23. Toutefois, il est difficile de déterminer si ces réorganisations sont des réponses adaptatives ou si elles sont liées de façon causale à l’épilepsie ou à la genèse de la crise et à la propagation12.
Par conséquent, la localisation de la concentration épileptique et l’application de médicaments antiépileptiques localement constituent l’un des principaux défis de la recherche sur l’épilepsie contemporaine. Plusieurs expériences utilisant des modèles animaux de l’épilepsie et certaines études cliniques visaient à trouver le début des événements de crise et à définir les mécanismes sous-jacents dans le cerveau24,25,26,27. À cette fin, nous avons développé un nouveau protocole expérimental utilisant l’épilepsie induite par le 4AP, modèle28,29,30,31 dans une préparation aiguë de souris, qui permet l’insertion précise de trois périphériques dans la zone donnée de l’hippocampe, où l’activité du réseau in vivo est manipulée de manière hautement localisée. L’injection localisée de 4AP par une micropipette en verre aide à induire des SLEs épileptiques dans un endroit localisé de l’hippocampe, tandis qu’avec l’aide de la nouvelle sonde μFIP à base de polymère, le contrôle de l’activité de saisie est réalisé simultanément par l’enregistrement du neuronale l’activité électrique avec les sites d’enregistrement de l’appareil. L’activité de champ local de l’hippocampe est également surveillée avec une sonde de silicium multicanal d’une manière spécifique à la couche dans le cortex et dans l’hippocampe simultanément.
Les sondes μFIP récemment inventées fonctionnent en utilisant un champ électrique appliqué pour pousser les médicaments chargés stockés dans un canal microfluidique sur une membrane échangeuse d’ions (IEM) et vers les tissus environnants (figure 1). L’IEM transporte sélectivement un seul type d’ion (cation ou anion) et, par conséquent, travaille à limiter à la fois la diffusion passive dans l’état «off» et le transport d’espèces à charge opposée du tissu environnant dans l’appareil. Le champ électrique est créé à la demande en appliquant une petite tension (< 1 V) entre l’électrode source qui est interne au canal microfluidique et une électrode cible qui est externe à l’appareil (dans ce cas, la vis de tête sur le modèle animal). Le taux de délivrance des médicaments est proportionnel à la tension appliquée et au courant mesuré entre les électrodes source et cible. L’accordabilité précise de la délivrance des médicaments est l’un des principaux avantages du μFIP. Un autre avantage crucial, comparé aux systèmes de distribution de médicaments à base de fluide ou de pression, est que dans le PFIP, il n’y a qu’une augmentation négligeable de la pression au point de livraison de médicaments, car les médicaments sont livrés à travers l’IEM sans leur solution porteuse.
Il y a une petite quantité de fuite passive de GABA quand le μFIP est "OFF", mais cela a été trouvé pour ne pas affecter SLEs. Les μFIP sont fabriqués sur mesure suivant des méthodes de microfabrication conventionnelles que nous avons signalées précédemment31.
Comme une façon de prévenir les crises récurrentes est le blocus des rejets de réseau au tout début ou même avant la première crise, la méthode présentée pour délivrer le neurotransmetteur inhibiteur GABA dans la mise au point épileptique a une grande potentiel thérapeutique pour le contrôle des crises chez les patients atteints d’épilepsie focale. Comme le GABA est un substrat endogène, il laisse les propriétés neuronales intrinsèques inchangées dans les concentrations physiologiques. L’application locale de faibles niveaux de GABA n’affectera que les cellules naturellement sensibles à l’inhibition, et ne causera des effets similaires à l’inhibition physiologique, contrairement à la stimulation cérébrale profonde (DBS), qui a des actions non spécifiques en stimulant toutes les cellules du réseau neuronale dans son environnement, provoquant une réaction mixte impliquant à la fois l’excitation et l’inhibition. En conclusion, la méthode proposée offre une approche plus spécifique du contrôle des saisies que la DBS.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été exécutées conformément aux directives éthiques de l’Institut de neurosciences des systèmes et approuvées par les comités éthiques locaux et les bureaux vétérinaires.
Remarque: Dix-sept souris mâles adultes OF1 ont été utilisées pour les expériences. Les souris ont été entraînées à un cycle de 12 h de lumière/obscurité avec de la nourriture et de l’eau disponibles ad libitum.
1. l’anesthésie
- Injecter intrapéritonéale un mélange de kétamine et de xylazine (100 mg/kg de poids corporel et 10 mg/kg de poids corporel, respectivement) pour anesthésier l’animal.
-
Vérifiez le niveau d’anesthésie en observant la fréquence respiratoire et en fouettant et en vérifiant la réponse de la souris à la douleur.
Remarque: lorsque la respiration de la souris devient régulière, aucun fouet ne peut être observé, et l’animal ne réagit pas aux pincées de queue, l’anesthésie est assez profonde pour continuer.- Placez l’animal sur un coussin chauffant électriquement programmable. Couvrez la sonde de température rectale avec un produit à base de gelée de pétrole (voir tableau des matériaux) et placez-la doucement dans le rectum (1 – 2 cm de profondeur) de la souris pour surveiller sa température corporelle. Maintenir une température corporelle entre 36,5 et 37,5 ° c pendant les interventions chirurgicales et les enregistrements expérimentaux.
- Surveillez le niveau d’anesthésie en vérifiant les réflexes de la souris, les mouvements de moustaches et sa fréquence de respiration. En tenant compte du niveau d’anesthésie enregistré au moins toutes les 30 min, donner une petite dose d’un cocktail de kétamine-xylazine (20 – 50 μL, la même concentration utilisée comme avant) par voie intramusculaire.
2. chirurgie/craniotomie
- Fixez la tête de la souris dans un cadre stéréotaxique. À l’aide d’une aiguille de 30 G, injecter la ropivacaïne analgésique locale (5 μL, 7,5 mg/mL, voir tableau des matériaux) par voie sous-cutanée au site d’incision prévu. Autoriser 5 min pour qu’il prenne effet.
- Faire une ligne droite de coupe médiane dans la peau au-dessus du crâne avec un scalpel. Tirez doucement la peau vers les côtés avec de fines pinces et serrez-la de côté avec des pinces seraffiner Bulldog pour laisser le crâne exposé pour plus de travail.
- Nettoyez le crâne du fascia avec un scalpel ou tout autre outil similaire. En cas de saignement superficiel, retirer le sang avec des écouvillons de coton ou de petits morceaux de papier essuie-tout.
- Prendre un poly (3,4-éthylenedioxythiophène) polystyrène sulfonate (PEDOT: PSS)-vis de terre enduite (taille: #00, diamètre: 0,047 in, longueur: 1/8 in, voir tableau des matériaux) avec un fil soudé et branchez-le avec un connecteur à la tête de l’amplificateur.
- Humidifiez le crâne sur le site de perçage désiré et percez un trou à grande vitesse à l’aide d’un foret rond fin (avec un diamètre de 0,4 mm) sur le crâne au-dessus du cervelet jusqu’à ce que la dura soit visible. Mettez la vis de mise à la terre dans le trou et vissez-la avec un tournevis de précision jusqu’à ce qu’elle atteigne le sommet du cervelet.
Remarque: La vis de tête a été trempette avec une solution PEDOT: PSS contenant 1% 3-glycidyloxypropyl) triméthoxysilane (GOPs) en poids suivi d’une cuisson à 140 ° c pendant 90 min. PEDOT: PSS est un polymère conjugué avec une capacité volumétrique qui est connue pour être biocompatible. GOPS est un cross-Linker mélangé avec PEDOT: PSS pour augmenter la stabilité dans les milieux aqueux (figure 2). - Avec l’aide du cadre stéréotaxique, mesurez les coordonnées stéréotaxiques de la région cérébrale souhaitée. Par exemple, la région d’intérêt est l’hippocampe, antéropostérieur (AP)-1,8 mm et mediolatéral (ML) 1,8 mm du point de Bregma basé sur l’Atlas cérébral pour les souris32.
Remarque: Ce sont des coordonnées pour l’hémisphère droit (figure 2). - Mince une zone d’environ 1 à 2 mm de diamètre du crâne au-dessus de la région cible à l’aide d’un foret dentaire fiable (voir le tableau des matériaux) mis à une vitesse rapide jusqu’à ce qu’une mince, bien polie, membrane osseuse transparente reste.
- Ensuite, si l’épaisseur de la membrane osseuse est assez fine (< 200 μM), faites un petit trou avec des pinces fines et Enlevez délicatement la fine couche de l’OS33. Utilisez une aiguille à bout de crochet sur mesure pour enlever la dure-mère. Minimisez la taille de la craniotomie et de la durotomie pour prévenir le développement d’oedèmes et minimiser les pulsations cardiaques et/ou respiratoires du cerveau.
Remarque: La craniotomie doit être remplie d’une gouttelette de solution saline pour prévenir le séchage et ensuite régulièrement reremplie pendant l’expérience (figure 2).
3. insertion de la sonde de silicium multicanal
- Utiliser des bras stéréotaxiques dans un léger angle AP (20 °) pour que la sonde de silicium laisse suffisamment d’espace pour le positionnement des deux autres implants et pour avoir l’enregistrement et les sites d’injection de l’électrode, de la pompe ionique et de la micropipette aussi près que possible.
Remarque: Des électrodes, des seringues et des pompes ioniques ont été recouvertes d’une goutte de solution de coloration DiI (1, 1 '-Dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tétraméthyllindocarbocyanine perchlorate [DiI]), pour la visualisation post-hoc des traces d’implantation (0,5 mg/ml DiI dans le diméthyl - Placez la sonde de silicium sur le bras stéréotaxique attaché à un support magnétique et placez-la à côté du cadre stéréotaxique. Réglez l’angle AP (20 °), puis raccordez la sonde au niveau de la tête et à la vis de mise à la terre.
-
Abaisser lentement la sonde de silicium dans l’hippocampe à l’aide du bras stéréotaxique micron-precise ou d’un micromanipulateur motorisé pour éviter les mouvements latéraux (figure 2 et figure 3).
- Lancez le logiciel d’enregistrement et enregistrez — avec le headstage, l’amplificateur connecté et un ordinateur — des signaux neuronaux électriques tout en déplaçant la sonde de silicium multicanal du haut du cortex jusqu’à ce que la position dorsoventrale ciblée (DV) soit atteinte (- 1 800 μm à partir de la surface corticale). Enregistrez et observez le signal de potentiel de champ local (LFP) pendant la pénétration sur l’écran de l’ordinateur.
Remarque: Contrôlez la descente de la sonde de façon à ce qu’elle se déplace lentement et continuellement pendant l’enregistrement, afin d’avoir un meilleur contrôle visuel pour la pénétration et pour atteindre la zone cible. - Utilisez l’activité ondulatoire dans la couche pyramidale de la formation de l’hippocampe dans le LFP enregistré comme marqueur de la zone cible.
Remarque: L’activité ondulatoire est visible sur un ou deux canaux voisins de la sonde de silicium multicanal (si) ayant une distance de 100 μm entre les sites d’enregistrement (figure 4). - Enregistrez les signaux LFP des couches du cortex et de l’hippocampe simultanément à travers le logiciel de l’amplificateur multicanal (voir tableau des matériaux) à l’aide des sondes multivoies si (figure 4).
- Lancez le logiciel d’enregistrement et enregistrez — avec le headstage, l’amplificateur connecté et un ordinateur — des signaux neuronaux électriques tout en déplaçant la sonde de silicium multicanal du haut du cortex jusqu’à ce que la position dorsoventrale ciblée (DV) soit atteinte (- 1 800 μm à partir de la surface corticale). Enregistrez et observez le signal de potentiel de champ local (LFP) pendant la pénétration sur l’écran de l’ordinateur.
4. insertion de μFIP
- Raccorder les tubes (voir tableau des matériaux) à l’entrée du μfip et remplir la sonde avec la solution de GABA 0,05 M. Enlevez les tubes et fermez l’entrée avec l’emballage de film de paraffine. Raccordez les fils électriques à l’unité de mesure de la source.
- Insérez le μFIP à l’aide du bras stéréotaxique à un angle médiolatéral (MP) (20 °). La sonde si reste insérée pendant tout le processus.
Note: μfip est très flexible et peut bénéficier de l’appui d’un pinceau petit et propre pour le garder droit jusqu’à ce qu’il atteigne la surface du cerveau. Après cette étape, le μFIP peut être abaissé doucement avec des mouvements axiaux. - Abaisser lentement le μFIP avec des mouvements axiaux et ne jamais le laisser fléchir pendant la trajectoire jusqu’à ce qu’il atteigne la coordonnée dorsoventrale (DV) (-1 200 μm de la surface corticale).
Remarque: Essayez de mettre les deux appareils (μFIP et la sonde de silicium) le plus près l’un de l’autre que possible, compte tenu de la distance de 300 μm de la sortie de la pointe μFIP.
ATTENTION: Évitez tout problème mécanique entre les dispositifs et leurs connecteurs lors de l’insertion (figure 2b et figure 3b).
5. préparation des dispositifs pour l’induction de la saisie
- Changez l’aiguille métallique de la seringue (10 μL) (voir tableau des matériaux). Retirer la partie métallique de fixation de l’aiguille, placer et fixer la micropipette (diamètre extérieur [OD]: 1,2 mm, diamètre intérieur [ID]: 0,75 mm, diamètre de la pointe: 20 – 50 μM avec ± 0,5 cm de ruban adhésif de la tige), puis remplacer l’élément de maintien de l’aiguille.
- Positionner la seringue et la micropipette borosilicate attachée à un angle de 20 ° latéromedial (LM) pour l’injection de 4AP (50 mM dans le liquide cérébro-spinal artificiel [ACSF]).
Attention: Ne pas utiliser l’aiguille métallique de la seringue ou d’une micropipette avec une pointe supérieure à 50 μM. - Dessiner 500 nL – 1 μL de 50 mM 4AP à l’aide d’une pompe à micro-injection automatisée.
6. insertion de la pipette en verre attachée à une seringue pour injection 4AP
- Abaisser la micropipette en verre attachée à la seringue à la position DV visée (-1 500 μm), puis injecter 250 nL de la solution 4AP (figure 2 et figure 3). Démarrez l’enregistrement avec le logiciel d’enregistrement. Observez l’écran et attendez que le premier pic intercritiques apparaisse.
- Commencez la livraison de GABA par μfip immédiatement avec l’apparition du premier pic intercritiques. Fournissez le GABA en appliquant 1 V entre la source et la cible pour 100 s suivis de 1 s off, pendant 30 cycles. Avec l’aide du logiciel d’enregistrement, enregistrer pour un minimum de 2 h.
Remarque: La masse totale du GABA livré est d’environ 1 nmol (figure 5). - À la fin de l’expérience, Enlevez délicatement les sondes insérées et la vis de masse, et enlevez l’animal de l’équipement stéréotaxique. Les animaux ont été euthanasiés à l’aide d’un surdosage de drogue (i. p. 100mg/kg de pentobarbital). La mort a été confirmée par la cessation de la respiration et la circulation.
7. évaluation du placement des implants
- Après l’euthanatisation de l’animal, le perfuser par voie transcardiale, d’abord avec 50 mL de solution saline, puis avec 150 mL d’un fixatif à froid de glace contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le tampon de phosphate de 0,1 M (PB)34.
Attention: Le PFA est dangereux et doit être manipulé avec précaution. - Décapiter l’animal, puis enlever la peau et le muscle du haut et des côtés du crâne. À partir du foramen Magnum, faire des incisions latérales dans le crâne vers les oreilles et une incision sagittale ligne médiane, en prenant grand soin de ne pas endommager le cerveau. Enlevez délicatement le crâne avec une tondeuse à OS. Retirer le cerveau, puis couper un bloc de tissu de la région d’intérêt (du point de Bregma,-1 à-3 mm AP) à l’aide d’une matrice du cerveau (voir tableau des matériaux).
- Collez le bloc de tissu sur le porte-spécimen d’un vibratome, placez le socle dans celui-ci, et réglez le vibratome à 40 μm d’épaisseur dans un bain PB faire 40 μm sections coronale.
- Laver abondamment avec 0,1 M PB. Suivre le protocole histologique pour la coloration de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)31.
- Montez les sections sur les lames et recouvrez-les d’un support de montage contenant du 2-(4-amidinophényl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) (voir tableau des matériaux).
8. microscopie confocale
- Placer les lames avec les sections coronale colorées sous un objectif 20x d’un microscope confocale. Sélectionnez la région cible.
- Choisir les ensembles de filtres d’excitation et d’émission (exc/EMS) optimaux pour les colorants comme suit: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm et fluorescéine (voir tableau des matériaux) = 490/525 nm.
Remarque: Étant donné que la coloration varie selon la section, une gamme appropriée d’excitation et de détection minimales et maximales doit être déterminée pour chaque section, où les régions les moins denses et les plus denses montrent les émissions. - Choisissez la région la moins dense et définissez l’intensité et la détection du laser sur des valeurs élevées, puis vérifiez dans les régions les plus denses si ces valeurs provoquent une sursaturation des émissions détectées. Si c’est le cas, réduisez les valeurs et revérifiez-les avec la région la moins dense. Itérer ces étapes jusqu’à arriver à la détection la plus élevée possible à des niveaux de coloration faibles et des niveaux corrects, non sursaturés dans les zones fortement colorées. Répétez ce processus pour tous les colorants.
- Utilisez la fonction de balayage de tuiles du microscope avec 512 x 512 pixels par tuile pour obtenir un grand aperçu des sites d’insertion de la sonde avec une résolution adéquate pour le traitement post-hoc.
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Representative Results
En utilisant la procédure présentée ici avec un modèle d’épilepsie 4AP chez les souris anesthésiées, le contrôle des crises épileptiques peut être atteint dans la focalisation épileptique. La localisation précise des implants (figure 2) a permis d’enregistrer les potentiels de champ local de l’hippocampe (lfps, figure 4), d’induire de petites crises d’hippocampe et de délivrer le GABA au début de la crise. La localisation des implants a été vérifiée après chaque expérimentation par histologie post-hoc (figure 3).
Dans le cas où les SLEs étaient présents seulement dans l’hippocampe, l’activité épileptique a été mise sous contrôle total. La figure 5 montre un exemple représentatif de quand SLEs pourrait être arrêté avec la livraison du GABA par la nouvelle sonde neuronale incorporant un μfip. Lorsque 4AP a été injecté dans une plus grande zone ou sur le dessus du cortex, crises épileptiques sont devenus généralisées, de sorte que le GABA livré n’a pas été en mesure de modifier l’étendue des crises épileptiques (figure 6). La livraison d’ions sodium n’a pas eu d’effet notable sur l’activité induite par le 4AP (figure 7).
Figure 1: vue d’ensemble de la sonde μFIP. Vue schématique et taille réelle de la sonde μFIP. (a) schéma de l’extrémité implantée d’une sonde μfip montrant les caractéristiques primaires. (b) photo d’une sonde μfip avec une extrémité implantée à l’aiguille pointant vers le haut. Le bloc rouge est pour les connexions fluidiques. Barre d’échelle = 1 cm. (c) image du microscope d’une pointe de sonde μfip sans l’IEM. Barre d’échelle = 100 μM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: cranio-durotomie et localisation des implants dans le cerveau de la souris. (A) vue schématique de la chirurgie, de la craniotomie et de la cible des implants dans le cerveau de la souris. Ba utilisé les coordonnées stéréotaxiques et les angles pour l’implantation des trois dispositifs. μFIP = 20 ° mediolatéral (ML),-1 200 μm DV (vert). Sonde de silicium multicanal = 20 ° AP,-1 800 μm DV (bleu). Micropipette avec seringue = 20 ° LM,-1 500 μm DV (rouge). Le centre de la craniotomie est 1,8 mm ML,-1,8 mm AP pour l’hémisphère droit. Ce chiffre a été modifié à partir de Proctor et coll.31 (Copyright distribué sous la licence Creative Commons Attribution Noncommercial License 4,0 (CC BY-NC). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: évaluation histologique du placement de l’implantation. Le panneau (a) montre une figure 3D schématique sur la localisation de la formation hippocampale dans le cerveau de la souris (vert). Les panneaux (B, C et D) montrent les traces des dispositifs implantés — μfip, micropipette avec seringue et sonde de silicium multicanal (DII, rouge, flèches), respectivement31. Panneaux (BA, ca, da) montrent une image de grossissement élevé; panneaux (BB, CB, DB) montrent la page correspondante de l’Atlas du cerveau Paxinos et Franklin Mouse, alors que (BC, CC, DC) montrent une image à faible grossissement sur toute la section coronale de la droite hémisphère. Barre d’échelle = 500 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Enregistrement multicanal du cortex et de l’hippocampe. Enregistrement LFP avec une sonde de silicium multicanal avec une distance de 100 μm entre les sites d’enregistrement, à partir des couches du cortex (blanc) et de la formation de l’hippocampe (pourpre, CA1 = zone de Cornu ammonis 1; bleu, DG = gyrus denté. Notez l’activité ondulatoire de la strate pyramidale CA1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: contrôle d’une saisie induite par le GABA par le 4AP. Des enregistrements d’électrophysiologie représentatifs de l’hippocampe. (A) enregistrement en l’absence de traitement Μfip avec SLEs à partir d’environ 30 min après une injection de 4AP, suivi du statut épileptique. Benregistrement d’un cas dans lequel le traitement μfip a été initié immédiatement après le premier SLE. L’enregistrement ne montre aucun autre événement pathologique après le début du traitement. (C) enregistrement dans lequel le traitement μfip a été initié avant une injection de 4AP, ne montrant aucun événement pathologique. Les flèches rouges indiquent une injection de 4AP. Des flèches vertes solides indiquent le début du traitement μFIP, et les flèches vertes ouvertes marquent la fin du traitement μFIP. Des pics pointus à des intervalles de 100 s après une flèche verte sont des artefacts du traitement μFIP31. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: échec du contrôle d’une saisie induite par le GABA par le 4AP. Enregistrement électrophysiologique représentatif de l’hippocampe dans un cas où 4AP a été injecté avec l’aiguille métallique de la seringue, de sorte que les crises épileptiques ont affecté une plus grande zone cérébrale. Notez que la livraison de GABA n’a pas affecté l’intensité de la saisie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: expérience du véhicule. Les expériences de contrôle délivrant une dose équivalente d’ion sodique (Na+) à la place du GABA n’ont pas eu d’effet notable sur l’activité induite par 4AP, démontrant qu’il ne s’agit pas du courant appliqué de la pompe ionique qui module l’électrophysiologique l’activité, mais plutôt les molécules livrées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
En développant un nouveau protocole expérimental dans un modèle de souris aiguë de l’épilepsie, SLEs pourrait être contrôlé avec succès avec l’aide d’un μFIP implanté dans la focalisation épileptique. Grâce à sa capacité à délivrer le GABA avec une précision temporelle et spatiale, les SLEs de 4AP ont été contrôlées au début des crises. Le traitement de l’épilepsie est théoriquement possible si le contrôle des rejets du réseau neuronal est atteint au lieu du début de la saisie. Le protocole présenté prouvé cela possible si la localisation du neurotransmetteur inhibiteur injecté, GABA, est assez précis pour atteindre la focalisation épileptique dans le temps. Cependant, dans les cas où les crises épileptiques affectent de plus grandes zones du cerveau, le contrôle des crises par la livraison de GABA précisément localisée n’est pas possible. La zone d’influence de la sonde μFIP a été estimée avec un rayon d’environ 550 μm de la sortie. Il a été prouvé que SLEs ne pouvaient être affectées que si l’injection de 4AP était localisée dans cette zone31.
Par conséquent, la méthode est utile lorsque les crises épileptiques sont localisées, mais il n’a pas été possible de contrôler ou d’arrêter l’épilepsie lorsque les crises sont devenues multifoques ou généralisées. En outre, la méthode a été prouvée chez les rongeurs anesthésiés; dans les animaux en mouvement libre, des applications chroniques sont encore nécessaires pour étudier l’efficacité de ce protocole.
Alors que l’épilepsie a plusieurs formes et est causée par différents mécanismes sous-jacents, il est prouvé qu’environ 60% des patients ont un seul point focal épileptique35. Par conséquent, l’avantage de l’administration locale d’un neurotransmetteur inhibiteur endogène fournit un outil utile pour d’autres études expérimentales sur les animaux et présente une nouvelle stratégie dans le traitement de l’épilepsie focale. La méthode décrite a prouvé l’utilité du traitement μFIP dans une étude de souris aiguë et a ouvert la voie à d’autres développements technologiques pour assurer son application chronique. Nous croyons que les dispositifs d’administration de médicaments électrophorétiques ciblés avec précision peuvent être plus adaptés pour traiter non seulement l’épilepsie, mais aussi d’autres maladies neurodégénératives.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
C.M.P. reconnaît le financement d’une bourse d’études internationale Whitaker administrée par l’Institut pour l’éducation internationale. L’AK a été parrainé par l’IEF Marie Curie (no. 625372). Le Conseil européen de la recherche (ERC), dans le cadre du programme de recherche et d’innovation horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention n ° 716867), reconnaît un financement. La aw reconnaît en outre l’initiative d’excellence de l’Université Aix-Marseille-A * MIDEX, un programme Français "investissements d’avenir". Les auteurs reconnaissent le Dr. Ilke uguz, le Dr SaHikA inal, le Dr Vincenzo Curto, le Dr Mary Donahue, le Dr Marc Ferro et Zsófia Maglóczky pour leur participation à des discussions fructueuses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
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