Summary
这里介绍了一种半导体测序方法,用于非倍体(PGT-A)的植入前基因检测,具有周转时间短、成本低、通量高等优点。
Abstract
染色体非倍体是导致胚胎发育停止、植入失败或妊娠丧失的主要原因之一,在人类胚胎中已有详细记载。非倍体(PGT-A)的植入前基因测试是一种基因测试,通过检测胚胎的染色体异常,显著改善生殖结果。下一代测序(NGS)为基因分析提供了高通量和具有成本效益的方法,并在PGT-A中显示出临床应用性。在这里,我们提出了一种快速和低成本的基于半导体测序的NGS方法,用于筛选胚胎中的非倍体。工作流程的第一步是活检胚胎标本的全基因组扩增(WGA),然后是测序库的构建,以及随后对半导体测序系统的测序。通常,对于 PGT-A 应用程序,可以在每个芯片上加载和排序 24 个样本,以平均读取长度为 150 个碱基对生成 60-8000 万次读取。该方法为执行序列库的模板放大和扩充提供了精细的协议,使PGT-A检测可重复、高通量、经济高效和省时。该半导体音序器的运行时间仅为2~4小时,将接收样品至发布报告的周转时间缩短至5天。所有这些优点使得这种测定成为从胚胎检测染色体非倍体的理想方法,从而有助于它在PGT-A中的广泛应用。
Introduction
选择具有正常染色体拷贝数(双发体)的优质活胚胎进行辅助生殖转移,有助于改善妊娠结局。传统上,成熟的形态分级系统由于其易于获得和非侵入性而被广泛用于胚胎评估。然而,已经表明,形态评估只能提供关于胚胎质量1和植入潜力2的有限信息。一个根本原因是它不能评估胚胎的染色体组成。
染色体非倍体(染色体的异常拷贝数)是导致胚胎发育停止、植入失败或妊娠损失的主要原因之一。非倍体的发生在人类胚胎中已有所记载,在裂解阶段胚胎中占60%-70%,在胚泡5中分别占60%-70%和50%~60%。这在一定程度上造成了提高体外受精(IVF)治疗妊娠率的瓶颈,目前这一比率一直维持在35%-40%左右。因此,选择幼倍体胚胎进行移植被认为有利于改善妊娠结局。为此,进一步开发了非倍体(PGT-A)的植入前基因测试,以利用基因方法研究胚胎的生存能力。支持PGT-A关键作用的随机对照试验和队列研究越来越多。实践证明,PGT-A的应用降低了流产率,提高了临床妊娠率和植入率8,持续妊娠率和活产率9.
从历史上看,PGT-A应用了不同的方法,如荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交(CGH)、阵列-CGH和单核苷酸多态性(SNP)微阵列。先前的研究表明,FISH用于裂解阶段胚胎的PGT-A结果与使用59273array-CGH或SNP 微阵列5927310.这些差异可归因于染色体马赛克,FISH技术伪影,或胚胎自我纠正的染色体分离错误在开发11。人们普遍认为,使用胚泡营养素(TE)活检阵列为基础的PGT-A,如阵列-CGH或SNP-微阵列,对识别胚胎10、12的染色体不平衡有效。最近,单细胞下一代测序(NGS)为基因分析提供了高通量和具有成本效益的方法,并在PGT-A 13、14、15中显示出临床应用能力,这使得它成为有望替代现有方法。
在这里,我们提出了一种快速、可靠和低成本的基于半导体测序的NGS方法,用于筛选人类胚胎中的非倍体。工作流程的第一步是活检胚胎标本的全基因组扩增(WGA),使用单细胞WGA试剂盒,然后构建测序库,随后在半导体测序系统上进行测序。
通过检测DNA链合成过程中从每个脱氧核苷三磷酸结合中释放的H+离子,系统传输半导体元件捕获的化学信号(pH变化),以直接提供数字数据,进一步解释为DNA序列信息。这种简单的测序化学方法消除了昂贵的光学检测和复杂测序反应的要求,降低了总试剂成本,并将测序运行时间缩短为2⁄4小时16小时。更重要的是,根据制造商的性能规格,半导体测序平台每次运行可以生成多达 15 GB 的测序数据(取决于库的质量),这明显高于其他一些测序器仅生成约 3⁄4 GB 数据(读取长度为 2 x 75 bp)17。在PGT-A的临床应用中,该平台可实现每个芯片24个样本,产生多达8000万次读取17次,每个样品至少100万次唯一读取。读取深度可以确保每个样本至少具有0.05倍的全基因组覆盖率。该平台的上述优点使其成为理想的筛选方法,从而方便了其在PGT-A18中的广泛应用。
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Protocol
香港中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会(参考编号:2010.432)获道德认可。研究许可证获香港人类生殖科技委员会批准(编号R3004)。
1. 全基因组扩增
- 开始之前,检查磁珠(材料表)的体积,以确保每个样品的磁珠量不低于135μL(超过20%)。将磁珠保持在室温(RT)至少30分钟。为每个样品制备720μL(多20%)乙醇。在105°C下为热循环器(材料表)配备加热盖。
注:新制备的70%乙醇(材料表)应在3天内用完。 - 样品制备
注:在常规练习中,根据实践指南19对胚泡的5至10个营养细胞进行活检。- 在单个 0.2 mL 聚合酶链反应 (PCR) 管中暂停 2 μL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的活检。
- 在迷你离心机上短暂地旋转管3s,以收集液滴。
- 细胞莱沙和提取
- 在冰、涡旋和在迷你离心机上短暂旋转3s之前,在冰上解冻细胞提取缓冲液(材料表)和提取酶稀释缓冲液(材料表)。
- 从步骤1.2.2向每个管中加入3μL的细胞提取缓冲液。
- 通过加入4.8μL的萃取酶稀释缓冲液和0.2μL细胞萃取酶(材料表),为每个样品制备5μL细胞裂液主混合物。从步骤 1.3.2 将良好的和等分混合到每个管中。轻轻翻转管子,在迷你离心机上短暂旋转 3 s。
注意:添加主混合物时,提示不应接触含有细胞样品的液体。 - 将步骤 1.3.3 中的管从步骤 1.3.3 孵育到热循环器中,并盖上加热盖。使用以下设置运行程序:在 75°C 下运行程序 10 分钟,在 95°C 下运行 4 分钟,在 4°C 下保持。
- 预放大
- 在冰、涡旋上解冻预扩增缓冲液(材料表),并在使用前在迷你离心机上短暂旋转3s。
- 通过加入4.8 μL的预扩增缓冲液和0.2 μL的预扩增酶(材料表),为每个样品制备5μL预扩增主混合物。从步骤 1.3.4 将良好的和等分混合到每个管中。轻轻翻转管子,在迷你离心机上短暂旋转 3 s。
注意:添加主混合物时,提示不应接触含有 DNA 样本的液体。 - 用加热盖在热循环器中孵育管子。使用流动设置运行程序:在 95 °C 下运行 2 分钟;12个周期为15s,在95°C时为50s,40s在25°C时,30s在35°C,40s在65°C,40s在75°C;保持在 4 °C。
- 放大
- 在冰、涡旋上解冻扩增缓冲液(材料表),并在使用前在迷你离心机上短暂旋转3s。
- 通过添加25μL的扩增缓冲液、0.8μL的扩增酶(材料表)和34.2μL的无核酸酶水,为WGA(材料表)制备60μL扩增母混合液。从步骤 1.4.3 将良好的和等分混合到每个管中。轻轻翻转管子,在迷你离心机上短暂旋转 3 s。
- 用加热盖在热循环器中孵育管子。使用以下设置运行程序:在 95 °C 下运行程序 2 分钟;在95°C下15秒14次,65°C时1分钟,75°C1分钟;保持在 4 °C。
- 纯化WGA 产品
- 将每个 WGA 产品从步骤 1.5.3 转移到新的 1.5 mL 管中。在每个管中加入 112.5 μL 的磁珠。涡旋在RT孵育5分钟。
注:使用前完全混合磁珠。 - 将管子放在磁性支架(材料表)上3分钟,直到上清液变清楚。丢弃所有上清液,而不干扰珠子。
- 在每个管中加入300 μL的70%乙醇。将每个管旋转 180°,让珠子穿过乙醇,然后旋转回原始位置。在珠子稳定后丢弃所有上清液,而不会干扰珠子。重复此步骤一次。
注:水平旋转管时,将管放在磁性支架上。 - 在迷你离心机上短暂地旋转每根管子3s。将管子放在磁性支架上,直到残留的上清液清除。丢弃所有残留的上清液,而不会干扰珠子。在 RT 处将珠子晾干约 3 分钟。
- 从磁性支架上取下管子,通过添加 35 μL 的低 Tris-EDTA (TE) 缓冲液(材料表)来重新悬挂干燥的珠子。在 RT 孵育 5 分钟。
- 将管子放在磁性支架上 3 分钟,直到上清液变清。将所有含有洗脱DNA的上清液转移到新的1.5 mL管中,而不会干扰珠子。
- 将每个 WGA 产品从步骤 1.5.3 转移到新的 1.5 mL 管中。在每个管中加入 112.5 μL 的磁珠。涡旋在RT孵育5分钟。
2. WGA产品的质量控制
- 根据制造商手册,使用 1 μL WGA 产品作为起始材料,通过荧光计测定(材料表)从步骤 1.6.6 量化每个纯化的 WGA 产品。
注:WGA产品的公认浓度为± 10 纳克/μL。不建议任何低于此阈值的产品继续执行后续步骤。
3. WGA产品碎片化
- 开始之前,将干块加热器预热至 37°C。为每个样品制备 6 μL(多20%)0.5 M EDTA。根据浓度,在步骤1.6.6至新的0.2 mL PCR管中,每个纯化WGA产物的DNA等分300 ng,每个管的体积达到16μL,每个管的无核酸酶水。
-
破碎
- 通过添加2μL的dsDNA碎片反应缓冲液(材料表)和2μL的dsDNA碎片酶(材料表),为每个样品制备4μL双绞合DNA(dsDNA)分片反应混合物。从步骤 3.1 将良好的和等分混合到每个管中。涡旋,在迷你离心机上短暂旋转3秒,在带加热盖的热循环器中,在37°C下孵育管子25分钟。
- 立即将 5 μL 的 0.5 M EDTA 添加到每个管中。通过涡旋和在迷你离心机上短暂旋转3s,很好地混合。
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净化和再悬浮
- 将每个产品从步骤 3.2.2 转移到新的 1.5 mL 管中。在每个管中加入 37.5 μL 的磁珠。通过顶点混合,在 RT 孵育 5 分钟。
- 根据步骤 1.6.2 到步骤 1.6.4 所述,净化产品。
- 如步骤 1.6.5 和 1.6.6 中所述,通过添加 32 μL 的低 TE 缓冲液来洗净每个纯化产品。
4. 图书馆建设
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布伦特-endr对子、尺寸选择和纯化
- 通过加入 9.5 μL 无核酸酶水、10 μL 的 5x 端修复缓冲液(步骤 3.3.3中的材料管表),为每个样品准备 20 μL 钝端修复混合物。涡旋,在迷你离心机上短暂旋转3s。
- 从步骤 4.1.1 向每个管中加入 50 μL 的磁珠。涡旋在RT孵育5分钟。
注:使用前完全混合磁珠。 - 将每根管子放在磁性支架上 3 分钟,直到上清液变清。将所有上清液转移到新的 1.5 mL 管中,每个管中加入 25 μL 磁珠。用转移的上清液涡旋管,在RT孵育5分钟。
- 如步骤 1.6.2 到步骤 1.6.4 所述,在孵育管中纯化产品。
- 如步骤 1.6.5 和 1.6.6 中所述,通过添加 32 μL 的低 TE 缓冲液来洗净每个纯化产品。
注:这是一个安全停车点;从这一步的纯化DNA稳定在4°C不超过24小时。
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适配器l和p自动化
- 通过加入10μL无核酸酶水、5μL 10倍联苯缓冲液(材料表)、1 μL P1适配器(材料表)和1μLDNA连带酶(材料表),为每个样品制备17μL适配器结扎混合物。通过涡旋5s混合,在迷你离心机上旋转15s,从步骤4.1.5到每个管中等分。
- 根据示例表(补充文件:适配器连接示例表),从步骤 4.2.1 向每个管中添加 1 μL 适配器(材料表)。涡旋,在迷你离心机上短暂旋转3秒,在RT(20~25°C)孵育管20分钟。
- 从步骤 4.2.2 向每个管中加入 75 μL 的磁珠。通过顶点混合,在 RT 孵育 5 分钟。然后,根据步骤 1.6.2 到步骤 1.6.4 所述,对产品进行净化。
- 如步骤 1.6.5 和 1.6.6 中所述,通过添加 15 μL 的低 TE 缓冲液来洗净每个纯化产品。将所有含有洗脱脱的DNA的上清液转移到新的0.2 mL 8管条中。
注:这是一个安全停车点;从这一步的纯化DNA稳定在4°C不超过24小时。
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扩增和纯化
- 通过添加47.5μL的超级混合物(材料表)和2.5μL的引物混合物(材料表),为每个样品制备50μL扩增母混合液。通过涡旋和在微型离心机上短暂旋转进行混合,从步骤 4.2.4 到 0.2 mL 8 管条中等分。
- 涡旋带30s,在迷你离心机上短暂旋转3s。用加热盖在热循环器中孵育条。使用以下设置运行程序:在 72 °C 下运行程序 20 分钟;95°C时5分钟;95°C时15秒15次,62°C15秒,70°C1分钟;在70°C时5分钟;保持在 4 °C。
- 将每个产品从步骤 4.3.2 转移到新的 1.5 mL 管中。在每个管中加入 97.5 μL 的磁珠。通过涡旋混合,在RT孵育5分钟。
- 根据步骤 1.6.2 到步骤 1.6.4 所述,净化产品。
- 如步骤 1.6.5 和 1.6.6 中所述,通过添加 25 μL 的低 TE 缓冲液来洗净每个纯化产品。
5. DNA库的质量控制和稀释
- 根据制造商手册,使用 2 μL 的 DNA 库作为起始材料,通过荧光计测定,通过步骤 4.3.5 对每个制备的 DNA 库进行量化。
- DNA库的接受浓度为±0.5纳克/μL,正对照浓度为±15纳克/μL。如果正对照的浓度从 15 纳克/μL 变化太大,则重复正对照的定量,直到浓度接近 15 纳克/μL。如果库的浓度低于 0.5 纳克/μL,请从碎片中重新启动(第 3 节)。
注:在量化DNA库之前,确保正对照的浓度达到可接受的值。 - 通过添加无核酸酶水,将每个库稀释至100pmol。在无核酸酶水nμL中加入1μL的库;使用下面的公式计算 n:
其中 Q 是荧光计测定测量的每个库的浓度,C 是荧光计测定测量的正对照的浓度。
6. 测序
- 开始之前,为每个样品制备 48 μL(多 20% 的)1 M NaOH 和一个无核酸酶管。在RT处解冻主混合PCR缓冲液(材料表)(2000 μL体积)。将球体颗粒(材料表)带到RT。
- 库池
- Vortex 从步骤 5.3 中每个稀释的库,并在迷你离心机上短暂旋转 4 倍,每次旋转 3 s。取每个库的 5 μL,将无核酸酶管集中到管中。涡旋混合库,并在迷你离心机上短暂旋转3s。
- 使用乳化系统的乳化PCR
- 在2个新的回收管(材料表)中加入150 μL的破碎溶液。安装新的恢复管、恢复路由器和放大板。
- 通过反转油瓶 (材料表) 3 次进行混合.确保机油和回收溶液 (材料表) 至少 2/3 已满。
- 涡旋主混合PCR缓冲液30秒,并在迷你离心机上短暂旋转3秒,涡流球形颗粒和混合库从步骤6.2.1111分钟,并在迷你离心机上短暂旋转3秒。
- 通过在含有2000μL主混合PCR缓冲液的管中加入172μL的无核酸酶水、步骤6.3.3的8μL混合液库、120μL的酶混合物(材料表)和100μL球状颗粒,制备2400μL结扎混合物。
- 将移液器设置为 800 μL。将结扎混合物从步骤 6.3.4 加载到反应过滤器(材料表)通过样品端口。使用 1000P 移液器向反应滤清器中添加 200 μL 的反应油。
- 选择程序质子:Ion PI Hi-Q OT2 200套件,然后,选择辅助按钮,以确保设备已按照监视器上的说明正确设置。然后,单击"下一步"以启动程序。
- 通过自动浓缩系统浓缩
- 当乳液 PCR 程序完成后,单击"下一步",然后单击"最终旋转"旋转 10 分钟。单击"打开盖子"后,拿出 2 个恢复管。
- 从 2 个回收管中丢弃上清液,直到每个管中保留 100 μL,并相应地贴上标签。将溶液混合均匀并转移到新的 1.5 mL 管中。
- 在每个回收管中加入200 μL无核酸酶水,通过上下移液多次清洗,并在步骤6.4.2中将所有溶液转移到1.5 mL管中。重复洗涤步骤一次。
- 将 200 μL 的无核酸酶水加入其中一个回收管中,然后通过上下移液多次清洗。将所有溶液转移到其他回收管,然后通过上下移液多次清洗。然后,将所有溶液从步骤 6.4.3 转移到同一 1.5 mL 管。涡旋1.5 mL管30秒和离心机8分钟,在15,500 x g。
注:此步骤中乳化PCR产品的最终总体积应约为1200μL。 - 将上清液丢弃在管中,并保留 20 μL 的乳化 PCR 产物。在管中加入80 μL的再悬浮溶液(材料表)。通过上下移液混合。
- 通过加入280μL的聚乙烯乙二醇山梨单酸盐溶液(材料表)和40μL的1M NaOH,为每个芯片制备320μL熔化溶液。
注:1M NaOH 应储存在 4°C 或新鲜制备。使用前的漩涡。 - 涡旋含有C1珠的管子(材料表)为30s。将 100 μL 的 C1 磁珠加入新的 1.5 mL 管中。在 RT 处将 1.5 mL 管放在磁性支架上 2 分钟。在珠子稳定后丢弃所有上清液,而不会干扰磁珠。
- 从步骤6.4.7向管中加入1 mL的洗涤液C1(材料表)。在RT处将管子放在磁性支架上2分钟。在珠子稳定后丢弃所有上清液,而不会干扰珠子。通过添加 130 μL 的珠捕获溶液 (材料表) 来重新悬浮珠子。
-
浓缩系统设置
- 从步骤 6.4.5 加载样品(100 μL 乳化 PCR 产品),从步骤 6.4.8 将洗涤珠 (130 μL) 从步骤 6.4.8、ES 洗涤溶液 (300 μL) (材料表)和熔化溶液 (300 μL) 从步骤 6.4.6 装入 8 管条。布局顺序为:样品(管1)、洗珠(管2)、ES洗涤溶液(管3、4、5)和熔化溶液(管7)。保持管 6 和 8 为空。
- 将步骤 6.4.9.1 中的 8 管条放在 ES 上。安装移液器尖端和新的 0.2 mL 管,然后启动程序。
注:确保移液工作正常。
- 浓缩完成后,清洗球体颗粒。
- 在 15,500 x g下将 0.2 mL 管从步骤 6.4.9.2 中离心 5 分钟。丢弃上清液,并保留10 μL的浓缩产物。在管中加入200 μL无核酸酶水。通过涡旋混合。
- 在 15,500 x g下将 0.2 mL 管从 5 分钟起离心。丢弃上清液,并保留10 μL的浓缩产物。在管中加入90 μL的无核酸酶水。通过涡旋混合。
- 模板准备
- 涡旋正控制并短暂旋转。向 100 μL 模板(步骤 6.4.10.2 中的浓缩产物)添加 5 μL 的正控制。涡旋和离心机在15,500 x g下工作5分钟。丢弃上清液并保留模板的 10 μL。
- 从步骤6.5.1向模板管添加20μL测序引物(材料表)和15μL退火缓冲液(材料表)。旋管,在迷你离心机上短暂旋转3s。
- 将管从步骤 6.5.2 孵育到热循环器中,并盖上加热盖。使用以下设置运行程序:95°C 时运行 2 分钟,在 37°C 下运行 2 分钟,在 4°C 下保持。
- 从步骤 6.5.3 向管中添加 10 μL 的加载缓冲液 (材料表)。通过上下移液混合。
- 序列器初始化
- 检查氮气的油箱压力(总压力 = 500 psi,输出压力 = 10 psi,最佳 20-30 psi)。将 100 mL 去离子水 (18.2 MΩ) 顶到 C1 和 C2 管(材料表),并将其安装在音序器上的相应 C1 和 C2 位置。
- 准备 W1(32 μL 的 1 M NaOH)和 W3(40–50 mL 的 W3 缓冲液 +材料表+)溶液。通过加入1920 mL的去离子水(18.2 MΩ)、一整瓶W2缓冲液(材料表)和8~12μL(1M NaOH),并反转4~8次混合,制备W2溶液。
注:由于水质地质变化,根据需要调整1M NaOH的体积。W2 的起始 pH 值为 5.9±6.1,调整后的最佳范围为 7.4×7.6。更换并安装新的试剂管,并使用最近使用的芯片进行清洗。 - 从测序补充试剂盒(材料表)准备4个新的空管。将 4 个管标记为 dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP,并将 70 μL 的 dGTP、dCTP、dATP 或 dTTP(材料表)添加到相应的管中(即,70 μL dGTP 到标记为 dGTP 的管中,等等)。使用前涡流管。将管子安装到音序器(材料表)上指定的相应位置。
- 芯片清洗
- 将100μL异丙醇注入芯片的加载井中,清洗一次芯片(材料表)。从对面的井中取出排出的液体。
- 将 100 μL 无核酸酶水注入芯片的加载井,将芯片清洗两次。从对面的井中取出排出的液体。
- 将 100 μL 的 0.1 M NaOH 注入芯片的加载井,将芯片清洗一次。从对面的井中取出排出的液体。在 RT 孵育 1 分钟。
- 将 100 μL 无核酸酶水注入芯片的加载井,将芯片清洗一次。从对面的井中取出排出的液体。
- 将 100 μL 异丙醇注入芯片的加载井,将芯片清洗两次。从对面的井中取出排出的液体。将氮气吹到芯片上干燥。远离光线。
- 样品加载和排序
- 通过上下移液,将步骤 6.5.4 中的 55 μL 样品混合,并将样品加载到芯片的加载井中。
注:保留此步骤中使用的移液器尖端和 0.2 mL PCR 管。 - 将芯片放在芯片迷你离心机 (材料表) 上
- 为退火缓冲液和冲洗溶液准备两个新的 1.5 mL 管。通过加入500μL退火缓冲液和无核酸酶水,制备50%退火缓冲液。通过加入500μL的退火缓冲液和500μL的100%2丙醇来制备冲洗溶液。
- 在两管中混合 49 μL 50% 退火缓冲液和 1 μL 发泡溶液(材料表),制备两个新的 1.5 mL 管,并制备发泡混合物。
- 将移液器设置为 100 μL。通过将空气从步骤 6.8.4 中的两个管之一移入发泡混合物中,形成气泡。制作 > 120 μL 的气泡并保持移液,直到看不到突出的可见气泡。将 120 μL 的气泡装入装井。
注:确保没有未结的可见气泡。否则,重新开始。 - 通过移液将过量排出的液体从步骤 6.8.5 从出口井转移到装载井。不要移液器气泡。在芯片微型离心机上将芯片离心30s。
- 使用步骤 6.8.4 中包含发泡混合物的第二管重复步骤 6.8.5。
- 将 50% 退火缓冲液的 55 μL 添加到步骤 6.8.1 中保持的 0.2 mL 管中。使用步骤 6.8.1 中保持的移液器尖端上下移液器。将所有 55 μL 退火缓冲液加载到装载井中。在指定的芯片微型离心机上将芯片离心30s。
- 将 100 μL 的冲洗溶液装入芯片加载井,并将排出的液体从出口井中排出。重复此加载步骤一次。
注:如果芯片中有气泡,则用大气泡排出小气泡,然后冲洗溶液。这可以通过移液 100 μL 的冲洗溶液,并将 5 μL 的空气留在冲洗溶液下方来实现。因此,当将105μL移入芯片时,空气会形成一个大气泡,可以排出小气泡,然后,大气泡可以通过以下冲洗溶液排出。 - 将 50% 退火缓冲液的 100 μL 加载到芯片加载井中。重复此加载步骤共 3 次。
- 将6μL的测序酶加入60μL的50%退火缓冲液中,放入新的1.5 mL管中。通过上下移液混合。将这种混合溶液的65 μL加载到芯片加载井中。移液缓慢,以避免发泡。
- 使芯片远离光线,在 RT 孵育 5 分钟。
- 孵育后,立即将芯片加载到音序器上,然后单击"开始屏幕上的排序运行"以开始测序。
注:排序原始数据和质量控制文件将自动上传到公司进行数据分析。
- 通过上下移液,将步骤 6.5.4 中的 55 μL 样品混合,并将样品加载到芯片的加载井中。
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Representative Results
基于这一修改协议,首次将半导体测序平台应用于PGT-A。我们测试了裂解阶段胚泡和胚泡阶段胚胎的活检。建议活检细胞尽快进行WGA,以防止DNA降解。以前的研究比较了不同WGA方法的性能,指出我们在这里描述的方法在100KB20的bin大小下具有最佳的均匀性。考虑到均匀性和中位数绝对成对差(MAPD)21的性能,使用半导体定序器为PGT-A选择了这种WGA方法。通过对186个裂解阶段和1135个胚泡阶段胚胎的回顾性统计分析,我们发现,在胚泡样本中WGA成功率为95.4%,在胚泡样本中为96.9%(图1)。库结构前的纯化步骤作为尺寸选择过程,通过捕获大型DNA片段对测序质量至关重要。此外,它方便了300纳克的图书馆建设投入量。酶分片法使WGA产品的有效剪切量增加到约160 bp。
采用欧氏距离和圆形二进制分割(EDCBS)分析系统进行数据分析。进行了内部验证,以评估该生物信息学算法的鲁棒性。我们通过对66个已知核型细胞系的379个WGA产品进行测序,建立了PGT-A专用的参考数据库,通过分析100KB的箱号。在此数据库中,将参考范围描述为拷贝号变体 (CNV) 调用的阈值,并将 10 MB 设置为检测级别的截止。在此阈值时,灵敏度和特异性均达到 99% 以上(表 1)。在胚胎活检的PGT-A应用中,窗口大小设置为400KB,滑动窗口方法可达到足够的读取量。每个样品的质量控制 (QC) 由拷贝号变体 (CNV_SD) 的唯一读取、MAPD 和标准偏差确定。三个索引之一以外的样本被定义为 QC 故障 (图 2C)。染色体散射图的解释(图2A,B,D)由合格的遗传学家根据工作流程进行,通过比较已识别的CNV到DECIPHER、DGV或ClinGen数据库。 个别差异由专家治疗程序控制。染色体异常被分为胚泡样本中的非倍体和马赛克。在30%~70%范围内的拷贝数增益或损耗被归类为携带马赛克染色体成分;否则,结果将被解释为优倍体或反倍体。在这项研究中,胚泡的胚泡率在胚泡中为45.2%,胚泡为52.3%,这与公布的数据22、23的一致。
图1:采用该方法检测的1321个胚胎活检的统计学统计。(A) 来自186个裂解阶段胚胎的数据.(B) 来自1135个胚泡阶段胚胎的数据。这两种标本的WGA成功率均超过95%。分序质量控制失败率为3.4%,在裂解阶段组仅为1.9%。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:23对染色体的PGT-A胚胎临床应用代表性结果。(A) 优发的代表性结果;(B) 失调 (seq[GRCh37] (2)x3, (21)x3;(C) 由于 CNV_SD 在 0.6571(接受 = 0.4),因此对 QC 测序失败样本;(D) 分段马赛克删除 (55%)4p16.3p15.1 (29.50 MB)。请点击此处查看此图的较大版本。
CNV 阈值 | ||||||
(-0.23, 0.20) | (-0.32, 0.26) | (-0.41, 0.32) | (-0.51, 0.37) | (-0.62, 0.43) | (-0.73, 0.48) | |
灵敏度 | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 98.30% | 96.02% |
特 异性 | 72.41% | 81.03% | 91.38% | 99.10% | 99.54% | 100.00% |
表1:半导体测序仪不同对数R比之间的灵敏度和特异性。该方法共测试了240个样本,这些样本具有已知的欧倍体核型结果,并采用不同的日志R比率进行调用。
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Discussion
与其他测序化学不同,此处描述的定序器使用半导体检测核苷酸。芯片本身是一种电子设备,通过聚合酶驱动的碱基结合17检测氢离子,使质子计划的测序时间达到2⁄4小时。此外,该芯片是一种微孔芯片,允许定位一个目标分子,这不同于其他测序器的流细胞测序化学。该协议是针对 PGT-A 应用优化的经过修改的协议。优化包括通过酶法对扩增DNA进行碎片化,而不是声波,以减少污染的机会,以及尺寸选择和PCR系统,以降低成本实现更好的性能。此外,在临床设置中,我们使用经过验证的内部管道进行变体调用。
在练习过程中,需要注意一些关键步骤。用于纯化的乙醇需要在实验前新鲜制备,因为高浓度的乙醇会导致对受污染的DNA洗涤不足,而低浓度会导致目标DNA的丧失。荧光计必须通过已知浓度的正控制进行校准,以确保准确性。此外,模板的足够加载对于排序至关重要。适当大小的气泡有助于将模板球体推入微井,但太大的气泡可能会导致负载不足。用户可以修改要为每个运行排序的样本数(不一定为 24)。有96个索引为这个芯片设计。但是,测序读取深度会随着每个芯片样本的增加而降低。最常见的问题之一是库浓度低,这可能是由于残留乙醇或磁珠导致纯化导致的DNA输出低或质量差,或如前所述珠子开裂所致。PCR 的低效率也可能导致 DNA 输出不理想,通过谨慎制备主混合物和热循环器的准确样品输入和温度检查,可以纠正该结果。对于QC失败样品的测序,如那些具有高CNV_SD值的样品(图2C),建议在生物分析仪上运行样本,以进行尺寸分布分析。
该方法的局限性之一是与其他平台相比,其假单核苷酸调用速率更高。错误率为1%,而其他音序器17的误报率仅为0.1%。但是,这不是 CNV 调用或 PGT-A 分析的决定性因素。与其他平台相比,乳化系统的应用最大限度地减少了操作差异和移液误差,提高了库质量。与其他平台相比,这是我们方法的一个显著优势,因为dsDNA浓度非常低,因此以下库池需要精确的定量。我们的方法介绍了用标准正控制来控制检测误差的荧光计定量校准。
半导体定序器作为高通量平台,周转时间短,是PGT-A的理想选择,可广泛应用于PGT-A临床适应症IVF患者,如24岁晚期。Deleye等人对人类胚泡进行了并行测序,将半导体测序仪的性能与其他测序仪25进行比较。此外,该PGT-A试剂盒还获得了国家食品药品监督管理局的"创新医疗器械特别审批程序",并已临床用于数千个胚胎。在成本方面,该平台的价格是每千兆基价的一半,而PGT-A市场的另一个常用平台则价格。营养细胞可以可靠地代表胚胎26的遗传组成。正如Treff等人27日所证明的那样,这种方法有可能为单源/单基因疾病(PGT-M)的PGT开发。在他们的模型中,他们为16个胚胎活检的PGT-M提供了300MB到1GB的吞吐量,并将结果与两种传统的PGT-M方法进行了比较。通过捕获和加载16个样本,他们的方法达到目标区域至少100倍的读取深度,并产生100%的可靠性和可重复性27。根据我们的协议,半导体音序器的吞吐量可达15GB,设计了96个条码;因此,如果应用于靶向PGT-M,大量的胚胎活检可以由一个芯片在高读取深度下进行测序。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了香港综合研究基金(参考文献号14162417)、国家自然科学基金(参考文献号81860272)、广西省科学技术基金重大研究计划(参考文献号81860272)的支持。AB16380219)和中国博士后科学基金资助(参考号2018M630993) 。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Ion PI Annealing Buffer | |||
MyOne Beads Capture Solution | |||
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
ISP Resuspension Solution | |||
Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI Sequencing Primer | |||
server for sequencer | Lenovo | T260 | |
Ion PI Sphere Particles | |||
Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
Ion PI Hi?Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
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