Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Published: August 25, 2019 doi: 10.3791/59273
Automatic Translation
*1,2,3, *4, 5, 4, 4, 4, 6, 6, 4, 3,4
1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en halvleder sekvensering metode for Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) med fordelene av kort behandlingstid, lave kostnader, og høy gjennomstrømming.

Abstract

Kromosomavvik, en av de viktigste årsakene som fører til embryonale utvikling arrest, implantat svikt, eller graviditet tap, har vært godt dokumentert i menneskelig embryo. Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) er en genetisk test som i betydelig grad forbedrer reproduktive utfall ved å påvise kromosom unormalt av embryo. Neste generasjons sekvensering (NGS) gir en høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv tilnærming for genetisk analyse og har vist klinisk anvendelse i PGT-A. Her presenterer vi en rask og lav pris halvleder sekvensering-basert NGS metode for screening av avvik i embryo. Det første trinnet i arbeidsflyten er hele Genova forsterkning (WGA) av biopsied embryo prøven, etterfulgt av byggingen av sekvensering biblioteket, og etterfølgende sekvensering på halvleder sekvensering systemet. Vanligvis, for en PGT-A-applikasjon, kan 24 prøver lastes inn og sekvensert på hver chip genererer 60 − 80 millioner leser på en gjennomsnittlig lese lengde på 150 base parene. Metoden gir en raffinert protokoll for å utføre mal forsterkning og berikelse av sekvensering biblioteket, noe som gjør PGT-A deteksjon reproduserbar, høy gjennomstrømming, kostnadseffektiv, og tidsbesparende. Kjøretiden for denne halvleder Sequencer er bare 2 − 4 timer, forkorte behandlingstiden fra å motta prøver å utstede rapporter i 5 dager. Alle disse fordelene gjør denne analysen en ideell metode for å oppdage kromosom aneuploidies fra embryo og dermed tilrettelegge sitt brede program i PGT-A.

Introduction

Velge god kvalitet levedyktig embryo med normal kromosom kopi tall (euploid) for overføring i assistert reproduksjon bidrar til å forbedre graviditets utfall. Tradisjonelt er det godt etablerte morfologiske vurderingssystemet mye brukt for embryo evaluering på grunn av sin enkle tilgjengelighet og ikke-invasiv natur. Det har imidlertid vist seg at morfologiske vurderingen bare kan gi begrenset informasjon om embryo kvalitet1 og implantation potensial2. En fundamental grunn er dens manglende evne til å evaluere den kromosom sammensetningen av embryo.

Kromosomavvik (unormal kopi antall kromosomer) er en av de viktigste årsakene som fører til embryonale utviklingen arrest, implantation svikt eller graviditet tap. Forekomsten av avvik har blitt godt dokumentert i menneskets embryo, og sto for 60% − 70% i en kløft-fase embryo3,4 og 50% − 60% i blastocysts5. Dette har til en viss grad bidratt til flaskehalsen for å forbedre graviditets raten på in-vitro befruktning (IVF) behandling, som har opprettholdt på rundt 35% − 40%6,7. Derfor, velge euploid embryo for overføring antas å være gunstig for å forbedre graviditets utfall. For dette formål har Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) blitt videreutviklet for å undersøke embryo levedyktighet ved hjelp av genetiske tilnærminger. Det er økende antall randomiserte kontrollerte studier og Kohortstudier som støtter den avgjørende rollen til PGT-A. Det har blitt bevist at anvendelsen av PGT-A reduserer spontanabort rate og øker klinisk graviditet rate og implantation rate8, pågående graviditet rate og live fødselsrate9.

Historisk sett har ulike metoder blitt anvendt i PGT-A, slik som fluorescens in situ hybridisering (fisk), komparativ genomisk hybridisering (CGH), array-CGH, og singel nukleotid polymorfisme (SNP)-Microarray. Tidligere studier har indikert at PGT-A for kløft-scenen embryo av FISH gir resultater som er dårlig i samsvar med de som oppnås ved omfattende kromosom screening (CCS) av tilsvarende blastocysts ved hjelp av 59273array-CGH eller SNP-microarray5927310. Disse avvikene kan tilskrives kromosom mosaikk, fisk tekniske gjenstander, eller embryonale selv-korreksjon av kromosom segregering feil under utvikling11. Det har blitt allment anerkjent at bruk av blastocyst trophectoderm (te) biopsier for array-baserte pgt-A som Array-CGH eller SNP-Microarray er effektivt for å identifisere kromosom ubalanse i embryo10,12. Nylig, én celle neste generasjons sekvensering (NGS) gir en høy-gjennomstrømning og kostnadseffektiv tilnærming for genetisk analyse og har vist klinisk anvendelse i pgt-en13,14,15, som gjør det til en lovende alternativ til tiden tilgjengelige metoder.

Her presenterer vi en rask, robust, og lavprisalternativ halvleder sekvensering-basert NGS metode for screening av avvik i menneskelig embryo. Det for det første steg av arbeidsflyten er hele Genova forsterkning (WGA) av det biopsied embryo eksemplar, benytter en enkelt-cellen WGA utstyr, føle etter av bygging av sekvensering bibliotek, og etterfølgende sekvensering på halvleder sekvensering system.

Gjennom å oppdage H+ ioner som er gitt ut fra hver deoxyribonucleoside trifosfat INNLEMMELSE under DNA strand syntese, overfører systemet de kjemiske signalene (pH endring) tatt av halvleder elementer til direkte digitale data , som ytterligere tolkes i DNA-sekvens informasjon. Eliminerer kravet til dyre optisk deteksjon og komplekse sekvensering reaksjoner, denne enkle sekvensering kjemi reduserer totale reagens kostnader og forkorter sekvensering kjører tid i 2 − 4 timer16. Enda viktigere, basert på produsentens ytelsesspesifikasjoner, kan den halvleder sekvensering plattformen generere opptil 15 GB sekvensering data (avhengig av kvaliteten på biblioteket) per Run, som er betydelig høyere enn noen av de andre sequencere produserer bare rundt 3 − 4 GB data (med 2 x 75 BP lese lengde)17. I kliniske anvendelser av PGT-A, kan denne plattformen oppnå 24 prøver per chip genererer opp til 80 000 000 leser17 og minst 1 000 000 unike leser av hver prøve. Lese dybden kan sikre at hvert utvalg har minst 0,05 x hele Genova dekning. De ovennevnte fordelene med denne plattformen gjør det til en ideell screening metode og dermed tilrettelegge sine brede applikasjoner i PGT-A18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etisk godkjenning ble gitt av Joint Chinese University of Hong Kong-nye territorier East Cluster Clinical Research etikk Committee (referansenummer: 2010,432). Forsknings lisens ble godkjent av rådet for Human reproduktiv teknologi i Hong Kong (Number R3004).

1. hele Genova forsterkning

  1. Før start, sjekk volumet av magnetiske perler (tabell av materialer) for å sikre at det ikke er mindre enn 135 μL (med 20% overflødig) for hver prøve. Hold de magnetiske perlene i romtemperatur (RT) i minst 30 min. klargjør 720 μL (med 20% overskudd) på 70% etanol for hver prøve. Utstyr en termisk cycler (materialfortegnelsen) med oppvarmet lokk ved 105 ° c.
    Merk: den nylig forberedte 70% etanol (tabell over materialer) bør brukes opp innen 3 dager.
  2. Eksempel på tilberedning
    Merk: i rutinen praksis, 5 til 10 trophectoderm celler av blastocyst er biopsied i henhold til praksis retningslinje19.
    1. Suspendere biopsier i 2 μL av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) i en enkelt 0,2 mL polymerase kjede reaksjon (PCR) tube.
    2. Snurr kort i røret på en mini sentrifuge for 3 s for å samle dråpene.
  3. Cellelyse og ekstraksjon
    1. Tin celle utvinnings bufferen (innholdsfortegnelsen) og fortynnings bufferen for utvinnings enzym (tabell med materialer) på is, Vortex og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s før bruk.
    2. Tilsett 3 μL av celle utvinnings buffer til hvert rør fra trinn 1.2.2.
    3. Forbered en 5 μL cellelyse Master mix for hver prøve ved å tilsette 4,8 μL av fortynnings buffer for utvinnings enzymer og 0,2 μL celle utvinnings enzym (tabell med materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trinn 1.3.2. Vend røret forsiktig og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s.
      Merk: tips bør ikke berøre væsken som inneholder celle prøvene når du legger til Master mix.
    4. Ruge slangen fra trinn 1.3.3 i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med følgende innstillinger: 10 min ved 75 ° c, 4 min ved 95 ° c, hold ved 4 ° c.
  4. Preamplification
    1. Tin preamplification buffer (tabell av materialer) på is, Vortex og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s før bruk.
    2. Forbered en 5 μL preamplification Master mix for hver prøve ved å tilsette 4,8 μL av preamplification buffer og 0,2 μL av preamplification enzym (tabell med materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trinn 1.3.4. Vend røret forsiktig og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s.
      Merk: tips bør ikke berøre væsken som inneholder DNA-prøvene når du legger til Master mix.
    3. Ruge røret i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med de flytende innstillingene: 2 min ved 95 ° c; 12 sykluser for 15 s ved 95 ° c, 50 s ved 15 ° c, 40 s ved 25 ° c, 30 s ved 35 ° c, 40 s ved 65 ° c, 40 s ved 75 ° c; Hold ved 4 ° c.
  5. Forsterkning
    1. Tin forsterknings bufferen (materialfortegnelsen) på is, Vortex og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s før bruk.
    2. Forbered en 60 μL forsterknings Master mix for hver prøve ved å tilsette 25 μL forsterknings buffer, 0,8 μL av forsterknings enzym (tabell av materialer) og 34,2 μL av nuklease vann for WGA (tabell av materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trinn 1.4.3. Vend røret forsiktig og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s.
    3. Ruge røret i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med følgende innstillinger: 2 min ved 95 ° c; 14 sykluser for 15 s ved 95 ° c, 1 min ved 65 ° c, 1 min ved 75 ° c; Hold ved 4 ° c.
  6. Rensing av den WGA-produkter
    1. Overfør hvert WGA-produkt fra trinn 1.5.3 til nye 1,5 mL-rør. Tilsett 112,5 μL av magnetiske perler i hvert rør. Vortex og ruge ved RT i 5 min.
      Merk: Bland de magnetiske perlene helt før bruk.
    2. Plasser rørene på et magnetisk stativ (materialfortegnelsen) i 3 minutter til supernatanten er klar. Kast alle supernatanten uten å forstyrre perlene.
    3. Tilsett 300 μL av 70% etanol i hvert rør. Roter hvert rør 180 ° for å la perlene gå gjennom etanol og roter tilbake til den opprinnelige posisjonen. Kast alle supernatanten etter at perlene har avgjort uten å forstyrre perlene. Gjenta dette trinnet én gang.
      Merk: Hold slangen på det magnetiske stativet mens du roterer røret horisontalt.
    4. Snurr kort hvert rør på en mini sentrifuge for 3 s. Plasser rørene på det magnetiske stativet til rest supernatanten er klart. Kast alle gjenværende supernatanten uten å forstyrre perlene. Lufttørke perlene på RT i ca 3 min.
    5. Fjern rørene fra det magnetiske stativet og resuspend de tørkede perlene ved å tilsette 35 μL av lav Tris-EDTA (TE) buffer (tabell av materialer). Ruge ved RT for 5 min.
    6. Plasser rørene på det magnetiske stativet i 3 minutter til supernatanten er klart. Overfør alle supernatanten som inneholder eluert DNA til nye 1,5 mL rør uten å forstyrre perlene.

2. kvalitetskontroll av WGA-produktene

  1. Kvantifisere hver renset WGA fabrikat fra steg 1.6.6 av en fluorometer analysen (kilde av arbeidsmateriale) alt etter fabrikanten ' håndbok benytter 1 ΜL av WGA fabrikat idet igangsetting materiale.
    Merk: den aksepterte konsentrasjonen av WGA-produktet er ≥ 10 ng/μL. Ethvert produkt under denne terskelen er ikke anbefalt å gå videre til de neste trinnene.

3. fragmentering av WGA-produkter

  1. Før start, varm opp en tørr blokk varmer til 37 ° c. Forbered 6 μL (med 20% overskudd) på 0,5 M EDTA for hver prøve. Basert på konsentrasjonen, alikvot 300 ng av DNA fra hver renset WGA produkt i trinn 1.6.6 til nye 0,2 mL PCR rør og bringe volum til 16 μL med nuklease vann for hvert rør.
  2. Fragmentering
    1. Forbered en 4 μL dobbelt strandet DNA (dsDNA) fragmentering reaksjons miks for hver prøve ved å legge til 2 μL av dsDNA fragmentering reaksjonsbuffer (tabell av materialer) og 2 μL av dsDNA fragmentering enzymer (tabell av materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trinn 3,1. Vortex og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s. ruge rørene i 25 min ved 37 ° c i en termisk cycler med oppvarmet lokk.
    2. Tilsett 5 μL av 0,5 M EDTA umiddelbart til hvert rør. Bland godt med virvlingen og kort spinn på en mini sentrifuge for 3 s.
  3. Rensing og blanding
    1. Overfør hvert produkt fra trinn 3.2.2 til nye 1,5 mL rør. Tilsett 37,5 μL av magnetiske perler i hvert rør. Bland med vertexing og ruge på RT i 5 min.
    2. Rens produktene som beskrevet fra trinn 1.6.2 til trinn 1.6.4.
    3. Eluere hvert renset produkt som beskrevet i trinn 1.6.5 og 1.6.6 ved å tilsette 32 μL av lav TE buffer.

4. bibliotek konstruksjon

  1. Blunt- e nd r epairment, størrelsesvalg og rensing
    1. Forbered en 20 μL stump repairment blanding for hver prøve ved å tilsette 9,5 μL av nuklease vann, 10 μL av 5x ende reparasjons buffer (tabell over Materialrør fra trinn 3.3.3. Vortex og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s.
    2. Tilsett 50 μL av magnetiske perler til hvert rør fra trinn 4.1.1. Vortex og ruge ved RT i 5 min.
      Merk: Bland de magnetiske perlene helt før bruk.
    3. Plasser hvert rør på det magnetiske stativet i 3 minutter til supernatanten er klart. Overfør alle supernatanten til nye 1,5 mL rør der 25 μL magnetiske perler tilsettes for hver. Vortex rørene med de overførte supernatanten og ruge ved RT i 5 min.
    4. Rens produktene i de inkubert rørene som beskrevet fra trinn 1.6.2 til trinn 1.6.4.
    5. Eluere hvert renset produkt som beskrevet i trinn 1.6.5 og 1.6.6 ved å tilsette 32 μL av lav TE buffer.
      Merk: Dette er et trygt stopp punkt; renset DNA fra dette trinnet er stabilt ved 4 ° c i mer enn 24 h.
  2. Adapter l gation og p urification
    1. Forbered en 17 μL adapter ligation blanding for hver prøve ved å tilsette 10 μL av nuklease vann, 5 μL av 10x ligase buffer (tabell over materialer), 1 ΜL av P1 adapter (tabell av materialer), og 1 μL av DNA Ligase (tabell over materialer). Bland godt av virvlingen for 5 s og spinne på en mini sentrifuge for 15 s, og alikvot i hvert rør fra trinn 4.1.5.
    2. Tilsett 1 μL adaptere (innholdsliste) i hvert rør fra trinn 4.2.1 i henhold til eksempel arket (tilleggsfil: eksempel ark for adapter-ligation). Vortex og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s. ruge rørene ved RT (20 − 25 ° c) i 20 min.
    3. Tilsett 75 μL av magnetiske perler i hvert rør fra trinn 4.2.2. Bland med vertexing og ruge på RT i 5 min. Deretter renser produktene som beskrevet fra trinn 1.6.2 til trinn 1.6.4.
    4. Eluere hvert renset produkt som beskrevet i trinn 1.6.5 og 1.6.6 ved å tilsette 15 μL av lav TE buffer. Overfør alle supernatanten som inneholder eluert DNA til nye 0,2 mL 8-rør strimler.
      Merk: Dette er et trygt stopp punkt; renset DNA fra dette trinnet er stabilt ved 4 ° c i mer enn 24 h.
  3. Forsterkning og rensing
    1. Forbered en 50 μL forsterknings Master miks for hver prøve ved å tilsette 47,5 μL av super mix (materialfortegnelsen) og 2,5 μL av primer blanding (tabell med materialer). Bland godt med virvlingen og kort spinn på en mini sentrifuge, og alikvot inn i 0,2 mL 8-rør strimler fra trinn 4.2.4.
    2. Vortex stripene for 30 s og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s. ruge stripene i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med følgende innstillinger: 20 min ved 72 ° c; 5 min ved 95 ° c; 10 sykluser for 15 s ved 95 ° c, 15 s ved 62 ° c, 1 min ved 70 ° c; 5 min ved 70 ° c; Hold ved 4 ° c.
    3. Overfør hvert produkt fra trinn 4.3.2 til nye 1,5 mL rør. Tilsett 97,5 μL av magnetiske perler i hvert rør. Bland med virvlingen og ruge på RT i 5 min.
    4. Rens produktene som beskrevet fra trinn 1.6.2 til trinn 1.6.4.
    5. Eluere hvert renset produkt som beskrevet i trinn 1.6.5 og 1.6.6 ved å tilsette 25 μL av lav TE buffer.

5. kvalitetskontroll og fortynning av DNA-biblioteket

  1. Kvantifisere hvert forberedt DNA-bibliotek fra trinn 4.3.5 av fluorometer analysen i henhold til produsentens Manual med 2 μL av DNA-bibliotek som start materiale.
  2. Den aksepterte konsentrasjonen av DNA-biblioteket er ≥ 0,5 ng/μL, og for den positive kontrollen (materialfortegnelsen) er ≤ 15 ng/μL. Hvis konsentrasjonen av den positive kontrollen varierer for mye fra 15 ng/μL, gjentar du kvantifisering til den positive kontrollen til konsentrasjonen er nær 15 ng/μL. Hvis konsentrasjonen av biblioteket er under 0,5 ng/μL, start på nytt fra fragmentering (del 3).
    Merk: Sørg for at konsentrasjonen av den positive kontrollen når den aksepterte verdien før du kvantifisere DNA-biblioteket.
  3. Fortynne hvert bibliotek til 100 pmol ved å legge nuklease-fritt vann. Tilsett 1 μL bibliotek til n μL av nuklease-fritt vann; Beregn n ved hjelp av ligningen nedenfor:
    Equation
    der Q er konsentrasjonen av hvert bibliotek målt ved fluorometer analysen og C er konsentrasjonen av den positive kontrollen målt ved fluorometer analysen.

6. sekvenser

  1. Før start skal du tilberede 48 μL (med 20% overskudd) på 1 M NaOH for hver prøve og ett nuklease 1,5 mL rør. Tin den Master Mix PCR-bufferen (innholdsfortegnelsen) (2000 til μL i volum) ved RT. Bring sfære partikler (tabell over materialer) til RT.
  2. Bibliotek utvalg
    1. Vortex hvert utvannet bibliotek fra trinn 5,3 og kort spin 4X på en mini sentrifuge for 3 s hver gang. Ta 5 μL av hvert bibliotek for å svømme til bassenget i det nuklease-frie 1,5 mL røret. Vortex det blandede biblioteket og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s.
  3. Emulsjon PCR ved hjelp av et emulsjon system
    1. Tilsett 150 μL av brudd løsning på 2 nye gjenopprettings rør (tabell av materialer). Installer den nye utvinning rør, utvinning router og forsterkning plate.
    2. Bland ved å invertere oljeflasken (tabell av materialer) 3 ganger. Sørg for at både olje-og gjenvinnings løsningen (materialfortegnelsen) er minst 2/3 full.
    3. Vortex Master Mix PCR buffer for 30 s og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s. Vortex sfæren partikler og blandet biblioteket fra trinn 6.2.1 i 1 min og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s.
    4. Forbered en 2400 μL ligation blanding ved å tilsette 172 μL av nuklease vann, 8 μL av blandet bibliotek fra trinn 6.3.3, 120 μL av enzym blanding (tabell av materialer), og 100 μL av kule partikler til røret som inneholder 2000 μL Master Mix PCR buffer.
    5. Sett en pipette til 800 μL. Legg den ligation blandingen fra trinn 6.3.4 til reaksjons filteret (tabell over materialer) gjennom eksempel porten. Bruk en 1000P pipette for å tilføye 200 μL av reaksjons olje til reaksjons filteret.
    6. Velg programmet Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit, og velg deretter assistert knappen for å sikre at enheten er satt opp riktig ved å følge instruksjonene på skjermen. Deretter klikker du neste for å starte programmet.
  4. Berikelse av en automatisk berikelse system
    1. Når emulsjon PCR-programmet er fullført, klikk neste, og klikk deretter endelig spin å spinne i 10 min. Ta ut 2 utvinning rørene etter å ha klikket Åpne Lid.
    2. Kast supernatanten fra de 2 gjenvinnings rørene inntil 100 μL er igjen i hvert rør, og merk deretter. Bland løsningen godt og Overfør til en ny 1,5 mL tube.
    3. Tilsett 200 μL av nuklease vann til hvert gjenvinnings rør, vask ved å pipettering opp og ned flere ganger, og Overfør all oppløsningen til 1,5 mL røret i trinn 6.4.2. Gjenta vaske trinnet én gang.
    4. Tilsett 200 μL av nuklease vann til en av utvinnings rørene og vask ved å pipettering opp og ned flere ganger. Overfør alle løsningen til den andre utvinning røret og vask ved pipettering opp og ned flere ganger. Deretter overfører du alle løsningen til samme 1,5 mL rør fra trinn 6.4.3. Vortex 1,5 mL rør for 30 s og sentrifuge i 8 min ved 15 500 x g.
      Merk: det endelige totale volumet av emulsjon PCR-produktet i dette trinnet bør være omtrent 1200 μL.
    5. Kast supernatanten i røret og behold 20 μL av emulsjon PCR-produktet. Tilsett 80 μL av blanding oppløsning (materialfortegnelsen) i slangen. Bland med pipettering opp og ned.
    6. Forbered en 320 μL smelte løsning for hver chip ved å tilsette 280 μL av polyetylen glykol sorbitan sorbierittmonolaurat løsning (tabell av materialer) og 40 μL av 1 M NaOH.
      Merk: 1 M NaOH skal oppbevares ved 4 ° c eller ferskt tilberedt. Vortex før bruk.
    7. Vortex røret inneholder C1 perler (tabell av materialer) for 30 s. Ta 100 μL av C1 perler til et nytt 1,5 mL rør. Plasser 1,5 mL røret på det magnetiske stativet i 2 minutter ved RT. kast alle supernatanten etter at perlene har avgjort uten å forstyrre perlene.
    8. Tilsett 1 mL vaskeløsning C1 (tabell over materialer) til slangen fra trinn 6.4.7. Vortex for 30 s. Plasser røret på det magnetiske stativet i 2 minutter ved RT. kast alle supernatanten etter at perlene har avgjort uten å forstyrre perlene. Resuspend perlene ved å tilsette 130 μL av perle opptaks løsning (tabell med materialer).
    9. Berikelse system (ES) Oppsett
      1. Legg prøven (100 μL emulsjon PCR-produkt) fra trinn 6.4.5, de vasket perlene (130 μL) fra trinn 6.4.8, ES vaskeløsning (300 μL) (tabell av materialer) og smelte løsning (300 μL) fra trinn 6.4.6 inn i 8-tube Strip. Oppsetts rekkefølgen er: sample (tube 1), vasket perler (rør 2), ES vaskeløsning (rør 3, 4, 5), og smelte løsning (rør 7). Hold rør 6 og 8 tomme.
      2. Plasser 8-røret stripen fra trinn 6.4.9.1 på ES. Installer en pipette spiss og en ny 0,2 mL rør og starte programmet.
        Merk: Sørg for at pipettering fungerer normalt.
    10. Vask sfæren partikler etter at berikelse er fullført.
      1. Sentrifuger 0,2 mL rør fra trinn 6.4.9.2 i 5 min ved 15 500 x g. Kast supernatanten og behold 10 μL av berikelse produktet. Tilsett 200 μL av nuklease vann til slangen. Bland med virvlingen.
      2. Sentrifuger 0,2 mL rør fra i 5 minutter ved 15 500 x g. Kast supernatanten og behold 10 μL av berikelse produktet. Tilsett 90 μL av nuklease vann til slangen. Bland med virvlingen.
  5. Forberedelse av maler
    1. Vortex den positive kontrollen og spinne kort. Tilsett 5 μL av positiv kontroll til 100 μL mal (den berikelse produktet fra trinn 6.4.10.2). Vortex og sentrifuger i 5 min ved 15 500 x g. Kast supernatanten og behold 10 μL av malen.
    2. Tilsett 20 μL av sekvensering primer (tabell av materialer) og 15 μL av annealing buffer (tabell over materialer) til mal røret fra trinn 6.5.1. Vortex røret og kort spinne på en mini sentrifuge for 3 s.
    3. Ruge slangen fra trinn 6.5.2 i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med følgende innstillinger: 2 min ved 95 ° c, 2 min ved 37 ° c, hold ved 4 ° c.
    4. Tilsett 10 μL av laste buffer (tabell av materialer) til røret fra trinn 6.5.3. Bland med pipettering opp og ned.
  6. Initialisering av Sequencer
    1. Kontroller tanktrykket av nitrogen gass (samlet trykk ≥ 500 PSI, utgangs trykk ≥ 10 psi, optimal 20-30 PSI). Top-Up 100 mL deionisert vann (18,2 MΩ) til C1 og C2 rør (tabell av materialer) og installer dem til tilsvarende C1 og C2 posisjoner på Sequencer.
    2. Forbered W1 (32 μL av 1 M NaOH) og w3 (40 − 50 mL av w3 buffer [tabell over materialer]) løsninger. Forbered W2-løsning ved å tilsette 1920 mL deionisert vann (18,2 MΩ), en hel flaske W2-buffer (tabell av materialer) og 8 − 12 μL av 1 M NaOH, og Inverter 4 − 8 ganger for å blande.
      Merk: fordi vannkvaliteten varierer geologisk, Juster volumet på 1 M NaOH etter behov. Start pH i W2 er 5,9 − 6.1, og det optimale området etter justeringen er 7,4 − 7.6. Endre og Installer nye reagensrør og bruk det siste brukte chip for vasking.
    3. Forbered 4 nye tomme rør fra sekvensering supplement Kit (tabell av materialer). Merk de fire rørene som dGTP, dCTP, dATP og dTTP, og Legg til 70 μL av dGTP, dCTP, dATP eller dTTP (tabell over materialer) i tilsvarende rør (dvs. 70 μL dGTP til røret merket som dGTP, etc.). Vortex rørene før bruk. Monter rørene til tilsvarende posisjoner utpekt på Sequencer (tabell av materialer).
  7. Vask av spon
    1. Vask brikken (tabell over materialer) en gang ved å injisere 100 μL av isopropanol i laste brønnen på brikken. Fjern den utvist væsken fra motsatt brønn.
    2. Vask brikken to ganger ved å injisere 100 μL av nuklease vann i laste brønnen på brikken. Fjern den utvist væsken fra motsatt brønn.
    3. Vask brikken en gang ved å injisere 100 μL av 0,1 M NaOH i laste brønnen på brikken. Fjern den utvist væsken fra motsatt brønn. Ruge for RT for 1 min.
    4. Vask brikken en gang ved å injisere 100 μL av nuklease vann i laste brønnen på brikken. Fjern den utvist væsken fra motsatt brønn.
    5. Vask brikken to ganger ved å injisere 100 μL av isopropanol i laste brønnen på brikken. Fjern den utvist væsken fra motsatt brønn. Tørr ved å blåse nitrogen på brikken. Holdes vekk fra lyset.
  8. Eksempel på innlasting og sekvenser
    1. Bland 55 μL-prøven fra trinn 6.5.4 ved å pipettering opp og ned og laste prøven til laste brønnen på brikken.
      Merk: Oppbevar pipette spissen og 0,2 mL PCR-slangen som brukes i dette trinnet.
    2. Plasser brikken på chip mini sentrifuge (tabell av materialer) når
    3. Forbered to nye 1,5 mL rør for annealing buffer og skylle løsning. Klargjør 50% annealing buffer ved å tilsette 500 μL av annealing buffer og 500 μL av nuklease vann. Klargjør trekk oppløsningen ved å tilsette 500 μL av annealing buffer og 500 μL av 100% 2-propanol.
    4. Forbered to nye 1,5 mL rør og Forbered skummende blandingen ved å blande 49 μL av 50% annealing buffer og 1 μL skum løsning (tabell av materialer) i begge rørene.
    5. Sett en pipette til 100 μL. lag bobler ved å pipettering luft inn i skummende blandingen fra en av de to rørene fra trinn 6.8.4. Lag > 120 μL av bobler og hold pipettering inntil det ikke kan ses noen utestående synlige bobler. Legg 120 μL av bobler i laste brønnen.
      Merk: Pass på at det ikke er noen utestående synlige bobler. Hvis ikke, starter du den på nytt.
    6. Overfør overdreven utvist væske fra avkjøringen brønn fra trinn 6.8.5 til lasting godt av pipettering. Ikke Pipetter bobler. Sentrifuger brikken for 30 s på chip mini sentrifuger.
    7. Gjenta trinn 6.8.5 ved å bruke det andre røret som inneholder skummende blandingen fra trinn 6.8.4.
    8. Tilsett 55 μL av 50% annealing buffer til 0,2 mL røret oppbevares i trinn 6.8.1. Bruk den holdt pipette spissen i trinn 6.8.1 å pipette opp og ned. Last alle 55 μL annealing buffer til laste brønnen. Sentrifuger brikken i 30 s på den utpekte chip mini sentrifuger.
    9. Last 100 μL skylle løsning inn i chip lasting godt og kast utvist væske fra exit godt. Gjenta dette innlastings trinnet én gang.
      Merk: Hvis det er bobler i brikken, utvise små bobler av store bobler og flush ved Flushing løsning. Dette kan oppnås ved pipettering 100 μL av skylle løsning og etterlater 5 μL luft under skylle løsningen. Derfor, når pipettering den 105 μL i chip, vil luften danne en stor boble som kan utvise de små boblene, og deretter kan den store boblen bli utvist av følgende Flushing løsning.
    10. Load 100 μL av 50% annealing buffer i chip lasting godt. Gjenta dette innlastings trinnet for totalt 3 ganger.
    11. Tilsett 6 μL av sekvensering enzymet i 60 μL av 50% annealing buffer i en ny 1,5 mL tube. Bland med pipettering opp og ned. Load 65 μL av denne blandede løsningen i chip lasting godt. Pipetter langsomt for å unngå skumdannelse.
    12. Hold brikken unna lys og ruge ved RT i 5 minutter.
    13. Etter inkubasjons, umiddelbart laste chip på Sequencer og klikk Start sekvensering kjøre på skjermen for å starte sekvensering.
      Merk: sekvensering rådata og kvalitetskontroll filer vil bli lastet opp automatisk til selskapet for dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Basert på denne endrede protokollen var plattformen for halvleder sekvensering for første gang, søkt om PGT-A. Vi testet på biopsier fra blastomeres og blastocyst embryo. Det er en foreslo det det biopsied celler gjennomgå WGA snarest å forhindre alle nedbrytning av DNA. En tidligere studie sammenlignet resultatene av ulike WGA metoder og indikerte at metoden vi beskrev her hadde den beste ensartethet på bin størrelsen på 100 KB20. Betenke det gjennomførelse av begge to ensartethet og median absolutt parvis differansen (MINNEOLA)21, denne WGA metoden var valgt for pgt-en benytter det halvleder Sequencer. Gjennom en retrospektiv statistisk analyse på 186 kløft scenen og 1135 blastocyst stadium embryo, observerte vi at WGA suksess ratene var 95,4% i blastomere prøver og 96,9% i blastocyst prøver (figur 1). Den rensing trinn før biblioteket konstruksjon som en størrelse utvalgs prosedyren var avgjørende for sekvensering kvalitet ved å fange store DNA-fragmenter. I tillegg er det tilrettelagt input mengden av 300 NG for biblioteket konstruksjon. Enzymatisk fragmentering metoden aktivert en effektiv klipping av WGA-produkter til ca 160 BP.

Data analyse ble utført ved hjelp av euklidsk avstand og sirkulær binære segmentering (EDCBS) analysesystem. In-House validering ble utført for å evaluere robusthet av denne Bioinformatic algoritmen. Vi etablerte en referansedatabase eksklusivt for PGT-A gjennom sekvensering 379 WGA produkter fra 66 cellelinjer med kjente karyotypes ved å analysere en bin størrelse på 100 KB. Fra denne databasen ble et referanse område avgrenset som terskelen for kall for kopierings nummer variant (CNV), og 10 MB ble angitt som avkuttet for gjenkjennings nivået. Både følsomhet og spesifisitet nådde over 99% ved denne terskelen (tabell 1). I søknaden om PGT-A på embryo biopsier, ble vindusstørrelsen satt til 400 KB med en glidende vindu tilnærming for å nå nok leser. Kvalitetskontroll (QC) av hvert utvalg ble bestemt av unike leser, MINNEOLA og standardavvik av Copy Number variant (CNV ∙ SD). Eksempel utover en av de tre indeksene ble definert som QC-feil (figur 2C). Tolkning av kromosom scatter plott (figur 2a,B, D) ble utført av kvalifiserte Genetikere etter en arbeidsflyt ved å sammenligne de identifiserte cnv til dechiffrere, DGV eller ClinGen databaser. Individuelle avvik ble kontrollert av en ekspert håndplukking prosedyre. Kromosom unormalt ble gruppert i avvik og mosaikk i blastocyst prøver. Et kopi nummer gevinst eller tap innenfor området 30% − 70% ble klassifisert som bærer mosaikk kromosom sammensetning; ellers tolkes resultatet som enten euploidy eller avvik. I denne studien, var euploid ratene 45,2% i blastomeres og 52,3% i blastocysts, som ekko til publiserte data22,23.

Figure 1
Figur 1: demografisk statistikk på 1321 embryo biopsier testet av denne metoden. (A) Data fra 186 kløft-scenen embryo. (B) Data fra 1135 blastocyst-nivå embryo. WGA suksessen ratene er over 95% inne begge to typer av prøver. Sekvensering kvalitetskontroll feilrater er 3,4% i den kløft-fase gruppen og bare 1,9% i blastocyst-gruppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative resultater av pgt-A klinisk anvendelse av embryo for 23 par kromosomer. Representative resultater av (A) euploidy; (B) avvik (SEQ [GRCh37] (2) X3, (21) X3); (C) sekvensering QC mislyktes prøve på grunn av cnv ∙ SD på 0,6571 (aksept ≤ 0,4); (D) segmental mosaikk sletting (55%) av 4p 16.3 p 15.1 (29,50 MB). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

CNV terskelverdi
(-0,23, 0,20) (-0,32, 0,26) (-0,41, 0,32) (-0,51, 0,37) (-0,62, 0,43) (-0,73, 0,48)
Følsomhet 100,00 prosent 100,00 prosent 100,00 prosent 100,00 prosent 98,30 prosent 96,02 prosent
Spesifisitet 72,41 prosent 81,03 prosent 91,38 prosent 99,10 prosent 99,54 prosent 100,00 prosent

Tabell 1: følsomhet og spesifisitet mellom ulike log R prosenter av halvleder Sequencer. Totalt 240 prøver med kjente euploid Karyotype resultater ble testet med denne metoden og kalles ved forskjellige log R-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskjellig fra andre sekvensering kjemikalier, den Sequencer beskrevet her bruker halvledere for påvisning av nukleotider. Brikken i seg selv er en elektronisk enhet som oppdager hydrogen ioner av polymerase-drevet base innlemmelse17, som gjør at 2-4 h sekvensering tid av Proton programmet. Dessuten er chip en mikrotiterplateleser chip som gjør at lokalisering av ett mål molekyl, som er forskjellig fra flyten cellen sekvensering kjemi av andre Sequencer tilbydere. Denne protokollen er en modifisert protokoll optimalisert for anvendelsen av PGT-A. Optimaliseringen omfatter fragmentering av forsterket DNA ved enzymatisk metode i stedet for sonikering for å redusere risikoen for forurensning, samt størrelsesvalg og PCR-systemet for bedre ytelse med lavere kostnader. I tillegg, i klinisk setting, brukte vi en validert in-House rørledning for variant ringer.

Det er viktige trinn å være klar over i løpet av øvelsen. Etanol for rensing må tilberedes før eksperimentet, som en høy konsentrasjon av etanol ville føre til utilstrekkelig vask av forurenset DNA, mens en lav konsentrasjon ville føre til tap av mål DNA. Fluorometer må kalibreres av positiv kontroll med en kjent konsentrasjon for å sikre nøyaktigheten. Dessuten er en tilstrekkelig lasting av malen avgjørende for sekvensering. Bobler av riktig størrelse bidra til å skyve malen sfære å falle i microwells, men for store bobler kan føre til utilstrekkelig lasting. Brukere kan endre antall prøver (ikke nødvendigvis 24) for å være sekvensielt for hver kjøring. Det er 96 indekser designet for denne brikken. Men sekvensering lese dybden vil avta med økende prøver per chip. En av de vanligste problemene er lav biblioteket konsentrasjon, som kan tilskrives en lav eller dårlig kvalitet DNA-utgang fra rensing på grunn av gjenværende etanol eller magnetiske perler, eller cracking av perler som tidligere nevnt. En suboptimal DNA-utgang kan også resultere fra lav virkningsgrad av PCR, som kan korrigeres ved forsiktig utarbeidelse av Master Mix med nøyaktig prøve innganger og temperaturkontroll av termisk cyclers. For sekvensering QC-mislykkede prøver, for eksempel de med høy CNV ∙ SD-verdier (figur 2C), anbefales det å kjøre prøvene på en bioanalyzer for størrelses fordelings analyse.

Ettall av begrensningene av denne metoden er dens høyere false enkelt-nukleotid yrke rate sammenlignet med annet plattform. Feilen rate er 1% sammenlignet med bare 0,1% indel false positiv rate av annet sequencere17. Dette er imidlertid ikke en avgjørende faktor for CNV kall eller PGT-A-analyse. Sammenlignet med andre plattformer, anvendelse av emulsjon systemet minimerer operative avvik og pipettering feil, øke biblioteket kvalitet. Dette er en betydelig fordel av vår metode i forhold til andre plattformer fordi dsDNA konsentrasjonen er svært lav og en nøyaktig kvantifisering er nødvendig for følgende biblioteket pooling. Vår metode introduserte kalibrering av fluorometer kvantifisering ved hjelp av en standard positiv kontroll for å kontrollere deteksjons feilen.

Som en høy gjennomstrømnings plattform med kort behandlingstid, er halvleder Sequencer ideell for PGT-A og kan brukes mye på IVF-pasienter med PGT-A kliniske indikasjoner som avansert mors alder24. Deleye et al. gjennomført parallell sekvensering av menneskelig blastocysts å sammenligne ytelsen til halvleder Sequencer med andre sequencere25. Videre har denne PGT-A Kit fått "spesiell godkjenning prosedyre på innovative medisinske enheter" fra Kina Food and Drug Administration og har blitt klinisk brukt for tusenvis av embryo. Når det gjelder pris, er prisen på denne plattformen halv pris per Giga baser i forhold til en annen vanlig brukt plattform i PGT-A-markedet. De trophectoderm cellene kan pålitelig representere genetisk grunnlov av fosteret26. Denne metoden kan potensielt utvikles for PGT for monogenic/enkelt gen sykdommer (PGT-M) som treff et al. har demonstrert27. I sin modell, de tilrettelagt 300 MB til 1 GB gjennomstrømning på PGT-M på 16 embryo biopsier og sammenlignet resultatene til to konvensjonelle PGT-M metoder. Ved å fange og laste 16 prøver, nådde deres metode minst 100 k lese dybde i den målrettede regionen og resulterte i 100% pålitelighet og reproduserbarhet27. Gjennomstrømningen av halvleder Sequencer av vår protokoll kan nå 15 GB, og det er 96 strekkoder designet; Derfor, hvis brukt på målrettede PGT-M, et betydelig antall embryo biopsier kan være sekvensert av en chip på en høy lese dybde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av General Research Fund (Ref nr. 14162417) fra Hong Kong, National Natural Science Foundation i Kina (Ref nr. 81860272), den store forsknings plan av Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref nr. AB16380219), og Kina postdoktor Science Foundation Grant (Ref nr. 2018M630993) fra Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system		 ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).

Tags

Genetikk neste generasjons sekvensering halvleder sekvensering bibliotek konstruksjon Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) hele Genova forsterkning (WGA) blastocyst
Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, … More

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter