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Behavior

Integrazione di analisi psicofisiche visive all'interno di un Y-Maze per isolare il ruolo che le funzionalità visive svolgono nelle decisioni di navigazione

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59281
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cognitive Ecology & Ecohydraulics Team, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research and Development Center

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per dimostrare un saggio comportamentale che quantifica come le caratteristiche visive alternative, come i segnali di movimento, influenzano le decisioni direzionali nei pesci. I dati rappresentativi sono presentati sulla velocità e la precisione in cui Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas) seguono i movimenti dei pesci virtuali.

Abstract

Il comportamento collettivo degli animali deriva da motivazioni individuali e interazioni sociali che sono fondamentali per la forma fisica individuale. I pesci hanno a lungo ispirato le indagini sul movimento collettivo, in particolare la loro capacità di integrare le informazioni ambientali e sociali in contesti ecologici. In questa dimostrazione vengono illustrate le tecniche utilizzate per quantificare le risposte comportamentali dei pesci, in questo caso Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), agli stimoli visivi utilizzando la visualizzazione del computer e l'analisi delle immagini digitali. I recenti progressi nella visualizzazione dei computer consentono test empirici in laboratorio, in cui le funzionalità visive possono essere controllate e manipolate finemente per isolare i meccanismi delle interazioni sociali. Lo scopo di questo metodo è quello di isolare le caratteristiche visive che possono influenzare le decisioni direzionali dell'individuo, sia solitario che con gruppi. Questo protocollo fornisce specifiche sul dominio fisico del labirinto Y, sulle apparecchiature di registrazione, sulle impostazioni e sulle calibrazioni del proiettore e dell'animazione, sui passi sperimentali e sull'analisi dei dati. Queste tecniche dimostrano che l'animazione al computer può suscitare risposte biologicamente significative. Inoltre, le tecniche sono facilmente adattabili per testare ipotesi alternative, domini e specie per un'ampia gamma di applicazioni sperimentali. L'uso di stimoli virtuali consente la riduzione e la sostituzione del numero di animali vivi necessari, riducendo di conseguenza l'overhead di laboratorio.

Questa dimostrazione mette alla prova l'ipotesi che piccole differenze relative nelle velocità di movimento (2 lunghezze del corpo al secondo) dei conspecifici virtuali miglioreranno la velocità e la precisione con cui gli occhiaie seguono i segnali direzionali forniti dal Siluette. I risultati mostrano che le decisioni direzionali dello shiners sono influenzate in modo significativo dall'aumento della velocità dei segnali visivi, anche in presenza di rumore di fondo (67% coerenza dell'immagine). In assenza di segnali di movimento, i soggetti hanno scelto le loro direzioni a caso. Il rapporto tra velocità decisionale e velocità del segnale era variabile e l'aumento della velocità del cue aveva un'influenza modestamente sproporzionata sulla precisione direzionale.

Introduction

Gli animali percepiscono e interpretano continuamente il loro habitat per prendere decisioni informate quando interagiscono con gli altri e navigano in un ambiente rumoroso. Gli individui possono migliorare la loro consapevolezza situazionale e il processo decisionale integrando le informazioni sociali nelle loro azioni. L'informazione sociale, tuttavia, deriva in gran parte dall'inferenza attraverso segnali involontari (cioè improvvise manovre per evitare un predatore), che possono essere inaffidabili, piuttosto che attraverso segnali diretti che si sono evoluti per comunicare messaggi specifici (ad esempio, il waggle danza nelle api melande)1. Identificare il modo in cui gli individui valutano rapidamente il valore dei segnali sociali, o qualsiasi informazione sensoriale, può essere un compito impegnativo per gli investigatori, in particolare quando gli individui viaggiano in gruppi. La visione svolge un ruoloimportante nel governare le interazioni sociali 2,3,4 e gli studi hanno dedotto le reti di interazione che possono sorgere nelle scuole ittiche in base al campo visivo di ogni individuo5, 6. Le scuole di pesce sono sistemi dinamici, tuttavia, rendendo difficile isolare le risposte individuali a particolari caratteristiche, o comportamenti vicini, a causa delle collineanze intrinseche e dei fattori di confusione che derivano dalle interazioni tra i membri del gruppo. Lo scopo di questo protocollo è quello di integrare il lavoro corrente isolando come caratteristiche visive alternative possono influenzare le decisioni direzionali degli individui che viaggiano da soli o all'interno di gruppi.

Il vantaggio dell'attuale protocollo è quello di combinare un esperimento manipolativo con tecniche di visualizzazione del computer per isolare le caratteristiche visive elementari che un individuo può sperimentare in natura. In particolare, il labirinto Y (Figura 1) viene utilizzato per comprimere la scelta direzionale a una risposta binaria e introdurre immagini animate al computer progettate per imitare i comportamenti di nuoto dei vicini virtuali. Queste immagini sono proiettate da sotto il labirinto per imitare le sagome dei cospecifici che nuotano sotto uno o più soggetti. Le caratteristiche visive di queste sagome, come la loro morfologia, velocità, coerenza e comportamento di nuoto sono facilmente su misura per testare ipotesi alternative7.

Questo documento dimostra l'utilità di questo approccio isolando il modo in cui gli individui di una specie di pesci sociali modello, il Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), rispondono alla velocità relativa dei vicini virtuali. L'obiettivo del protocollo, qui, è se l'influenza direzionale dei vicini virtuali cambi con la loro velocità e, in caso affermativo, quantificare la forma della relazione osservata. In particolare, lo spunto direzionale è generato avendo una proporzione fissa delle sagome agiscono come leader e si muovono balistically verso un braccio o un altro. Le sagome rimanenti agiscono come distrattori muovendosi a caso per fornire un rumore di fondo che può essere regolato regolando il rapporto leader/distrattore. Il rapporto tra capi e distrattori cattura la coerenza dei segnali direzionali e può essere regolato di conseguenza. Le sagome di distrattore rimangono confinate nell'area decisionale ("DA", Figura 1A) facendo in modo che le sagome si riflettano fuori dal contorno. Le sagome leader, tuttavia, sono autorizzate a lasciare la regione DA ed entrare nel braccio designato prima di svanire lentamente una volta che le sagome hanno attraversato 1/3 della lunghezza del braccio. Mentre i leader lasciano il DA, le nuove sagome leader prendono il loro posto e ripercorrono il loro percorso esatto per garantire che il rapporto leader/distrattore rimanga costante nel DA durante l'esperimento.

L'uso del pesce virtuale consente il controllo delle informazioni sensoriali visive, monitorando la risposta direzionale del soggetto, che può rivelare nuove caratteristiche della navigazione sociale, del movimento o del processo decisionale in gruppi. L'approccio qui usato può essere applicato a un'ampia gamma di domande, come gli effetti dello stress subletale o della predazione sulle interazioni sociali, manipolando l'animazione al computer per produrre modelli comportamentali di varia complessità.

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Protocol

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Laboratorio Ambientale, US Army Engineer and Research and Development Center, Vicksburg, MS, USA (IACUC 2013-3284-01).

1. Design del labirinto sensoriale

  1. Condurre l'esperimento in una piattaforma di methacrilio Y-maze in polimetila a tenuta stagna (fatta in-house) posta in cima a una piattaforma di supporto trasparente in una stanza dedicata. Qui la piattaforma è spessa 1,9 cm ed è supportata da 4 fasci da 7,62 cm di alluminio estruso di 1,3 m di larghezza, 1,3 m di lunghezza e 0,19 m di altezza.
  2. Costruire le aree di detenzione e decisione in modo che siano identiche nella costruzione (Figura 1A). Qui, i bracci del labirinto Y sono 46 cm di lunghezza, 23 cm di larghezza e 20 cm di profondità con un'area decisionale centrale di circa 46 cm di diametro.
  3. Aderire bianco proiettamento-through schermo del teatro nella parte inferiore del Y-labirinto per proiettare stimoli visivi nel dominio.
  4. Rivestire i lati del labirinto Y con vinile bianco per limitare gli stimoli visivi esterni.
  5. Installare un cancello chiaro controllato a distanza (tramite un chiaro monofilamento) per dividere l'area di detenzione dall'area decisionale centrale per rilasciare i soggetti nel labirinto dopo l'acclimatamento.
  6. Posizionare tende aggiuntive per impedire al pesce di visualizzare luci, alloggiamento e attrezzature, ad esempio persiane che bloccano la luce che raggiungono il pavimento nei telai delle porte per ridurre al minimo gli effetti di luce e i movimenti delle ombre dalla stanza esterna o dal corridoio.

2. Apparecchiature di registrazione

  1. Selezionare una telecamera in testa (bianco e nero) in base al contrasto necessario tra le immagini di sfondo, il pesce virtuale e il pesce soggetto.
  2. Installare una telecamera in testa per registrare il labirinto dall'alto e per registrare i comportamenti del pesce e le proiezioni visive.
    1. Per questa dimostrazione, utilizzare le telecamere Ethernet gigabyte (GigE) b/w, in modo che i cavi IP da 9 m siano stati collegati a un computer con una scheda Ethernet da 1 Gb in una sala di controllo.
  3. Collegare la fotocamera a un computer in una stanza adiacente dove l'osservatore può controllare a distanza il cancello, il programma di stimoli visivi e il software di registrazione della fotocamera.
  4. Assicurarsi che le impostazioni della fotocamera siano ai campioni e che le frequenze di frequenza evitano eventuali effetti di sfarfallio, che si verificano quando la fotocamera e il software sono fuori fase con le luci della stanza.
    1. Controllare la frequenza elettrica della posizione; scosta la frequenza di campionamento della videocamera (fotogrammi al secondo, fps) per evitare lo sfarfallio moltiplicando o dividendo la frequenza Ca per un numero intero.
  5. Impostare le impostazioni della fotocamera in modo che la chiarezza dell'immagine sia ottimizzata utilizzando il software e il computer per visualizzare i comportamenti pertinenti.
    1. Per questa dimostrazione, eseguire il campionamento a 30 fps con una risoluzione spaziale di 1280 pixel x 1024 pixel.

3. Calibrare l'illuminazione, il proiettore e le impostazioni della fotocamera

  1. Installare quattro sistemi di illuminazione per binari sopraelevati lungo le pareti della stanza sperimentale.
  2. Installare interruttori di controllo regolabili per le luci per fornire una maggiore flessibilità nel raggiungimento della corretta luce ambientale stanza.
  3. Posizionare le luci per evitare riflessi sul labirinto (Figura 1B).
  4. Fissare un proiettore a lancio corto (ST) sul bordo inferiore della struttura di supporto del labirinto (Figura 1C).
    1. Selezionare la risoluzione di proiezione (impostata su 1440 pixel x 900 pixel per questa dimostrazione).
  5. Regolare i livelli di luce ambientale, creati dalle luci aeree e dal proiettore, in modo che corrispondano alle condizioni di illuminazione che si trovano nella stanza dell'alloggiamento dei soggetti (qui impostata a 134 x 5 lux durante l'esperimento dimostrativo, che equivale all'illuminazione naturale in una giornata nuvolosa).
    1. Bloccare o contrassegnare la posizione dell'interruttore dimmer per facilità e coerenza durante le prove sperimentali.
  6. Utilizzare un programma di visualizzazione della fotocamera per configurare le telecamere per controllare la modalità di esposizione, il guadagno e il controllo del bilanciamento del bianco.
    1. In questa dimostrazione, impostare il Visualizzatore di Pilone su "ripresa continua", il tempo di esposizione di 8000 gradi, 0 guadagno e 96 bilanciamento del bianco, che fornisce il controllo della registrazione video.

4. Programma di proiezione visiva calibrata: sfondo

  1. Proietta uno sfondo omogeneo sul fondo del labirinto e misura qualsiasi distorsione della luce dal proiettore. Qui lo sfondo è stato creato utilizzando Processing (v. 3), che è una piattaforma trattabile e ben documentata per creare visualizzazioni personalizzate per progetti scientifici (https://processing.org/examples/).
    1. Creare un programma che eseguirà una finestra di elaborazione da proiettare nella parte inferiore del labirinto. La personalizzazione del colore di sfondo della finestra viene eseguita con il comando di sfondo, che accetta un codice colore RGB. Diversi piccoli programmi di esempio si trovano nelle esercitazioni sull'elaborazione (https://processing.org/tutorials/).
    2. Utilizzare il programma di colore di sfondo per calibrare il proiettore e le condizioni di illuminazione esterna.
  2. Misurare qualsiasi distorsione della luce creata dal proiettore utilizzando un programma di elaborazione delle immagini per identificare eventuali deviazioni dallo sfondo omogeneo previsto creato. I passaggi seguenti si applicano all'uso di ImageJ (v. 1.52h; https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Cattura un'immagine fissa del labirinto Y illuminato con un colore di sfondo uniforme e apriin ImageJ.
    2. Utilizzando lo strumento linea retta, segmentata o a mano libera si disegna una linea verticale retta dalla posizione più luminosa al centro dell'hotspot fino alla parte superiore del labirinto Y (Figura 2A).
    3. Dal menu Analizza, selezionare Profilo di stampa per creare un grafico dei valori della scala di grigi rispetto alla distanza in pixel.
    4. Salva i dati pixel come file separato da virgole (estensione .csv) costituito da una colonna di indice e una colonna con valori in pixel.
  3. Allineare l'area di proiezione con il labirinto (Figura 2B) e modellare qualsiasi distorsione della luce indesiderata per ridurre qualsiasi distorsione del colore che può essere creata dal proiettore (Figura 2C). Di seguito vengono descritti i passaggi eseguiti nella dimostrazione corrente.
    1. Importare il file di dati sull'intensità dei pixel ImageJ utilizzando la funzione di lettura delimitata da tabulazioni appropriata (ad esempio, read_csv dal pacchetto tidyverse da leggere in file separati da virgola).
    2. Calcolare la variabilità nell'intensità della luce lungo il transect del campione, ad esempio con un coefficiente di variazione, per fornire un riferimento di base per il livello di distorsione creato sullo sfondo.
    3. Trasformate i valori dei pixel grezzi per riflettere un cambiamento relativo di intensità dal più luminoso al più piccolo, in cui l'intensità dei pixel più piccola si avvicinerà al valore di colore di sfondo desiderato selezionato nel programma di immagini.
    4. Tracciare i valori di intensità dei pixel di trasformazione a partire dalla parte più luminosa dell'anomalia produce generalmente una tendenza decadente nei valori di intensità in funzione della distanza dalla sorgente. Utilizzare i minimi quadrati non lineari (funzione nls) per stimare i valori dei parametri che meglio si adattano ai dati (in questo caso, una funzione di decadimento gaussiano).
  4. Creare il gradiente del contatore utilizzando lo stesso programma adottato per generare l'immagine del contatore di sfondo (Processing v. 3) per ridurre qualsiasi distorsione del colore che può essere creata dal proiettore utilizzando R (v. 3.5.1).
    NOTA: La funzione sfumatura genererà una serie di cerchi concentrici centrati sul punto più luminoso dell'immagine che cambiano in intensità dei pixel in funzione della distanza dal centro. Il colore di ogni anello viene definito sottraendo la modifica dell'intensità dei pixel prevista dal modello dal colore di sfondo. Di conseguenza, anche il raggio dell'anello aumenta con la distanza dalla sorgente. Il modello di adattamento migliore dovrebbe ridurre, se non eliminare, qualsiasi intensità di pixel nel gradiente per fornire un'uniformità di sfondo.
    1. Creare una sfumatura gaussiana (Equation) utilizzando il programma di stimolo visivo regolando i parametri richiesti.
      1. Parametro influenzare la luminosità / oscurità del gradiente di distribuzione gaussiano. Più alto è il valore, più scuro è il gradiente.
      2. Il parametro b influisce sulla varianza del gradiente. Maggiore è il valore, più ampia sarà la sfumatura prima del livellamento fino all'intensità del pixel di sfondo desiderata, c.
      3. Parametro c Imposta l'intensità del pixel di sfondo desiderata. Maggiore è il valore, più scuro è lo sfondo.
    2. Salvare l'immagine in una cartella utilizzando la funzione saveFrame, in modo che un'immagine di sfondo fissa possa essere caricata durante gli esperimenti per ridurre al minimo il carico di memoria durante il rendering degli stimoli durante una prova sperimentale.
    3. Eseguire nuovamente il programma di generazione in background e controllare visivamente i risultati, come illustrato nella Figura 2C. Ripetere il passaggio 4.3 per quantificare eventuali miglioramenti osservati nel ridurre il grado di variabilità dell'intensità della luce nel transetto del campione.
  5. Regolare empiricamente i livelli di illuminazione, i parametri del modello o la distanza coperta nel transetto (ad esempio, il raggio esterno del gradiente del contatore) per effettuare eventuali regolazioni manuali aggiuntive fino a quando i valori RGB della zona di acclimatazione sono simili all'area decisionale. I parametri del modello in questo test sono stati: a 215, b , 800 e c .
  6. Aggiungere il filtro finale al programma di stimoli visivi dell'esperimento.

5. Programma di proiezione visiva calibrata: stimoli visivi

NOTA: il rendering e l'animazione degli stimoli visivi possono essere eseguiti anche in Processing usando i passaggi riportati di seguito come guide insieme alle esercitazioni della piattaforma. Uno schema della logica del programma corrente è disponibile in (Figura 3) e ulteriori dettagli possono essere trovati in Lemasson et al. (2018)7. I passaggi seguenti forniscono esempi delle fasi di calibrazione eseguite nell'esperimento corrente.

  1. Aprire il programma di proiezione visiva Vfish.pde per centrare la proiezione all'interno dell'area decisionale del labirinto (Figura 1A) e calibrare le proiezioni visive in base alle ipotesi testate (ad esempio, calibrare le dimensioni e le velocità delle sagome in modo che corrispondano quelli dei soggetti del test). Le tarature sono sintonizzate a mano nell'intestazione del programma principale (Vfish.pde) utilizzando flag di debug preselezionati. In modalità di debug (DEBUG : TRUE) eseguire in sequenza ogni flag DEBUGGING_LEVEL_' (numeri 0-2) per apportare le modifiche necessarie
    1. Impostate il flag DEBUGGING_LEVEL_0 su "true" ed eseguite il programma premendo l'icona di riproduzione nella finestra di schizzo. Modificare i valori di posizione x e y (rispettivamente i parametri di dominio dx e dy) fino a quando la proiezione non viene centrata.
    2. Impostate DEBUGGING_LEVEL_1 su "true" per ridimensionare le dimensioni della sagoma del pesce (renderizzata come ellisse). Eseguire il programma e regolare in modo iterativo la larghezza (eW) e la lunghezza (eL) dell'ellisse fino a quando non corrisponde alla dimensione media dei soggetti del test. Successivamente, impostare DEBUGGING_LEVEL_2 su "true" per regolare la velocità della linea di base delle ss.
    3. Impostare DEBUG : FALSE per uscire dalla modalità di debug.
  2. Verificare che le sagome di distrazione rimangano delimitate all'area delle decisioni (DA, Figura 1A), che le traiettorie della silhouette del leader siano allineate correttamente con entrambi i bracci e che il rapporto leader/distrattore all'interno del DA rimanga costante.
  3. Eseguire la GUI del programma per garantire la funzionalità delle opzioni.
  4. Verificare che i dati vengano scritti correttamente su file.
  5. Assicurarsi che il software di registrazione possa tracciare il pesce soggetto con proiezioni visive in posizione. Passi per rintracciare i pesci sono stati precedentemente descritti in Kaidanovich-Berlin et al. (2011)8, Holcomb et al. (2014)9, Way et al. (2016)10 e .hang et al. (2018)11.

6. Preparazione degli animali

  1. Scegli le specie tematiche in base alla domanda di ricerca e all'applicazione, tra cui sesso, età, genotipo. Assegnare i soggetti ai serbatoi sperimentali e registrare le statistiche biometriche di base (ad esempio, la lunghezza del corpo e la massa).
  2. Impostare le condizioni ambientali nel labirinto a quella del sistema di tenuta. Le condizioni di qualità dell'acqua per gli esperimenti di base di comportamento sono spesso ritenute ottimali per la specie e per la configurazione del dominio sperimentale.
    1. In questa dimostrazione, utilizzare le seguenti condizioni: ciclo scuro di 12 h di luce/12 h, luci alogenie senza sfarfallio impostate su 134 x 5 lux, 22 x 0,3 gradi centigradi, 97,4 x ossigeno disciolto e pH di 7,8 x 0,1.
  3. Abituare gli animali trasferendoli nel dominio per un massimo di 30 min al giorno per 5 giorni senza gli stimoli visivi generati al computer (ad esempio, sagome di pesce) prima dell'inizio delle prove sperimentali.
  4. Assicurarsi che il pesce soggetto in quel momento sia selezionato, assegnato, pesato, misurato e trasferito in vasche sperimentali.
    NOTA: Qui, la lunghezza standard di Golden Shiners e il peso bagnato erano rispettivamente 63,4 x 3,5 mm SL e 1,8 , 0,3 g WW.
  5. Utilizzare un trasferimento acqua-acqua quando si spostano i pesci tra le vasche e il labirinto per ridurre lo stress dovuto alla movimentazione e all'esposizione all'aria.
  6. Condurre esperimenti durante un ciclo di luce regolare e fisso che riflette il ritmo biologico naturale dei soggetti. Questo permette ai soggetti di essere nutriti alla fine delle prove sperimentali di ogni giorno per limitare gli effetti di digestione sul comportamento.

7. Procedura sperimentale

  1. Accendere il proiettore della stanza e i sistemi di binari a LED a un livello di luminosità predeterminato (in questa dimostrazione 134 x 5 lux) permettendo alle lampadine di riscaldarsi (circa 10 minuti).
  2. Aprire il programma di visualizzazione della fotocamera e caricare le impostazioni per l'apertura, il colore e la registrazione salvati dalla configurazione per garantire che sia possibile ottenere video di migliore qualità.
    1. Aprire Pylon Viewer e attivare la fotocamera da utilizzare per la registrazione.
    2. Selezionare Carica funzioni dal menu a discesa della fotocamera e passare alla cartella delle impostazioni della fotocamera salvata.
    3. Aprire le impostazioni salvate (qui etichettato come camerasettings_20181001) per garantire la qualità video e fare clic su ripresa continua.
    4. Chiudere Visualizzatore piloni.
  3. Aprire il programma di proiezione visiva Vfish.pde e verificare che la proiezione rimanga centrata nel labirinto, che la cartella DataOut sia vuota e che il programma funzioni come previsto
    1. Verificare che l'anello di calibrazione sia centrato nel DA utilizzando il passaggio 5.1.1.
    2. Aprire la cartella DataOut per assicurarsi che sia vuota per il giorno.
    3. Eseguire il programma di stimoli visivi premendo play nella finestra di schizzo di Vfish.pde e utilizzare variabili fittizie per garantire la funzionalità del programma.
      1. Immettere il numero ID pesce (1-16), premere INVIO, quindi confermare la selezione premendo Y o N per sì o no.
      2. Immettere la dimensione del gruppo (fissa qui a 1) e confermare la selezione.
      3. Immettere la velocità di silhouette desiderata (0-10 BL/s) e confermare la selezione.
      4. Premere Invio per superare il periodo di acclimatazione e controllare la proiezione del pesce virtuale nell'area decisionale.
      5. Premere Pausa per mettere in pausa il programma e immettere la scelta del risultato fittizio, ovvero a sinistra (1) o a destra (2).
      6. Premere Stop per terminare il programma e scrivere i dati su file.
    4. Verificare che i dati siano stati scritti correttamente nel file nella cartella DataOut e registrare il file come esecuzione dei test nelle note del lab prima che i pesci vengano inseriti nel dominio per l'acclimatamento.
  4. Utilizzare l'ora dell'orologio e un cronometro per registrare gli orari di inizio e di fine della prova nel notebook lab per completare i tempi trascorsi che possono essere estratti successivamente dalla riproduzione video a causa della breve durata di alcune prove di replica.
  5. Condurre un cambio di acqua (ad es. 30%) utilizzando il sistema di tenuta acqua di tenuta prima di trasferire un soggetto al labirinto.
  6. Verificare che la qualità dell'acqua sia simile tra il labirinto e il sistema di tenuta, e controllare il funzionamento del cancello per assicurarsi che scivoli senza problemi appena sopra l'altezza dell'acqua.
  7. Utilizzando il programma sperimentale predeterminato, che ha randomizzato le esposizioni al trattamento del soggetto nel corso dell'esperimento, immettere i valori selezionati per lo studio corrente (fermandosi nella schermata di acclimatazione, passaggi 7.3.3.1 - 7.3.3.3).
    1. Registrare i dati della combinazione di trattamento nel notebook del laboratorio.
  8. Trasferire il soggetto nell'area di attesa del labirinto Y per un periodo di acclimatazione di 10 minuti.
  9. Avviare la registrazione video, quindi premere il tasto Invio nella finestra Vfish.pde alla fine del periodo di acclimatazione. In questo modo verranno avviate le proiezioni visive.
  10. Quando il pesce virtuale viene visualizzato nel dominio, registrare l'ora dell'orologio e sollevare il gate di mantenimento (Figura 4A).
  11. Terminare la prova quando il 50% del corpo del soggetto si sposta in un braccio di scelta (Figura 4B) o quando il periodo di tempo designato trascorre (ad esempio, 5 min).
    1. Registrare l'ora dell'orologio, gli orari di inizio e di fine dal cronometro e la scelta dei soggetti (ad esempio, a sinistra (1), a destra (2) o senza scelta(0)).
    2. Interrompere la registrazione video e premere Pausa nel programma di stimoli visivi, che richiederà all'utente i dati dei risultati della prova (il numero di braccio selezionato o uno 0 per indicare che non è stata fatta alcuna scelta). Dopo aver confermato la selezione, il programma tornerà alla prima schermata e attenderà i valori attesi per la prossima prova sperimentale.
  12. Raccogliere il soggetto e restituirlo al rispettivo serbatoio di contenimento. Ripetere i passaggi 7.7-7.13 per ogni versione di valutazione.
  13. Al termine di una sessione (AM o PM) premere Stop nel programma una volta che l'ultimo pesce della sessione ha preso una decisione. Premendo Stop i dati della sessione verranno scritti nel file.
  14. Ripetere lo scambio di acqua al termine della sessione mattutina per garantire la stabilità della qualità dell'acqua.
  15. Dopo l'ultima prova della giornata, esaminare il blocco appunti del lab e prendere le note necessarie.
    1. Premere Stop nel programma di stimoli visivi per restituire i dati raccolti nella cartella DataOut, dopo l'ultima prova del giorno.
  16. Verificare il numero, il nome e la posizione dei file di dati salvati dal programma di visualizzazione.
  17. Registrare la qualità dell'acqua, insieme ai livelli di luce nella stanza del labirinto per confrontare con le impostazioni del mattino. Inserire il sistema di aerazione e riscaldatori nel labirinto Y.
  18. Spegnere l'illuminazione di tracciamento del proiettore e della stanza sperimentale.
  19. Nutrire il pesce la razione giornaliera predeterminata.

8. Analisi dei dati

  1. Assicurarsi che i dati sperimentali contengano le variabili necessarie (ad esempio, data, prova, ID soggetto, braccio selezionato dal programma, fattori visivi testati, scelta del soggetto, orari di inizio e arresto e commenti).
  2. Verificare la presenza di eventuali errori di registrazione (indotti dall'uomo o dal programma).
  3. Tabulazione le risposte e verificare la presenza di segni di pregiudizi direzionali da parte dei soggetti (ad esempio, test binomiale sulla scelta del braccio nella condizione di controllo)7.
  4. Quando l'esperimento è progettato utilizzando misurazioni ripetute sugli stessi individui, come nel caso in questo caso, viene suggerito l'uso di modelli di effetti misti.

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Representative Results

Ipotesi e design

Per dimostrare l'utilità di questo sistema sperimentale abbiamo testato l'ipotesi che la precisione con cui Golden Shiner seguirà un segnale visivo migliorerà con la velocità di quel segnale. Sono stati utilizzati il tipo selvaggio Golden Shiner (N- 16, lunghezze del corpo, BL, e pesi bagnati, WW, erano 63,4 x 3,5 mm e 1,8 - 0,3 g, rispettosamente). La coerenza degli stimoli visivi (rapporto leader/distrattore) è stata fissata a 0,67, mentre abbiamo manipolato la velocità con cui i nostri segnali di movimento (cioè i leader) si muovevano rispetto ai loro distrattori. I livelli di velocità delle sagome leader che forniscono i segnali direzionali variavano da 0-10 BL/s (in incrementi di 2), che copre la gamma di velocità tipicamente considerate per riflettere le modalità di nuoto sostenute, prolungate o scoppiate nel pesce12. A livello di controllo, 0, le sagome del leader erano orientate verso un braccio di destinazione tra i distrattori orientati in modo casuale, ma nessuna delle sagome si è spostata. Il braccio di destinazione è stato scelto a caso per ogni prova dal programma. Le unità di distanza sono in lunghezza del corpo, che è stato definito dalla lunghezza media standard dei nostri soggetti, e il tempo è in secondi. L'attuale analisi rappresentativa si concentra sulla misurazione delle variabili di risposta primarie (velocità e precisione delle decisioni), ma la progettazione dell'esperimento consente inoltre ai ricercatori di estrarre informazioni aggiunte monitorando i movimenti dei soggetti e analizzando ne Cinematica.

I nostri soggetti di pesce sono stati ospitati seguendo la sezione 6 del protocollo. Ogni soggetto è stato esposto a un livello del trattamento al giorno. Abbiamo randomizzato sia all'interno del livello di trattamento del soggetto (velocità cue) nei giorni che nell'ordine in cui i soggetti sono stati testati ogni giorno. Sono stati utilizzati modelli di effetti misti linearizzati lineari e generalizzati (rispettivamente LMM e GLMM) per testare gli effetti della velocità della silhouette leader sulla velocità e la precisione con cui i soggetti hanno seguito gli stimoli visivi. L'ID soggetto è stato incluso come effetto casuale in entrambi i modelli.

Dati e risultati

In assenza di segnali di movimento, Golden Shiner agì come previsto e scelse la loro direzione a caso (velocità di stimolo - 0, test binomiale, nSinistra, 33, nDestra, 40, 0,45, P , 0,483). Mentre la maggior parte dei soggetti non mostrava segni di comportamento stressante all'interno del dominio e prendeva una decisione decisiva entro il tempo assegnato (5 min), il 22% dei soggetti mostrava una riluttanza a lasciare l'area di detenzione o a entrare nell'area decisionale. I dati di questi pesci indecisi non sono stati inclusi nell'analisi. Il restante 78% dei nostri soggetti ha mostrato un miglioramento significativo nella precisione con cui hanno seguito gli stimoli direzionali con l'aumento della velocità di tali stimoli (GLMM, z : 1,937, P - 0,053). Figura 5A mostra la natura di questa relazione, dove troviamo un aumento di 1,2 volte nella precisione direzionale per ogni aumento del livello di velocità di stimolo. Questo rapporto è solo modestamente sproporzionato e non è, di per sé, indicativo di una risposta soglia ai cambiamenti della velocità del cue. L'aumento della velocità di stimolo ha portato anche ad un aumento significativo della velocità decisionale (LMM, F1,56, 4,774, P , 0,033). Tuttavia, come evidente nella Figura 5B, l'andamento della velocità decisionale era incoerente e altamente variabile tra i livelli di velocità di stimolo. Ciò che è evidente in questi dati sulla velocità delle decisioni è che ha preso soggetti, in media, da 5-20x in più per prendere la loro decisione quando gli stimoli si muovevano rispetto a quando non lo erano (velocità decisionali di 4,6 - 2,3 s e 81,4 - 74,7 s per stimoli velocità di 0 e 8, rispettivamente, - deviazione standard, SD). Infatti, senza il livello di controllo non abbiamo riscontrato alcun cambiamento significativo nella velocità delle decisioni in funzione della velocità di stimolo.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. dominio Y-Maze. R. Immagine dell'apparato Y-labirinto per il test decisionale. Le annotazioni rappresentano quanto segue: Area di detenzione (HA, verde), Area decisionale (DA, blu), Braccio decisionale sinistro (LDA) e Braccio decisionale destro (RDA). B. Immagine del labirinto Y e della stanza con illuminazione della pista regolabile in alto e posizionamento della fotocamera GigE (solo una delle quattro strisce luminose sono visibili). C. Immagine del labirinto Y (vista laterale) compreso il posizionamento del proiettore che è bloccato dal carrello scorrevole per eliminare i movimenti durante o tra le prove. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Calibrazione dello sfondo e dello stimolo. A. Immagine del labirinto Y illuminato con un colore di sfondo uniforme e un transect di intensità di pixel (linea verde) tra l'area di detenzione e l'area decisionale, DA (intensità media dei pixel 112 - 1278). Il gradiente di luce generato dalla lampadina del proiettore (hotspot) è chiaramente visibile. B. Immagine che mostra l'allineamento delle proiezioni con il DA. C. Immagine del labirinto con lo sfondo filtrato e una silhouette solitaria proiettata al centro del DA per la calibrazione (dimensione, velocità). L'aggiunta dello sfondo del gradiente del contatore in (C) determina uno sfondo più scuro (intensità media dei pixel 143,1 x 5,5) e una variabilità spaziale molto inferiore (coefficiente di variazione scende da 11,4 (A.) a 0,03 (C.). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Schematica del flusso generale di operazioni nel programma di visualizzazione utilizzato negli esperimenti. Per ulteriori dettagli procedurali si veda7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
come illustrato nella Figura 4. Prova sperimentale con sagome di pesce reali e virtuali. A. Immagine di un (live) Golden Shiner che lascia l'area di detenzione (cerchio verde). B. Immagine di un Golden Shiner (dal vivo) nell'area decisionale (cerchio verde) tra le sagome di pesce virtuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
come illustrato nella Figura 5. Precisione e velocità delle risposte direzionali alle modifiche nella velocità relativa dei segnali di movimento. A. Grafico della precisione della decisione del pesce con cui Golden Shiner ha seguito le sagome "leader" tracciate contro la velocità di stimolo (BL/s). B. Grafico della velocità di decisione del pesce tracciata rispetto alla velocità di stimolo (BL/s). I dati sono significati - errori standard, SE. Gruppi di 15 sagome virtuali sono stati distribuiti in modo casuale in tutta la zona decisionale con un 67% di coerenza (10 delle 15 sagome hanno agito come leader, le restanti 5 sagome hanno agito come distrattori) e abbiamo variato il velocità dei leader da 0 a 10 BL/s. La velocità del distratto è rimasta fissa a 1 BL/s a tutti i livelli di velocità, ad eccezione del controllo in cui nessuna delle sagome si muoveva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

È noto che i segnali visivi attivano una risposta optomotoria nei pesci esposti a grate in bianco e nero13 e vi sono sempre più prove teoriche ed empiriche che la velocità del vicino svolge un ruolo influente nel governare le interazioni dinamiche osservati nelle scuole ittiche7,14,15,16,17. Esistono ipotesi contrastanti per spiegare come gli individui in gruppi integrano i movimenti dei vicini, come reagire proporzionalmente a tutti i segnali distinguibili14, adottando una risposta di soglia di movimento17o monitorare i tempi di collisione 18. Un primo passo nella sperimentazione di queste ipotesi alternative sta convalidando le loro ipotesi sottostanti. Qui abbiamo dimostrato l'utilità del nostro protocollo nell'identificare il ruolo che una particolare caratteristica sensoriale può avere sulla guida delle decisioni direzionali.

Abbiamo isolato il modo in cui gli individui di una specie di pesce sociale, il Golden Shiner, hanno risposto ai cambiamenti nella velocità relativa degli stimoli visivi progettati per imitare i conspecifici in una scuola. La precisione direzionale di Golden Shiner ha migliorato con l'aumento della velocità relativa degli stimoli visivi, ma la relazione funzionale tra queste variabili era solo marginalmente sproporzionata. Il rapporto tra velocità decisionale e velocità di stimolo, sebbene significativa, era altamente variabile e incoerente. I risultati dimostrano, tuttavia, che una differenza di velocità trovata nelle immagini sparse in tutto il campo visivo di questi pesci gioca un ruolo importante nell'innescare una risposta e guidare la loro attenzione overt. Il modo in cui gli individui selezionano tra le azioni di vicini specifici potrebbero essere sondati con il progetto attuale introducendo direzioni contrastanti negli stimoli.

In un recente esperimento con il pesce zebra, Danio rerio, non abbiamo trovato alcuna prova di indecisione nelle prove solitarie7, ma Golden Shiner in questa dimostrazione ha mostrato una maggiore riluttanza a lasciare l'area di detenzione. Le differenze tra queste due specie possono essere spiegate dalle loro strategie di storia della vita e dalla forza relativa delle loro tendenze sociali (o dipendenza). Il pesce zebra sembra mostrare una coerenza sociale più variabile rispetto agli Shiners d'oro (ad esempio, docenti contro studenti obbligati3). È probabile che la coerenza sociale più forte in Golden Shiner possa aver contribuito a soggetti che mostrano livelli più elevati di timidezza, o esitazione all'interno del dominio rispetto alle loro controparti di pesce zebra.

L'ordine dei passaggi è sottile ma critico nel protocollo. Il processo di bilanciamento delle luci, del proiettore e del filtro del programma può richiedere più tempo del previsto per i nuovi domini. In questo protocollo, sono state incluse lezioni apprese per ridurre la configurazione e il tempo di bilanciamento della luce, ad esempio l'uso di luci di pista che si riflettono fuori dalla parete (non sul dominio), controller di luce regolabili e filtri generati dal programma per il proiettore. Si consideri anche che ciò che può sembrare visivamente accettabile per l'occhio umano non sarà visto dalla fotocamera e dal software allo stesso modo, quindi le condizioni di illuminazione possono richiedere ulteriori regolazioni. Anche lievi cambiamenti negli angoli del monitor comporteranno cambiamenti di gradiente di sfondo. Pertanto, l'assunzione di note dettagliate e il salvataggio delle impostazioni dei file ridurranno notevolmente la probabilità che si verifichino modifiche durante l'esperimento. Passare attraverso il processo dal filtraggio fisico al filtraggio, come illustrato qui, produce i passi più veloci al successo.

L'uso di un proiettore ST consente una maggiore flessibilità spaziale su un monitor, ma questo approccio crea un'anomalia visiva indesiderata chiamata "hotspot". Un punto caldo è un punto luminoso sulla superficie di proiezione creato dalla vicinanza della lampadina del proiettore. Nel protocollo, la Sezione 4 è stata dedicata alla creazione di filtri in background e al controllo dei fulmini omogenei in tutto il dominio. I passaggi forniti qui aiuteranno gli utenti a evitare o ridurre al minimo gli effetti indesiderati dell'hotspot modellando qualsiasi gradiente indesiderato e utilizzando il modello per riprodurre un gradiente inverso per contrastare gli effetti. Infine, il modello del proiettore ST può variare, tuttavia, le regolazioni dell'immagine (rotazione, capovolgimento, proiezione dello schermo anteriore o posteriore) e la correzione delle chiavi di volta (3-5 gradi) sono caratteristiche utili per garantire che l'immagine desiderata si adatti al dominio e possa essere regolata per la distorsione.

Nel corso del tempo, le stanze sperimentali sono state aggiornate per facilitare i cambiamenti nell'hardware (ad esempio, telecamere, cablaggio, schede video, monitor). È interessante notare che le modifiche hardware probabilmente si tradurranno in tempi di avvio aggiuntivi per bilanciare l'illuminazione e lavorare attraverso eventuali problemi del programma. Pertanto, si consiglia di dedicare qualsiasi hardware a un sistema fino al completamento degli esperimenti desiderati. La maggior parte delle sfide sono state legate alle differenze di prestazioni tra monitor, schede video e telecamere con conseguente alterazione del codice di programmazione. Dal momento di questo lavoro, sono stati sviluppati nuovi domini in cui il dominio di test interno può essere rimosso e commutato per altri domini di test. Per la progettazione dei domini sperimentali e delle strutture di supporto, è consigliabile considerare questa flessibilità.

Il protocollo attuale consente ai ricercatori di isolare e manipolare le caratteristiche visive in modo che riflettano entrambi l'ambiente visivo previsto all'interno di una scuola, controllando allo stesso tempo i fattori di confusione che accompagnano l'esposizione a conspecifici reali (ad esempio , fame, familiarità, aggressività)7. In generale, l'animazione al computer (CA) del pesce virtuale (cioè le sagome) è una pratica che sta diventando un luogo sempre più comune grazie ai suoi vantaggi distinti nello stimolare le risposte comportamentali19,20,21. CA permette di personalizzare i segnali visivi (direzione, velocità, coerenza o morfologia), introducendo un livello di standardizzazione e ripetibilità nello stimolo desiderato che supera quello che si può ottenere quando si utilizzano animali vivi come stimolante. Anche l'uso della realtà virtuale negli studi comportamentali, sia su22 che su umani23,è in costante aumento e promette di diventare un potente strumento empirico man mano che la tecnologia diventa più disponibile e trattabile. Nel loro insieme, questi approcci virtuali sostituiscono e riducono anche i requisiti animali vivi dell'etica animale nella scienza (ad esempio, IACUC, AAALAC e ACURO)24, riducendo conditabilmente i costi e gli oneri di laboratorio.

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Disclosures

Tutti gli autori hanno contribuito alla progettazione sperimentale, all'analisi e alla stesura dell'articolo. A.C.U. e C.M.W. setup e raccolti i dati. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Bryton Hixson per l'assistenza all'installazione. Questo programma è stato sostenuto dal Basic Research Program, Environmental Quality and Installations (EQI; Dr. Elizabeth Ferguson, Direttore Tecnico), US Army Engineer Research and Development Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black and white IP camera Noldus, Leesburg, VA, USA https://www.noldus.com/
Extruded aluminum 80/20 Inc., Columbia City, IN, USA 3030-S https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners Saul Minnow Farm, AR, USA http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware National Institute for Health (NIH), USA https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA BR20MW-M4 https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl 651Vinyl, Louisville, KY, USA 651-010M-12:5ft http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector Epson, Long Beach CA, USA V11H605020 https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware Processing Foundation https://processing.org/
R (3.5.1) freeware The R Project for Statistical Computing https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA 1950 https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.

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References

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Woodley, C. M., Urbanczyk, A. C., Smith, D. L., Lemasson, B. H. Integrating Visual Psychophysical Assays within a Y-Maze to Isolate the Role that Visual Features Play in Navigational Decisions. J. Vis. Exp. (147), e59281, doi:10.3791/59281 (2019).

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