Integrando ensaios psicofísicos visuais dentro de um labirinto Y para isolar a função que os recursos visuais desempenham em decisões de navegação

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para demonstrar um ensaio comportamental que quantifica como as características visuais alternativas, como as pistas de movimento, influenciam as decisões direcionais em peixes. Os dados representativos são apresentados na velocidade e na exatidão onde Shiner dourado (crysoleucas de Notemigonus) siga movimentos virtuais dos peixes.

Abstract

O comportamento animal coletivo surge de motivações individuais e interações sociais que são críticas para a aptidão individual. Os peixes têm inspirado por muito tempo investigações no movimento coletivo, especificamente, sua habilidade de integrar a informação ambiental e social através dos contextos ecológicos. Esta demonstração ilustra técnicas utilizadas para quantificar as respostas comportamentais dos peixes, neste caso, o Shiner dourado (Notemigonus crysoleucas), a estímulos visuais usando visualização computacional e análise de imagem digital. Os avanços recentes na visualização de computador permitem o teste empírico no laboratório onde as características visuais podem ser controladas e manipuladas finamente para isolar os mecanismos de interações sociais. A finalidade deste método é isolar as características visuais que podem influenciar as decisões direcionais do indivíduo, se solitário ou com grupos. Este protocolo fornece especificidades sobre o domínio do labirinto Y físico, equipamento de gravação, configurações e calibrações do projetor e animação, etapas experimentais e análises de dados. Essas técnicas demonstram que a animação de computador pode provocar respostas biologicamente significativas. Além disso, as técnicas são facilmente adaptáveis para testar hipóteses, domínios e espécies alternativas para uma ampla gama de aplicações experimentais. O uso de estímulos virtuais permite a redução e substituição do número de animais vivos necessários e, consequentemente, reduz a sobrecarga laboratorial.

Esta demonstração testa a hipótese de que pequenas diferenças relativas nas velocidades de movimento (2 comprimentos de corpo por segundo) de conespecificidades virtuais melhorarão a velocidade e a exatidão com que os Shiners seguem as indicações direcionais fornecidas pelo virtual Silhuetas. Os resultados mostram que as decisões direcionais dos Shiners são afetadas significativamente pelos aumentos na velocidade das indicações visuais, mesmo na presença do ruído de fundo (67% da coerência da imagem). Na ausência de quaisquer pistas de movimento, os sujeitos escolheram suas direções aleatoriamente. A relação entre velocidade de decisão e velocidade de sinalização foi variável e o aumento da velocidade de sinalização teve uma influência modestamente desproporcionada na precisão direcional.

Introduction

Os animais sentem e interpretam seu habitat continuamente para tomar decisões informadas quando interagem com outros e navegam em ambientes barulhentos. Os indivíduos podem melhorar sua consciência situacional e tomada de decisão integrando a informação social em suas ações. A informação social, no entanto, decorre em grande parte da inferência através de pistas não intencionais (ou seja, manobras súbitas para evitar um predador), que pode ser confiável, em vez de através de sinais diretos que evoluíram para comunicar mensagens específicas (por exemplo, o waggle dança em abelhas do mel)¹. Identificar como os indivíduos avaliam rapidamente o valor das pistas sociais, ou qualquer informação sensorial, pode ser uma tarefa desafiadora para os investigadores, particularmente quando os indivíduos estão viajando em grupos. A visão desempenha um papel importante no governo das interações^2,3,4 e os estudos têm inferido as redes de interação que podem surgir em escolas de peixes com base no campo de visão de cada indivíduo^5, a ⁶. As escolas de peixe são sistemas dinâmicos, no entanto, dificultando a isolar as respostas individuais a determinadas características, ou comportamentos vizinhos, devido às collinearidades inerentes e fatores de confusão que surgem a partir das interações entre os membros do grupo. A finalidade deste protocolo é complementar o trabalho atual isolando como as características visuais alternativas podem influenciar as decisões direcionais dos indivíduos que viajam sozinho ou dentro dos grupos.

O benefício do protocolo atual é combinar um experimento manipulativo com técnicas de visualização de computador para isolar os recursos visuais elementares que um indivíduo pode vivenciar na natureza. Especificamente, o labirinto Y (Figura 1) é usado para recolher a escolha direcional para uma resposta binária e introduzir imagens animadas de computador projetadas para imitar os comportamentos de natação de vizinhos virtuais. Estas imagens são projetadas acima de abaixo do labirinto para imitar as silhuetas dos conespecificidades que nadam abaixo de um ou mais assuntos. As características visuais dessas silhuetas, como sua morfologia, velocidade, coerência e comportamento de natação, são facilmente adaptadas para testar hipóteses alternativas⁷.

Este artigo demonstra a utilidade desta aproximação isolando como os indivíduos de uma espécie social modelo dos peixes, o Shiner dourado (crysoleucas de Notemigonus), respondem à velocidade relativa de vizinhos virtuais. O foco do protocolo, aqui, é sobre se a influência direcional dos vizinhos virtuais mudam com sua velocidade e, em caso afirmativo, quantificando a forma da relação observada. Em particular, a sinalização direcional é gerada por ter uma proporção fixa das silhuetas atuar como líderes e mover-se balístico para um braço ou outro. As silhuetas restantes actuam como distratores movendo-se aproximadamente aleatoriamente para fornecer o ruído de fundo que pode ser ajustado ajustando a relação do líder/Distractor. A proporção de líderes para distratores capta a coerência das pistas direcionais e pode ser ajustada de acordo. As silhuetas do Distractor permanecem confinadas à área da decisão ("DA", Figura 1a) fazendo com que as silhuetas reflitam fora do limite. As silhuetas do líder, entretanto, são permitidas deixar a região do DA e incorporar seu braço designado antes de desvanecer-se lentamente afastado uma vez que as silhuetas atravessadas 1/3 o comprimento do braço. Como líderes deixam o promotor, novas silhuetas de líder tomam seu lugar e refazer seu caminho exato para garantir que a relação líder/Distractor permanece constante no DA durante todo o experimento.

O uso de peixes virtuais permite o controle da informação sensorial visual, enquanto monitora a resposta direcional do sujeito, o que pode revelar novas características de navegação social, movimento ou tomada de decisão em grupos. A abordagem aqui utilizada pode ser aplicada a uma ampla gama de questões, como efeitos de estresse subletal ou predação em interações sociais, manipulando a animação computacional para produzir padrões comportamentais de complexidade variável.

Protocol

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do laboratório ambiental, engenheiro do exército dos EUA e centro de pesquisa e desenvolvimento, Vicksburg, MS, EUA (IACUC # 2013-3284-01).

1. projeto sensorial do labirinto

1. Conduza o experimento em uma plataforma de metacrilato de metilo poli à prova d' água (feita em casa) situada no topo de uma plataforma de suporte transparente em uma sala dedicada. Aqui a plataforma é de 1,9 cm de espessura e é apoiada por 4 7,62 cm vigas de alumínio extrudido que é de 1,3 m de largura, 1,3 m de comprimento, e 0,19 m de altura.
2. Construir as áreas de detenção e de decisão para serem idênticas na construção (Figura 1a). Aqui, os braços do Y-labirinto são 46 cm do comprimento, 23 cm na largura, e 20 cm na profundidade com uma área central da decisão aproximadamente 46 cm no diâmetro.
3. Aderir projeto branco-através de tela de teatro na parte inferior do labirinto Y para projetar estímulos visuais para o domínio.
4. Cubra os lados do labirinto Y com vinil branco para limitar os estímulos visuais externos.
5. Instale uma porta desobstruída remotamente controlada (através do monofilamento desobstruído) para particionar a área da terra arrendada da área central da decisão para liberar assuntos no labirinto após o ACCLIMATION.
6. Coloc cortinas adicionais para impedir que os peixes visualizem luzes, carcaça, e equipamento, tais como as cortinas da luz-obstrução que alcangam o assoalho em frames de porta para minimizar efeitos claros e movimentos da sombra da sala ou do corredor externo.

2. equipamento de gravação

1. Selecione uma câmera aérea (preto e branco) com base no contraste necessário entre as imagens de fundo, peixes virtuais e peixes de assunto.
2. Instale uma câmera aérea para gravar o labirinto de cima e para registrar os comportamentos do peixe e as projeções visuais.
   1. Para esta demonstração, use as câmeras b/w Gigabyte Ethernet (GigE), de modo que os cabos IP de 9 m foram anexados a um computador com uma placa Ethernet de 1 GB em uma sala de controle.
3. Conecte a câmera a um computador em uma sala adjacente onde o observador possa controlar remotamente o portão, o programa de estímulos visuais e o software de gravação da câmera.
4. Assegure-se de que as configurações da câmera estejam na amostragem e nas taxas de frequência que impedem quaisquer efeitos de cintilação, que ocorrem quando a câmera e o software estão fora de fase com as luzes do ambiente.
   1. Verifique a frequência eléctrica da localização; compensar a taxa de amostragem da câmera (frames por segundo, FPS) para evitar cintilação multiplicando ou dividindo a frequência AC por um número inteiro.
5. Defina as configurações da câmera para que a nitidez da imagem seja otimizada usando o software e o computador para visualizar os comportamentos relevantes.
   1. Para esta demonstração, realize amostragem a 30 fps com uma resolução espacial de 1280 pixels x 1024 pixels.

3. calibrar as configurações de iluminação, projetor e câmera

1. Instale quatro sistemas de iluminação da trilha aérea ao longo das paredes da sala experimental.
2. Instale interruptores de controle ajustáveis para que as luzes forneçam a maior flexibilidade em conseguir a luz ambiental do quarto correto.
3. Posicione as luzes para evitar reflexões sobre o labirinto (Figura 1b).
4. Fixe um projetor de arremesso curto (ST) na borda inferior da estrutura de suporte do labirinto (Figura 1C).
   1. Selecione a resolução de projeção (definida como 1440 pixels x 900 pixels para esta demonstração).
5. Ajuste os níveis de luz ambiente, criados pelas luzes de sobrecarga e projetor, para coincidir com as condições de iluminação encontradas na sala de habitação dos sujeitos (aqui definido para 134 ± 5 Lux durante o experimento de demonstração, que é equivalente à iluminação natural em um dia nublado).
   1. Trave ou marque a posição do interruptor dimmer para a facilidade e a consistência durante experimentações experimentais.
6. Use um programa de visualizador de câmera para configurar a câmera (s) para controlar o modo de exposição, ganho e controle de equilíbrio de branco.
   1. Nesta demonstração, defina o Visualizador de Pylon para "disparo contínuo", 8000 μs tempo de exposição, 0 ganho, e 96 balanço de branco, que fornece o controle da gravação de vídeo.

4. calibrar programa de projeção Visual: fundo

1. Projete um fundo homogêneo na parte inferior do labirinto e meça qualquer distorção de luz do projetor. Aqui, o plano de fundo foi criado usando Processing (v. 3), que é uma plataforma tratável e bem documentada para criar visualizações personalizadas para projetos científicos (https://Processing.org/examples/).
   1. Crie um programa que executará uma janela de processamento a ser projetada na parte inferior do labirinto. Personalizando a cor do plano de fundo da janela é feito com o comando background, que aceita um código de cores RGB. Vários pequenos exemplos de programas são encontrados nos tutoriais de processamento (https://Processing.org/tutorials/).
   2. Use o programa de cores de fundo para calibrar o projetor e as condições de iluminação externas.
2. Meça qualquer distorção de luz criada pelo projetor usando um programa de processamento de imagem para identificar quaisquer desvios do plano de fundo homogêneo esperado criado. As etapas a seguir se aplicam ao uso do ImageJ (v. 1.52 h; https://ImageJ.nih.gov/IJ/).
   1. Capture uma imagem de quadro imóvel do labirinto Y iluminado com uma cor de fundo uniforme e abra no ImageJ.
   2. Usando a reta, segmentada, ou ferramenta de linha à mão livre desenhar uma linha reta vertical a partir da localização mais brilhante no centro do hotspot para o topo do labirinto Y (Figura 2a).
   3. No menu analisar, selecione traçar perfil para criar um gráfico de valores de escala de cinza versus distância em pixels.
   4. Salve dados de pixel como um arquivo separado por vírgula (extensão de arquivo. csv) consistindo em uma coluna de índice e uma coluna de valor de pixel.
3. Alinhe a área de projeção com o labirinto (Figura 2b) e modele qualquer distorção de luz indesejada para reduzir qualquer distorção de cor que possa ser criada pelo projetor (Figura 2C). A seguir descrevem as etapas tomadas na demonstração atual.
   1. Importe o arquivo de dados de intensidade de pixel ImageJ usando a função de leitura delimitada por tabulação apropriada (por exemplo, read_csv do pacote tidyverse para ler em arquivos separados por vírgula).
   2. Calcule a variabilidade na intensidade da luz ao longo do transect da amostra, tal como com um coeficiente de variação, para fornecer uma referência da linha de base para o nível de distorção criado no fundo.
   3. Transforme os valores brutos de pixel para refletir uma alteração relativa de intensidade de mais brilhante para mais dimmest, onde a menor intensidade de pixel abordará o valor de cor de plano de fundo desejado selecionado no programa de imagem.
   4. Plotar os valores de intensidade de pixel de transformação começando na parte mais brilhante da anomalia geralmente produz uma tendência de decomposição em valores de intensidade como uma função da distância da fonte. Use mínimos quadrados não lineares ( NLSde função) para estimar os valores de parâmetro que melhor se ajustam aos dados (aqui, uma função de decaimento gaussiana).
4. Crie o gradiente de contador usando o mesmo programa adotado para gerar a imagem do contador de plano de fundo (Processing v. 3) para reduzir qualquer distorção de cor que possa ser criada pelo projetor usando R (v. 3.5.1).
   Observação: a função de gradiente gerará uma série de círculos concêntricos centralizados no ponto mais brilhante da imagem que mudam na intensidade do pixel como uma função da distância do centro. A cor de cada anel é definida subtraindo-se a alteração na intensidade do pixel prevista pelo modelo a partir da cor de fundo. Correspondentemente, o raio do anel aumenta com a distância da fonte também. O modelo de melhor ajuste deve reduzir, se não eliminar, qualquer intensidade de pixel em todo o gradiente para fornecer uma uniformidade de fundo.
   1. Criar um gradiente Gaussian () usando o programa de estímulo visual, ajustando os parâmetros necessários.
      1. O parâmetro a afeta o brilho/escuridão do gradiente de distribuição gaussiana. Quanto maior o valor, mais escura o gradiente.
      2. O parâmetro b afeta a variância do gradiente. Quanto maior o valor, mais amplo o gradiente se estenderá antes de nivelar para a intensidade de pixel de plano de fundo desejada, c.
      3. O parâmetro c define a intensidade do pixel de fundo desejada. Quanto maior o valor, mais escura o fundo.
   2. Salve a imagem em uma pasta usando a função Saveframe , para que uma imagem de plano de fundo fixa possa ser carregada durante os experimentos para minimizar a carga de memória ao renderizar os estímulos durante uma avaliação experimental.
   3. Execute novamente o programa de geração de plano de fundo e inspecione visualmente os resultados, conforme mostrado na Figura 2C. Repita a etapa 4,3 para quantificar quaisquer melhorias observadas na redução do grau de variabilidade na intensidade da luz em toda a amostra transect.
5. Ajuste empiricamente os níveis de iluminação, parâmetros do modelo ou a distância coberta no transecto (por exemplo, raio externo do gradiente de contador) para fazer quaisquer ajustes manuais adicionais até que os valores RGB da zona de aclimatação sejam semelhantes à área de decisão. Os parâmetros do modelo neste teste foram: a = 215, b = 800 e c = 4.
6. Adicione o filtro final ao programa de estímulos visuais do experimento.

5. calibrar programa de projeção Visual: estímulos visuais

Nota: renderizar e animar os estímulos visuais também podem ser feitos no processamento usando as etapas abaixo como guias, juntamente com os tutoriais da plataforma. Um esquema da lógica do programa atual é fornecido em (Figura 3) e detalhes adicionais podem ser encontrados em Lemasson et al. (2018)⁷. As etapas a seguir fornecem exemplos das etapas de calibração realizadas no experimento atual.

1. Abra o programa de projeção Visual Vfish. PDE para centralizar a projeção dentro da área de decisão do labirinto (Figura 1a) e calibrar as projeções visuais com base nas hipóteses que estão sendo testadas (por exemplo, calibrar o tamanho e as velocidades das silhuetas para corresponder os dos sujeitos do ensaio). As calibrações são ajustadas à mão no cabeçalho do programa principal (Vfish. PDE) usando sinalizadores de depuração pré-selecionados. No modo de depuração (DEBUG = TRUE) seqüencialmente passo através de cada sinalizador DEBUGGING_LEVEL_ # (números 0-2) para fazer os ajustes necessários
   1. Defina o sinalizador DEBUGGING_LEVEL_0 como ' true ' e execute o programa pressionando o ícone de reprodução na janela de esboço. Altere os valores de posição x e y (parâmetros de domínio DX e dy, respectivamente) até que a projeção seja centralizada.
   2. Defina o DEBUGGING_LEVEL_1 como ' true ' para dimensionar o tamanho da silhueta de peixe (renderizado como uma elipse). Execute o programa e ajuste iterativamente a largura (eW) e o comprimento (eL) da elipse até que corresponda ao tamanho médio dos assuntos de teste. Depois, defina o DEBUGGING_LEVEL_2 como ' true ' para ajustar a velocidade de linha de base das silhuetas (SS).
   3. Defina DEBUG = FALSE para sair do modo de depuração.
2. Verifique se as silhuetas de distrator permanecem limitadas à área de decisão (DA, Figura 1a), que as trajetórias de silhueta de líder estão alinhadas corretamente com um ou outro braço, e que a relação de líder/distrator dentro do da permanece constante.
3. Percorra a GUI do programa para garantir a funcionalidade das opções.
4. Verifique se os dados estão sendo gravados corretamente no arquivo.
5. Assegure-se de que o software de gravação possa rastrear o assunto peixe com projeções visuais no lugar. Os passos para rastrear peixes têm sido descritos anteriormente em Kaidanovich-Berlin et al. (2011)⁸, Holcomb et al. (2014)⁹, Way et al. (2016)¹⁰ e Zhang et al. (2018)¹¹.

6. preparação animal

1. Escolha a espécie temática com base na questão de pesquisa e aplicação, incluindo sexo, idade, genótipo. Atribua assuntos aos tanques experimentais de retenção e registre estatísticas biométricas de linha de base (por exemplo, comprimento do corpo e massa).
2. Defina as condições ambientais no labirinto para o do sistema de exploração. As condições de qualidade da água para experimentos de base de comportamento são muitas vezes realizadas em ideal para as espécies e para a configuração do domínio experimental.
   1. Nesta demonstração, use as seguintes condições: 12 h de luz/12 h de ciclo escuro, luzes de halogéneo sem cintilação aérea definido para 134 ± 5 Lux, 22 ± 0,3 ° c, 97,4 ± 1,3% oxigênio dissolvido, e pH de 7,8 ± 0,1.
3. Habituar os animais transferindo-os para o domínio por até 30 min por dia durante 5 dias sem os estímulos visuais gerados por computador (por exemplo, silhuetas de peixe) antes do início dos ensaios experimentais.
4. Assegure-se de que o peixe sujeito nesse momento seja selecionado, atribuído, pesado, medido e transferido para tanques experimentais.
   Nota: aqui, o comprimento padrão de Golden Shiners e o peso molhado foram 63,4 ± 3,5 mm SL e 1,8 ± 0,3 g WW, respectivamente.
5. Use uma transferência de água para água ao mover peixes entre tanques e o labirinto para reduzir o estresse do manuseio e da exposição ao ar.
6. Realize experimentos durante um ciclo de luz regular e fixo, refletindo o ritmo biológico natural dos sujeitos. Isso permite que os sujeitos sejam alimentados no final dos ensaios experimentais de cada dia para limitar os efeitos da digestão no comportamento.

7. procedimento experimental

1. Ative o projetor de sala e os sistemas de trilha de luz LED para um nível de brilho predeterminado (nesta demonstração 134 ± 5 Lux) permitindo que as lâmpadas se aquecem (aproximadamente 10 minutos).
2. Abra o programa visualizador de câmera e carregar as configurações de abertura, cor e gravação salvos da configuração para garantir o melhor vídeo de qualidade pode ser alcançado.
   1. Abra o Visualizador de Pylon e ative a câmera a ser usada para gravação.
   2. Selecione carregar recursos no menu suspenso da câmera e navegue até a pasta de configurações da câmera salva.
   3. Abra as configurações salvas (aqui rotulados como camerasettings_20181001) para garantir a qualidade do vídeo e clique em tiro contínuo.
   4. Feche o Visualizador do Pylon.
3. Abra o programa de projeção Visual Vfish. PDE e verifique se a projeção permanece centralizada no labirinto, que a pasta DataOut está vazia e que o programa está operando conforme o esperado
   1. Verifique se o anel de calibração está centralizado no DA usando a etapa 5.1.1.
   2. Abra a pasta DataOut para garantir que ela esteja vazia para o dia.
   3. Execute o programa de estímulos visuais pressionando Play na janela de esboço de Vfish. PDE e use variáveis fictícias para garantir a funcionalidade do programa.
      1. Introduza o número de identificação de peixe (1-16), prima Entere, em seguida, confirme a selecção premindo Y ou n para Sim ou não.
      2. Insira o tamanho do grupo (fixado aqui em 1) e confirme a seleção.
      3. Insira a velocidade de silhueta desejada (0-10 BL/s) e confirme a seleção.
      4. Pressione Enter para passar o período de aclimatização e verificar a projeção do peixe virtual na área de decisão.
      5. Pressione Pause para pausar o programa e digite a escolha do resultado fictício, ou seja, esquerda (1) ou direita (2).
      6. Pressione parar para encerrar o programa e gravar os dados para o arquivo.
   4. Verifique se os dados foram gravados corretamente no arquivo na pasta DataOut e registre o arquivo como uma execução de teste nas anotações do laboratório antes que os peixes sejam colocados no domínio para aclimatação.
4. Use o tempo de relógio e um cronômetro para registrar os tempos de início e de parada do teste no caderno de laboratório para complementar os tempos decorridos que posteriormente podem ser extraídos da reprodução de vídeo devido à curta duração de alguns experimentos replicam.
5. Conduza uma mudança de água (por exemplo, 30%) usando o sistema de retenção de água de depósito antes de transferir um assunto para o labirinto.
6. Confirme que a qualidade da água é similar entre o labirinto e o sistema da terra arrendada, e verific o funcionamento da porta para assegurar-se de que desliza lisamente a apenas acima da altura da água.
7. Usando o cronograma experimental pré-determinado, que tem exposições randomizadas de tratamento de sujeitos ao longo do experimento, insira os valores selecionados para o ensaio atual (parando na tela de aclimatização, etapas 7.3.3.1-7.3.3.3).
   1. Registre dados de combinação de tratamento no caderno de laboratório.
8. Transfira o assunto para a área de retenção do labirinto Y para um período de aclimatação de 10 minutos.
9. Inicie a gravação de vídeo e, em seguida, pressione a tecla Return na janela vfish. PDE no final do período de aclimatação. Isso iniciará as projeções visuais.
10. Quando os peixes virtuais aparecem no domínio, registre a hora do relógio e levante o portão de retenção (figura 4a).
11. Termine a experimentação quando 50% do corpo do indivíduo se move em um braço de escolha (Figura 4B) ou quando o período de tempo designado decorre (por exemplo, 5 minutos).
    1. Registre a hora do relógio, os horários de início e de parada do cronômetro e a escolha dos sujeitos (ou seja, esquerda (1), direita (2) ou sem escolha (0)).
    2. Pare a gravação de vídeo e pressione Pause no programa de estímulos visuais, que solicitará ao usuário dados de resultado de avaliação (o número do braço selecionado ou um 0 para indicar que nenhuma escolha foi feita). Ao confirmar a seleção, o programa retornará à primeira tela e aguardará os valores esperados para o próximo teste experimental.
12. Recolher o assunto e devolvê-lo ao respectivo tanque de retenção. Repita os passos 7.7-7.13 para cada teste.
13. Na conclusão de uma sessão (AM ou PM) Pressione parar no programa uma vez que o último peixe da sessão tomou uma decisão. Pressionando Stop irá gravar os dados da sessão para o arquivo.
14. Repita a troca de água na conclusão da sessão da manhã para garantir a estabilidade da qualidade da água.
15. Após o último julgamento do dia, reveja o caderno do laboratório e faça todas as notas necessárias.
    1. Pressione parar no programa estímulos visuais para a saída dos dados coletados para a pasta dataout, após a última avaliação do dia.
16. Verifique o número, o nome e o local dos arquivos de dados salvos pelo programa de visualização.
17. Log de qualidade da água, juntamente com os níveis de luz na sala de labirinto para comparar com as configurações da manhã. Coloque o sistema de aeração e aquecedores no labirinto Y.
18. Desligue o projetor e a iluminação de rastreamento de sala experimental.
19. Alimente os peixes a ração diária predeterminada.

8. análise de dados

1. Assegure-se de que os dados experimentais contenham as variáveis necessárias (por exemplo, data, julgamento, ID do sujeito, braço selecionado por programa, fatores visuais testados, escolha do assunto, horários de início e de parada e comentários).
2. Verifique se há erros de gravação (humanos ou programas induzidos).
3. Tabulate respostas e verific para ver se há sinais de todos os vieses direcionais na parte dos assuntos (por exemplo, teste binomial na escolha do braço na condição de controle)⁷.
4. Quando o experimento é projetado usando medições repetidas nos mesmos indivíduos, como no caso aqui, sugere-se o uso de modelos de efeitos mistos.

Representative Results

Hipótese e projeto

Para demonstrar a utilidade deste sistema experimental nós testamos a hipótese que a exatidão com que Shiner dourado segue uma sugestão visual melhorará com a velocidade dessa sugestão. Foram utilizados o tipo Wild Shiner dourado (N = 16, comprimentos corporais, BL e pesos molhados, WW, 63,4 ± 3,5 mm e 1,8 ± 0,3 g, respeitosamente). A coerência dos estímulos visuais (relação líder/Distractor) foi fixada em 0,67, enquanto manipulamos a velocidade em que nossos sinais de movimento (ou seja, os líderes) se mudaram em relação aos seus distratores. Os níveis de velocidade das silhuetas do líder que fornecem as indicações direcionais variaram de 0-10 BL/s (nos incrementos de 2), que abrange a escala das velocidades consideradas tipicamente refletir sustentados, prolongados, ou modos da natação da explosão da atividade nos peixes¹². No nível do controle, 0, as silhuetas do líder foram orientadas para um braço do destino entre os distratores aleatòria orientados, mas nenhumas das silhuetas movidas. O braço de destino foi escolhido aleatoriamente para cada julgamento pelo programa. As unidades da distância estão no comprimento de corpo, que foi definida pelo comprimento padrão médio de nossos assuntos, e o tempo está nos segundos. A análise representativa atual centra-se na medição das variáveis de resposta primária (velocidade de decisão e precisão), mas o design do experimento também permite que os investigadores extraam informações adicionadas, rastreando os movimentos do sujeito e analisando seus Cinemática.

Nossos peixes foram alojados após a seção 6 do protocolo. Cada sujeito foi exposto a um nível de tratamento por dia. Nós randomizados tanto dentro do nível de tratamento sujeito (velocidade de sinalização) em dias e a ordem em que os indivíduos foram testados em cada dia. Modelos lineares e generalizados de efeitos mistos lineares (LMM e GLMM, respectivamente) foram utilizados para testar os efeitos da velocidade de silhueta de líder na velocidade e precisão com que os sujeitos seguiram os estímulos visuais. O ID do assunto foi incluído como o efeito aleatório em ambos os modelos.

Dados e descobertas

Na ausência de qualquer Motion cues Golden Shiner agiu como esperado e escolheu sua direção aleatoriamente (velocidade de estímulo = 0, teste binomial, n_esquerda= 33, n_Right= 40, = 0,45, P = 0,483). Enquanto a maioria dos indivíduos não apresentava sinais de comportamento estressante dentro do domínio e tomou uma decisão decisiva dentro do tempo alocado (5 min), 22% dos sujeitos mostraram relutância em abandonar a área de detenção ou entrar na área de decisão. Os dados desses peixes indecisos não foram incluídos na análise. Os restantes 78% dos nossos sujeitos mostraram melhora significativa na acurácia com que seguiram os estímulos direcionais à medida que a velocidade desses estímulos aumentou (GLMM, z = 1,937, P = 0, 53). A Figura 5a mostra a natureza desta relação, onde encontramos um aumento de 1,2 vezes na precisão direcional para cada aumento no nível de velocidade do estímulo. Essa relação é apenas modestamente desproporcional e não é, por si só, sugestiva de uma resposta de limiar a mudanças na velocidade de sinalização. Os aumentos na velocidade de estímulo também levaram a um aumento significativo na velocidade de decisão (LMM, F_{1, 56}= 4,774, P = 0, 33). No entanto, como evidenciado na Figura 5b , a tendência na velocidade de decisão foi inconsistente e altamente variável nos níveis de velocidade do estímulo. O que é aparente nestes dados da velocidade da decisão é que fêz exame dos assuntos, em média, em qualquer lugar de 5-20x mais por muito tempo para tomar sua decisão quando os estímulos se estavam movendo do que quando não eram (velocidades de decisão de 4,6 ± 2,3 s e 81,4 ± 74,7 s para o estímulo velocidades de 0 e 8, respectivamente, ± desvio padrão, DP). De fato, sem o nível de controle, não encontramos mudanças significativas na velocidade de decisão em função da velocidade do estímulo.

Figura 1. Domínio do Y-Maze. A . imagem do instrumento do labirinto do Y para o teste de tomada de decisão. As anotações representam o seguinte: área de retenção (HA, verde), área de decisão (DA, azul), braço de decisão esquerda (LDA) e braço de decisão direita (RDA). B. imagem do labirinto Y e sala com iluminação de faixa ajustável em cima e colocação de câmera GigE (apenas uma das quatro tiras de luzes de despesas gerais são visíveis). C. Image do labirinto de Y (vista lateral) que inclui a colocação do projetor que é bloqueada pelo carro deslizante para eliminar movimentos durante, ou entre, ensaios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Calibração do fundo e do estímulo. A. imagem do Y-labirinto iluminado com uma cor de fundo uniforme e um transecto da intensidade do pixel (linha verde) entre a área da terra arrendada e a área da decisão, da (intensidade média do pixel 112 ± 1278). O gradiente de luz gerado pelo bulbo do projetor (hotspot) é claramente visível. B. Image mostrando o alinhamento das projeções com o promotor. C. imagem do labirinto com o fundo filtrado e uma silhueta solitária projetada no centro do da para a calibração (tamanho, velocidade). A adição do fundo de gradiente contador em (C) resulta em um fundo mais escuro (intensidade média de pixel 143,1 ± 5,5) e muito menos variabilidade espacial (coeficiente de variação cai de 11,4 (A.) para 0, 3 (C.). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Esquema do fluxo geral de operações no programa de visualização utilizado nos experimentos. Para detalhes processuais adicionais ver⁷. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Experimentação experimental com as silhuetas reais e virtuais dos peixes. A . Image a (viva) Shiner dourado que sae da área da terra arrendada (círculo verde). B. Image de um Shiner dourado (vivo) na área da decisão (círculo verde) entre as silhuetas virtuais dos peixes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Exatidão e velocidade de respostas direcionais às mudanças na velocidade relativa de sinais do movimento. A . gráfico da exatidão da decisão dos peixes com que o Shiner dourado seguiu as silhuetas do "líder" plotadas de encontro à velocidade do estímulo (BL/s). B. gráfico da velocidade de decisão dos peixes plotado contra a velocidade do estímulo (BL/s). Os dados são médias ± erros padrão, SE. grupos de 15 silhuetas virtuais foram distribuídos aleatoriamente ao longo da zona de decisão com um nível de coerência de 67% (10 das 15 silhuetas atuou como líderes, as restantes 5 silhuetas atuou como distratores) e nós variado o velocidade dos líderes de 0-10 BL/s. as velocidades do Distractor permaneceram fixadas em 1 BL/s em todos os níveis de velocidade, exceto o controle em que nenhuma das silhuetas se moveu. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As indicações visuais são sabidas para disparar uma resposta do optomotor nos peixes expor às grades preto e branco¹³ e há uma evidência teórica e empírica crescente que a velocidade do vizinho joga um papel influente em governar as interações dinâmicos observado nas escolas de peixes^{7,14,15,16,17}. Existem hipóteses contrastantes para explicar como os indivíduos em grupos integram movimentos vizinhos, como reagir proporcionalmente a todas as pistas discernível¹⁴, adotando uma resposta de limiar de movimento¹⁷, ou monitorando tempos ^{de colisão 18}. um primeiro passo para testar essas hipóteses alternativas é validar suas premissas subjacentes. Aqui nós Demonstramos a utilidade de nosso protocolo em identificar o papel que uma característica sensorial particular pode ter em guiar decisões direcionais.

Nós isolamos como os indivíduos de uma espécie de peixe social, o Shiner dourado, responderam às mudanças na velocidade relativa de estímulos visuais projetados imitar conespecificidades em uma escola. A exatidão direcional de Shiner dourado melhorou com aumentos na velocidade relativa dos estímulos visuais, mas a relação funcional entre estas variáveis era somente marginalmente desproporcional. A relação entre velocidade de decisão e velocidade de estímulo, embora significativa, foi altamente variável e inconsistente. Os resultados demonstram, no entanto, que uma diferença de velocidade encontrada nas imagens espalhadas pelo campo de visão desses peixes desempenha um papel importante no desencadeamento de uma resposta e na orientação de sua atenção. Provocando distante como os indivíduos selecionam entre as ações de vizinhos específicos poderiam ser sonados com o projeto atual introduzindo sentidos conflitantes nos estímulos.

Em uma experiência recente com zebrafish, Danio rerio, não encontramos nenhuma evidência de indecisão em ensaios solitários⁷, mas Shiner dourado nesta manifestação exibiu uma maior relutância em deixar a área de detenção. As diferenças entre essas duas espécies podem ser explicadas por suas estratégias de história de vida e pela força relativa de suas tendências sociais (ou dependência). Zebrafish parecem exibir mais variável coerência social do que os Shiners de ouro (por exemplo, facultativo versus escolares obrigam³). É provável que a coerência social mais forte em Shiner dourado possa ter contribuído aos assuntos que mostram uns níveis mais elevados de timidez, ou hesitação dentro do domínio do que suas contrapartes do zebrafish.

A ordem das etapas é sutil, mas crítica no protocolo. O processo de equilibrar as luzes, o projetor e o filtro de programa pode demorar mais tempo do que muitas vezes antecipado para novos domínios. Neste protocolo, as lições aprendidas foram incluídas para reduzir a configuração e o tempo de equilíbrio de luz, como o uso de luzes de trilha que refletem fora da parede (não no domínio), controladores de luz ajustáveis e filtros gerados por programas para o projetor. Considere também que o que pode parecer ser visualmente aceitável para o olho humano não será visto pela câmera e software da mesma forma, assim, suas condições de iluminação podem exigir ajustes adicionais. Mesmo pequenas mudanças nos ângulos do monitor resultará em alterações de gradiente de fundo. Assim, a observação detalhada que toma e que salva ajustes do arquivo reduzirá extremamente a probabilidade das mudanças que ocorrem durante a experimentação. Movendo-se através do processo de física para filtragem, como apresentado aqui, produz os passos mais rápidos para o sucesso.

O uso de um projetor ST permite maior flexibilidade espacial sobre um monitor, mas essa abordagem cria uma anomalia visual indesejada chamada de "hotspot". Um HotSpot é um ponto luminoso na superfície de projeção criada pela proximidade da lâmpada do projetor. No protocolo, a seção 4 foi dedicada à criação de filtros de fundo e à verificação de raios homogêneos em todo o domínio. As etapas fornecidas aqui ajudarão os usuários a evitar ou minimizar os efeitos indesejados do hotspot, modelando qualquer gradiente indesejado e usando o modelo para reproduzir um gradiente inverso para contrariar os efeitos. Por último, o modelo de projetor ST pode variar, no entanto, ajustes de imagem (girar, inverter, projeção da tela frontal ou traseira) e correção de Keystone (± 3-5 graus) são recursos úteis para garantir que a imagem desejada se encaixa no domínio e pode ser ajustada para distorção.

Ao longo do tempo, as salas experimentais foram atualizadas para facilitar as mudanças no hardware (ou seja, câmeras, cabeamento, placas de vídeo, monitores). É digno de nota mencionar que as mudanças de hardware provavelmente resultará em tempo de arranque adicional para equilibrar a iluminação e trabalhar através de quaisquer problemas potenciais do programa. Portanto, é recomendável que qualquer hardware seja dedicado a um sistema até a conclusão dos experimentos desejados. A maioria dos desafios foram vinculados a diferenças de desempenho entre monitores, placas de vídeo e as câmeras resultantes, por vezes, na alteração do código de programação. Desde o momento deste trabalho, novos domínios foram desenvolvidos em que o domínio de teste interno pode ser removido e alternado para outros domínios de teste. Recomendamos essa flexibilidade ser considerada ao projetar os domínios experimentais e estruturas de suporte.

O protocolo atual permite que os investigadores isolem e manipulem características visuais de uma maneira que ambos reflita o ambiente visual esperado dentro de uma escola, ao igualmente controlar para os fatores confundimento que acompanham a exposição aos conespecificidades reais (por exemplo , fome, familiaridade, agressão)⁷. Em geral, a animação computacional (CA) de peixes virtuais (ou seja, silhuetas) é uma prática que está se tornando um lugar mais comum devido às suas distintas vantagens em estimular as respostas comportamentais^19,20,21. A CA permite personalizar pistas visuais (direção, velocidade, coerência ou morfologia), ao mesmo tempo em que introduz um nível de padronização e repetibilidade no estímulo desejado que excede o que pode ser conseguido ao usar animais vivos como estimulantes. O uso da realidade virtual em estudos comportamentais, em ambos os animais²² e humanos²³, também está aumentando constantemente e promete se tornar uma poderosa ferramenta empírica como a tecnologia se torna mais disponível e tractable. Tomados em conjunto, essas abordagens virtuais também substituem e reduzem as exigências dos animais vivos da ética animal na ciência (por exemplo, IACUC, AAALAC e ACURO)²⁴, enquanto que, concomitantemente, reduzem os custos e os encargos laboratoriais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black and white IP camera	Noldus, Leesburg, VA, USA		https://www.noldus.com/
Extruded aluminum	80/20 Inc., Columbia City, IN, USA	3030-S	https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets	Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA		http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners	Saul Minnow Farm, AR, USA		http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware	National Institute for Health (NIH), USA		https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting	Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA	BR20MW-M4	https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl	651Vinyl, Louisville, KY, USA	651-010M-12:5ft	http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector	Epson, Long Beach CA, USA	V11H605020	https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware	Processing Foundation		https://processing.org/
R (3.5.1) freeware	The R Project for Statistical Computing		https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen	Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA	1950	https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system	Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA		https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.