Integrera visuella psykofysiska analyser inom en Y-labyrint för att isolera den roll som visuella funktioner spelar i navigations beslut

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att demonstrera en beteendemässig analys som kvantifierar hur alternativa visuella funktioner, såsom rörelsesignaler, påverka riktnings beslut i fisk. Representativa data presenteras på hastighet och noggrannhet där Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas) följer virtuella fisk rörelser.

Abstract

Kollektivt djur beteende uppstår från enskilda motiv och sociala interaktioner som är avgörande för individuell kondition. Fisk har länge inspirerat utredningar om kollektiv motion, särskilt deras förmåga att integrera miljö-och social information i ekologiska sammanhang. Denna demonstration illustrerar tekniker som används för att kvantifiera beteendemässiga reaktioner av fisk, i detta fall, Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), till visuella stimuli med hjälp av dator visualisering och digital bildanalys. Senaste framstegen inom dator visualisering möjliggör empiriska tester i labbet där visuella funktioner kan styras och fint manipuleras för att isolera mekanismerna för sociala interaktioner. Syftet med den här metoden är att isolera visuella funktioner som kan påverka individens riktnings beslut, oavsett om de är ensamma eller med grupper. Detta protokoll ger detaljerna på den fysiska Y-Maze domän, inspelningsutrustning, inställningar och kalibreringar av projektorn och animation, experimentella steg och dataanalyser. Dessa tekniker visar att datoranimering kan framkalla biologiskt meningsfulla svar. Dessutom är teknikerna lätt anpassningsbara för att testa alternativa hypoteser, domäner och arter för ett brett spektrum av experimentella tillämpningar. Användningen av virtuella stimuli gör det möjligt att minska och ersätta antalet levande djur som krävs, och därmed minskar laboratoriekostnader.

Denna demonstration testar hypotesen att små relativa skillnader i förflyttnings hastigheterna (2 kropps längder per sekund) av virtuella artfränder kommer att förbättra hastigheten och noggrannheten med vilken shiners följer riktnings signalerna från den virtuella Silhuetter. Resultaten visar att shiners riktnings beslut påverkas avsevärt av ökningar i hastigheten på visuella ledtrådar, även i närvaro av bakgrundsljud (67% bild enhetlighet). I avsaknad av några rörelsesignaler, ämnen valde sina riktningar slumpmässigt. Förhållandet mellan beslut hastighet och Cue hastighet var varierande och ökningar i Cue hastighet hade ett blygsamt oproportionerligt inflytande på riktnings noggrannhet.

Introduction

Djuren känner och tolkar sin livsmiljö kontinuerligt för att fatta välgrundade beslut när de interagerar med andra och navigerar i bullriga omgivningar. Individer kan förbättra sin situationsmedvetenhet och beslutsfattande genom att integrera social information i sina handlingar. Social information är dock till stor del härrör från inferens genom oavsiktliga signaler (dvs. plötsliga manövrer för att undvika ett rovdjur), som kan vara opålitliga, snarare än genom direkta signaler som har utvecklats för att kommunicera specifika meddelanden (t. ex. den vifta Dans i Honey Bees)¹. Att identifiera hur individer snabbt bedömer värdet av sociala signaler, eller någon sensorisk information, kan vara en utmanande uppgift för utredare, särskilt när individer reser i grupper. Vision spelar en viktig roll i att styra sociala interaktioner^2,3,4 och studier har dragit slutsatsen samspelet nätverk som kan uppstå i fisk skolor baserat på varje individs synfält^{5, 6}. Fisk skolor är dynamiska system, men gör det svårt att isolera enskilda svar på särskilda funktioner, eller granne beteenden, på grund av de inneboende kollinariteter och confounding faktorer som uppstår från samspelet mellan gruppmedlemmar. Syftet med detta protokoll är att komplettera det nuvarande arbetet genom att isolera hur alternativa visuella funktioner kan påverka riktnings besluten för enskilda personer som reser ensamma eller inom grupper.

Fördelen med det aktuella protokollet är att kombinera ett manipulativt experiment med dator visualiseringstekniker för att isolera de elementära visuella funktioner som en individ kan uppleva i naturen. Specifikt, Y-Maze (figur 1) används för att komprimera riktnings val till en binär respons och införa datoranimerade bilder utformade för att efterlikna simning beteenden av virtuella grannar. Dessa bilder projiceras upp underifrån labyrinten för att efterlikna silhuetter av artfränder simning under ett eller flera ämnen. De visuella egenskaperna hos dessa silhuetter, såsom deras morfologi, snabbhet, enhetlighet och simning beteende är lätt anpassade för att testa alternativa hypoteser⁷.

Denna uppsats visar nyttan av detta tillvägagångssätt genom att isolera hur individer av en modell sociala fiskarter, den gyllene Shiner (Notemigonus crysoleucas), svara på den relativa hastigheten på virtuella grannar. Protokollet fokus, här, är om huruvida riktad påverkan av virtuella grannar förändras med sin hastighet och, om så är, kvantifiera formen av den observerade relationen. I synnerhet är riktad Cue genereras genom att ha en fast andel av silhuetter fungera som ledare och röra sig ballistiskt mot en arm eller en annan. De återstående silhuetter fungerar som distraktorer genom att slumpmässigt flytta om för att ge bakgrundsljud som kan stämmas genom att justera ledaren/distractor förhållandet. Förhållandet mellan ledare och distraktorer fångar samstämmighet riktade signaler och kan justeras i enlighet med detta. Distractor silhuetter förbli begränsade till besluts området ("DA", figur 1a) genom att ha silhuetter reflektera bort av gränsen. Leader silhuetter, dock, får lämna DA regionen och ange deras utsedda armen innan sakta bleknar bort när silhuetter passerade 1/3 längden på armen. Som ledare lämna DA, nya ledare silhuetter ta sin plats och spåra deras exakta vägen för att säkerställa att ledaren/distractor förhållandet förblir konstant i DA hela experimentet.

Användningen av virtuell fisk möjliggör kontroll av den visuella sensorisk information, samtidigt övervaka riktad respons av ämnet, som kan avslöja nya funktioner i social navigation, rörelse, eller beslutsfattande i grupper. Den metod som används här kan tillämpas på ett brett spektrum av frågor, såsom effekter av subletala stress eller predation på sociala interaktioner, genom att manipulera datoranimering för att producera beteendemässiga mönster av varierande komplexitet.

Protocol

Alla experimentella protokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för miljö laboratoriet, USA: s armé ingenjör och forskning och utveckling Center, Vicksburg, MS, USA (IACUC # 2013-3284-01).

1. sensoriska labyrint design

1. Genomföra experimentet i en vattentät Poly metyl polymetylmetakrylat Y-labyrint plattform (Made in-House) som ovanpå en transparent support plattform i ett särskilt rum. Här plattformen är 1,9 cm tjock och stöds av 4 7,62 cm balkar av extruderad aluminium som är 1,3 m i bredd, 1,3 m i längd, och 0,19 m i höjd.
2. Konstruera jordbruksföretag och beslutsområden som är identiska i konstruktionen (figur 1a). Här, Y-labyrinten armarna är 46 cm i längd, 23 cm i bredd, och 20 cm på djupet med en central beslutsområde ca 46 cm i diameter.
3. Följ vita projektet-genom teatern skärmen längst ner i Y-labyrint för projicering visuella stimuli i domänen.
4. Coat sidorna av Y-labyrinten med vit vinyl för att begränsa yttre visuella stimuli.
5. Installera en fjärrstyrd Clear Gate (via klar monofilament) för att partitionera jordbruksområdet från det centrala besluts området för att frigöra ämnen i labyrinten efter acklimatisering.
6. Placera ytterligare persienner för att förhindra att fisken tittar på lampor, bostäder och utrustning, såsom ljusblockerande persienner som når golvet i dörrkarmar för att minimera ljuseffekter och skugg rörelser från det yttre rummet eller hallen.

2. inspelningsutrustning

1. Välj en överliggande kamera (svartvitt) baserat på kontrasten som behövs mellan bakgrundsbilder, virtuell fisk och föremål fisk.
2. Installera en overhead-kamera för att spela in labyrinten från ovan och för att registrera beteenden av fisken och de visuella projektionerna.
   1. För denna demonstration, Använd b/w gigabyte Ethernet (GigE) kameror, så att 9 m IP-kablar var anslutna till en dator med ett 1 GB Ethernet-kort i ett kontrollrum.
3. Anslut kameran till en dator i ett angränsande rum där observatören kan fjärrstyra grinden, visuella stimuli program och kamera inspelningsprogram.
4. Se till att kamerainställningarna är vid provtagning och frekvens som förhindrar eventuella flimmer effekter, som uppstår när kameran och programvaran är ur fas med belysningen i rummet.
   1. Kontrollera den elektriska frekvensen av platsen; kompensera kamerans samplingsfrekvens (bildrutor per sekund, FPS) för att förhindra flimmer genom att multiplicera eller dividera AC-frekvensen med ett heltal.
5. Ställ in kamerainställningarna så att bildens klarhet optimeras med hjälp av programvaran och datorn för att visualisera relevanta beteenden.
   1. För denna demonstration, utföra provtagning vid 30 fps med en rumslig upplösning på 1280 pixlar x 1024 pixlar.

3. Kalibrera belysning, projektor och kamerainställningar

1. Installera fyra spår belysningssystem längs väggarna i experiment rummet.
2. Installera justerbara reglage för belysningen för att ge större flexibilitet för att uppnå rätt rums omgivningsljus.
3. Placera lamporna för att undvika reflektioner på labyrinten (figur 1b).
4. Säkra en kort kast (ST) projektor till nederkanten av labyrinten stödstruktur (figur 1c).
   1. Välj projektionsupplösningen (inställt på 1440 pixlar x 900 pixlar för den här demonstrationen).
5. Justera omgivande ljusnivåer, skapade av overhead-lampor och projektor, för att matcha de ljusförhållanden som finns i försökspersonernas bostadsrum (här satt till 134 ± 5 lux under demonstrations försöket, vilket motsvarar naturlig belysning på en mulen dag).
   1. Lås eller markera platsen för dimmer-omkopplaren för enkel och konsekvent under experimentella försök.
6. Använd ett kamera visningsprogram för att konfigurera kameran (erna) för att styra exponeringsläge, förstärkning och vitbalanskontroll.
   1. I den här demonstrationen, ställa in pylon Viewer till "kontinuerlig Shot", 8000 μs exponeringstid, 0 Gain, och 96 vitbalans, som ger kontroll över videoinspelning.

4. kalibrera visuellt projektionsprogram: bakgrund

1. Projicera en homogen bakgrund upp på botten av labyrinten och mät eventuella ljus förvrängningar från projektorn. Här skapades bakgrunden med Processing (v. 3), som är en tractable och väl dokumenterad plattform för att skapa anpassade visualiseringar för vetenskapliga projekt (https://Processing.org/examples/).
   1. Skapa ett program som kommer att köra en bearbetning fönster som ska projiceras på botten av labyrinten. Anpassa bakgrundsfärgen i fönstret görs med kommandot bakgrund, som accepterar en RGB-färgkod. Flera små exempel program finns i handledning (https://Processing.org/tutorials/).
   2. Använd bakgrundsfärg programmet för att kalibrera projektorn och de yttre ljusförhållandena.
2. Mät eventuell ljus förvrängning som skapas av projektorn med hjälp av ett bildbehandlings program för att identifiera eventuella avvikelser från den förväntade homogena bakgrunden som skapas. Följande steg gäller för användning av ImageJ (v. 1.52 h; https://imagej.NIH.gov/IJ/).
   1. Fånga en stillbild bild av den upplysta Y-labyrinten med en enhetlig bakgrundsfärg och öppna i ImageJ.
   2. Med hjälp av det raka, segmenterade eller FreeHand linjeverktyget ritar du en rak vertikal linje från den ljusaste platsen i mitten av hotspot-området till toppen av Y-labyrinten (figur 2A).
   3. Välj Rita profil på analysera-menyn om du vill skapa ett diagram över gråskalevärden jämfört med avståndet i pixlar.
   4. Spara pixeldata som en kommaseparerad fil (. csv-filtillägg) som består av en indexkolumn och en pixelvärde kolumn.
3. Rikta in projektionsområdet med labyrinten (figur 2b) och modellera eventuell oönskad ljus förvrängning för att minska eventuell färgförvrängning som kan skapas av projektorn (figur 2C). Följande beskriver de åtgärder som vidtagits i den aktuella demonstrationen.
   1. Importera ImageJ pixel intensitet datafil med hjälp av lämplig Tab avgränsad Läs funktion (t. ex., read_csv från tidyverse paketet att läsa i kommaseparerade filer).
   2. Beräkna variationen i ljusintensitet längs prov Transekten, till exempel med en variationskoefficient, för att ge en baslinje referens för den förvrängnings nivå som skapas i bakgrunden.
   3. Omvandla de råa pixelvärden för att återspegla en relativ förändring i intensitet från ljusaste till dimmest, där den minsta pixel intensiteten kommer att närma sig önskat bakgrundsfärg värde som valts i bildprogrammet.
   4. Rita upp värdena för transformera pixelintensitet som börjar vid den ljusaste delen av anomalin ger i allmänhet en ruttnande trend i intensitetsvärden som en funktion av avståndet från källan. Använd icke-linjära minsta kvadraterna (Function nls) för att uppskatta de parametervärden som bäst passar data (här, en Gaussisk sönderfalls funktion).
4. Skapa räknaren lutning med hjälp av samma program som antagits för att generera bakgrunden räknaren bild (bearbetning v. 3) för att minska eventuella färgförvrängning som kan skapas av projektorn med R (v. 3.5.1).
   Anmärkning: övertoningsfunktionen kommer att generera en serie koncentriska cirklar centrerad på den ljusaste platsen i bilden som ändras i pixel intensitet som en funktion av avståndet från centrum. Färgen på varje ring definieras genom att subtrahera förändringen i pixel intensiteten som förutses av modellen från bakgrundsfärgen. På motsvarande sätt ökar ringradien med avstånd från källan också. Den bäst lämpade modellen bör minska, om inte eliminera, någon pixel intensitet över gradienten för att ge en bakgrunds enhetlighet.
   1. Skapa en Gaussian gradient () med hjälp av Visual stimulus program genom att justera de nödvändiga parametrarna.
      1. Parameter a påverkar ljusstyrkan/mörkret av den Gaussian fördelnings lutningen. Ju högre värde, desto mörkare lutning.
      2. Parameter b påverkar variansen för övertoningen. Ju större värde, desto bredare lutningen kommer att sträcka sig innan utjämning ut till önskad bakgrund pixel intensitet, c.
      3. Parameter c anger önskad bakgrunds pixel intensitet. Ju större värde, desto mörkare bakgrund.
   2. Spara bilden i en mapp med hjälp av funktionen Saveframe så att en fast bakgrundsbild kan överföras under experimenten för att minimera minnes belastningen när stimuli återges under en experimentell testperiod.
   3. Kör det bakgrundsgenererande programmet och inspektera resultaten visuellt, som visas i figur 2C. Upprepa steg 4,3 för att kvantifiera eventuella observerade förbättringar när det gäller att minska graden av variabilitet i ljusintensitet över prov Transekten.
5. Justera Ljusnivåerna, modell parametrarna eller avståndet som täcks i Transekten (t. ex. den yttre radien för motgradienten) för att göra ytterligare manuella justeringar tills RGB-värdena i acklimatitetszonen liknar besluts området. Modell parametrarna i det här testet var: a = 215, b = 800 och c = 4.
6. Lägg till det slutliga filtret i experiment programmet Visual stimuli.

5. kalibrera visuellt projektionsprogram: visuella stimuli

Anmärkning: rendering och animera visuella stimuli kan också göras i bearbetning med hjälp av stegen nedan som guider tillsammans med plattformens tutorials. En schematisk av det aktuella programmets logik finns i (figur 3) och ytterligare detaljer finns i Lemasson et al. (2018)⁷. Följande steg ger exempel på de kalibrerings steg som tas i det aktuella experimentet.

1. Öppna Visual Projection program Vfish. PDE för att centrera projektionen inom labyrinten beslutsområde (figur 1a) och kalibrera de visuella projektionerna baserat på de hypoteser som testas (t. ex. Kalibrera storlek och hastigheter på silhuetter för att matcha försökspersonerna). Kalibreringar är handjusterade i huvudet på huvudprogrammet (Vfish. PDE) med hjälp av förvalda felsökningsflaggor. I felsökningsläge (DEBUG = TRUE) sekventiellt steg genom varje DEBUGGING_LEVEL_ # flagga (nummer 0-2) för att göra nödvändiga justeringar
   1. Ställ in flaggan DEBUGGING_LEVEL_0 på "true" och kör programmet genom att trycka på uppspelningsikonen i skiss fönstret. Ändra x-och y-positionsvärden (domän parametrar DX respektive dy) tills projektionen är centrerad.
   2. Ställ in DEBUGGING_LEVEL_1 till "true" för att skala storleken på fisksiluetten (återges som en ellips). Kör programmet och justera iterativt bredden (eW) och längd (eL) på ellipsen tills den matchar den genomsnittliga storleken på försökspersonerna. Efteråt, ställa in DEBUGGING_LEVEL_2 till "true" för att justera baslinjen hastigheten på silhuetter (SS).
   3. Ange DEBUG = FALSE för att avsluta felsökningsläget.
2. Kontrollera att distraktorer silhuetter förblir avgränsas till besluts området (DA, figur 1a), att Leader silhuett banor är korrekt i linje med endera armen, och att ledaren/distractor förhållandet inom da förblir konstant.
3. Steg genom programmets GUI för att säkerställa funktionaliteten av alternativen.
4. Kontrollera att data skrivs ut korrekt till filen.
5. Se till att inspelningsprogrammet kan spåra föremål fisken med visuella prognoser på plats. Åtgärder för att spåra fisk har tidigare beskrivits i Kaidanovich-Berlin et al. (2011)⁸, Holcomb et al. (2014)⁹, Way et al. (2016)¹⁰ och Zhang et al. (2018)¹¹.

6. djur beredning

1. Välj ämne arter baserat på forskningsfråga och ansökan, inklusive kön, ålder, genotyp. Tilldela ämnen till de experimentella tank tankarna och registrera biometrisk statistik (t. ex. kroppslängd och massa).
2. Ange miljöförhållandena i labyrinten till det som finns i holdingsystemet. Vattenkvalitet villkor för utgångsläget experiment av beteende hålls ofta på optimal för arterna och för experimentell domän setup.
   1. I denna demonstration, Använd följande villkor: 12 h ljus/12 h mörk cykel, overhead flimmerfria halogenlampor inställd på 134 ± 5 Lux, 22 ± 0,3 ° c, 97,4 ± 1,3% upplöst syre och pH på 7,8 ± 0,1.
3. Habituate djuren genom att överföra dem till domänen för upp till 30 min per dag i 5 dagar utan datorgenererade visuella stimuli (t. ex., fisk silhuetter) innan försöks försöken.
4. Se till att ämnet fisk på den tiden väljs, tilldelas, vägs, mäts och överföras till experimentella tankar.
   Anmärkning: här, Golden shiners standard längd och våtvikt var 63,4 ± 3,5 mm SL och 1,8 ± 0,3 g WW, respektive.
5. Använd en vatten-till-vatten överföring när du flyttar fisk mellan tankar och labyrinten för att minska stressen från hantering och luft exponering.
6. Genomför experiment under en regelbunden, fast ljus cykel som återspeglar försökspersonernas naturliga biologiska rytm. Detta gör att ämnena kan matas i slutet av varje dags experimentella försök att begränsa matsmältningen effekter på beteende.

7. experimentellt förfarande

1. Slå på rum projektor och LED-ljus spårsystem till förutbestämd nivå av ljusstyrka (i denna demonstration 134 ± 5 lux) så att glödlamporna att värma (ca 10 minuter).
2. Öppna Camera Viewer-programmet och Läs in inställningarna för bländare, färg och inspelning som sparats från installationsprogrammet för att säkerställa bästa kvalitet video kan uppnås.
   1. Öppna pylon Viewer och aktivera kameran som ska användas för inspelning.
   2. Välj Läs in funktioner från kamerans rullgardinsmeny och navigera till mappen sparade kamerainställningar.
   3. Öppna de sparade inställningarna (här märkt som camerasettings_20181001) för att säkerställa videokvalitet och klicka på kontinuerlig bild.
   4. Stäng pylon Viewer.
3. Öppna Visual Projection program Vfish. PDE och kontrollera att projektionen förblir centrerad i labyrinten, att DataOut mappen är tom, och att programmet fungerar som förväntat
   1. Kontrollera att kalibrerings ringen är centrerad i DA med steg 5.1.1.
   2. Öppna mappen DataOut för att säkerställa att den är tom för dagen.
   3. Kör Visual stimuli programmet genom att trycka på Play i skiss fönstret av Vfish. PDE och använda dummy variabler för att säkerställa Programfunktionaliteten.
      1. Ange Fish ID-nummer (1-16), tryck på RETURoch bekräfta sedan markeringen genom att trycka på Y eller N för Ja eller nej.
      2. Ange gruppstorlek (fast här på 1) och bekräfta valet.
      3. Ange önskad silhuett hastighet (0-10 BL/s) och bekräfta valet.
      4. Tryck på Enter för att gå förbi acklimatiseringsperioden och kontrollera projektionen av den virtuella fisken i besluts området.
      5. Tryck PAUSE för att pausa programmet och ange provdockans utfall, d.v.s. vänster (1) eller höger (2).
      6. Tryck på Stop för att avsluta programmet och skriva ut data till fil.
   4. Kontrollera att data skrevs korrekt till filen i mappen DataOut och logga filen som en provkörning i labbet anteckningar innan fisken placeras i domänen för acklimatisering.
4. Använd Klock tid och ett stoppur för att logga start-och stopptider för utvärderingsversionen i lab notebook för att komplettera de förflutna tider som senare kan extraheras från videouppspelning på grund av den korta varaktigheten för vissa replikations försök.
5. Genomföra en vatten förändring (t. ex. 30%) använda anläggningen sump vatten innan du överför ett ämne till labyrinten.
6. Bekräfta att vattenkvaliteten är liknande mellan labyrinten och håll systemet, och kontrollera Gate fungerar för att säkerställa att den glider smidigt till strax över vattenhöjden.
7. Använda den förutbestämda experimentella schema, som har randomiserade ämne-behandling exponeringar under loppet av experimentet, ange de värden som valts för den aktuella rättegången (stoppa vid acklimatisering skärmen steg 7.3.3.1-7.3.3.3).
   1. Registrera data för behandlingskombination i den bärbara labb datorn.
8. Överför ämnet till Y-Maze Holding Area för en 10-minuters acklimatisering period.
9. Starta videoinspelning, tryck sedan på RETUR tangenten i vfish. PDE fönstret i slutet av acklimatisering perioden. Detta kommer att starta visuella projektioner.
10. När den virtuella fisken visas i domänen loggar du klocktiden och lyfter upp hållarporten (figur 4a).
11. Avsluta rättegången när 50% av försöks kroppens kropp rör sig i en VALARM (figur 4b) eller när den angivna tidsperioden förlöper (t. ex. 5 min).
    1. Logga klocktiden, start-och stopptider från stoppuret och försökspersonernas val (d.v.s. vänster (1), höger (2) eller inget val (0)).
    2. Stoppa videoinspelning och tryck på PAUSE i Visual stimuli programmet, som kommer att uppmana användaren för testresultat data (arm-nummer valt eller en 0 för att indikera att inget val gjordes). När du bekräftar valet återgår programmet till den första skärmen och väntar på de värden som förväntas för nästa experimentella testperiod.
12. Samla in motivet och returnera det till respektive tank. Upprepa steg 7.7-7.13 för varje testperiod.
13. Vid avslutningen av en session (AM eller PM) Tryck Stop i programmet när den sista fisken i sessionen har fattat ett beslut. Att trycka på Stop kommer att skriva sessionens data ut till fil.
14. Upprepa vattenutbytet vid avslutningen av morgonens session för att säkerställa vattenkvaliteten stabilitet.
15. Efter den sista provperioden av dagen granskar du den bärbara labb datorn och gör eventuella nödvändiga anteckningar.
    1. Tryck Stop i Visual stimuli program för att mata ut insamlade data till mappen dataout, efter den sista rättegången för dagen.
16. Kontrollera antalet, namnet och platsen för de datafiler som har sparats i visualiserings programmet.
17. Log vattenkvalitet, tillsammans med ljusnivåer i labyrinten rummet att jämföra med morgon inställningarna. Placera luftnings systemet och värmare i Y-labyrinten.
18. Stäng av projektorn och experimentell rums spårnings belysning.
19. Matar fisk den förutbestämda dagsransonen.

8. analys av data

1. Se till att experimentella data innehåller de nödvändiga variablerna (t. ex. datum, prov, ämnes-ID, arm som valts av programmet, testade visuella faktorer, ämnesval, start-och stopptid samt kommentarer).
2. Kontrollera om det finns några inspelningsfel (human eller program inducerad).
3. Tabulate svar och kontrollera om tecken på någon riktad fördomar på den del av försökspersonerna (t. ex., binomial test på arm val i kontrollvillkoret)⁷.
4. När experimentet är utformat med upprepade mätningar på samma individer, som i fallet här, användning av blandade effekter modeller föreslås.

Representative Results

Hypotes och design

För att demonstrera nyttan av detta experimentella system vi testade hypotesen att den noggrannhet med vilken Golden Shiner följa en visuell Cue kommer att förbättras med hastigheten på den Cue. Wild Type Golden Shiner användes (N = 16, kropps längder, bl, och våta vikter, WW, var 63,4 ± 3,5 mm och 1,8 ± 0,3 g, respektfullt). Samstämmighets graden hos de visuella stimuli (Leader/distraktörs kvoten) fastställdes till 0,67, medan vi manipulerade den hastighet med vilken våra rörelsesignaler (dvs. ledarna) flyttade med avseende på deras distraktorer. Hastighetsnivåer av ledare silhuetter som ger riktad signaler varierade från 0-10 BL/s (i steg om 2), som spänner över det intervall av hastigheter som normalt anses återspegla ihållande, långvarig, eller burst simning lägen aktivitet i Fish¹². På kontrollnivå, 0, var ledaren silhuetter orienterade mot en destination arm bland de slumpmässigt orienterade distraktorer, men ingen av silhuetter flyttas. Destinations armen valdes slumpmässigt för varje provversion av programmet. Avståndet enheter är i kroppslängd, som definierades av medelvärdet standard längd av våra ämnen, och tiden är i sekunder. Den nuvarande representativa analysen fokuserar på att mäta primära responsvariabler (besluts hastighet och noggrannhet), men utformningen av experimentet gör det också möjligt för utredarna att extrahera ytterligare information genom att spåra motiv rörelser och analysera deras Kinematik.

Våra fisk ämnen var inrymt efter avsnitt 6 i protokollet. Varje ämne exponerades för en nivå av behandlingen per dag. Vi randomiserades både inom ämnet behandlingsnivå (Cue-hastighet) över dagar och den ordning som Försökspersonerna testades på varje dag. Linjära och generaliserade linjära blandade effekter modeller (LMM och GLMM, respektive) användes för att testa effekterna av ledaren Silhouette hastighet på hastighet och noggrannhet med vilka ämnen följt visuella stimuli. Ämnes-ID ingick som slumpmässig effekt i båda modellerna.

Data och resultat

I avsaknad av några motion Cues Golden Shiner fungerade som förväntat och valde sin riktning slumpmässigt (stimulus Speed = 0, binomial test, n_vänster= 33, n_höger= 40, = 0,45, P = 0,483). Medan de flesta försökspersoner visade inga tecken på stressande beteende inom domänen och fattat ett avgörande beslut inom den tilldelade tiden (5 min), 22% av försökspersonerna visade en ovilja att lämna jordbruksområdet eller gå in i besluts området. Data från dessa obeslutsamma fiskar ingick inte i analysen. De återstående 78% av våra försökspersoner visade en signifikant förbättring av noggrannheten med vilken de följde riktnings stimuli som hastigheten på dessa stimuli ökade (GLMM, z = 1,937, P = 0,053). Figur 5a visar arten av detta förhållande, där vi hittar en 1,2-faldig ökning av riktnings noggrannhet för varje ökning av stimulans hastighet nivå. Denna relation är endast blygsamt oproportionerlig och är inte, i sig, suggestiv av ett tröskelvärde svar på förändringar i Cue hastighet. Ökningar i Stimulus Speed ledde också till en signifikant ökning av besluts hastigheten (LMM, F_{1, 56}= 4,774, P = 0,033). Men som framgår av Figur 5b var trenden i besluts hastigheten inkonsekvent och mycket varierande över stimulus Speed-nivåer. Vad som framgår i dessa beslut hastighetsdata är att det tog försökspersoner, i genomsnitt, någonstans från 5-20x längre tid att fatta sitt beslut när stimuli rörde sig än när de inte var (besluts hastigheter på 4,6 ± 2,3 s och 81,4 ± 74,7 s för stimulans hastigheter på 0 respektive 8, ± standardavvikelse, SD). Faktum är att utan kontrollnivå hittade vi ingen betydande förändring i besluts hastighet som en funktion av stimulans hastighet.

Figur 1. Y-labyrint domän. A. bild av Y-Maze-apparaten för beslutsfattande. Anteckningar representerar följande: Håll område (HA, grön), beslutsområde (DA, blå), vänster besluts arm (LDA), och höger besluts arm (RDA). B. bild av Y-labyrint och rum med overhead justerbar spår belysning och GigE Kameraplacering (endast en av de fyra omkostnader ljus remsor är synliga). C. bild av Y-labyrinten (sidovy) inklusive projektorns placering som låses av glid vagnen för att eliminera rörelser under, eller mellan, prövningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Bakgrunds-och stimulans kalibrering. A. bild av den upplysta Y-labyrinten med en enhetlig bakgrundsfärg och en transekt av pixelintensitet (grön linje) mellan holdingområdet och besluts området, da (genomsnittlig pixelintensitet 112 ± 1278). Ljus lutningen som genereras av projektorns glödlampa (hotspot) är tydligt synlig. B. bild som visar justeringen av projektionerna med da. C. bild av labyrinten med den filtrerade bakgrunden och en ensam silhuett projiceras i mitten av da för kalibrering (storlek, hastighet). Tillsatsen av kontrad gradient bakgrund i (C) resulterar i en mörkare bakgrund (genomsnittlig pixel intensitet 143,1 ± 5,5) och mycket mindre rumslig variation (koefficienten variation droppar från 11,4 (A.) till 0,03 (C.). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Schematiskt av det allmänna flödet av operationer i visualiserings programmet som används i experimenten. För ytterligare procedur detaljer se⁷. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Experimentell rättegång med både riktiga och virtuella fisksilhuetter. A. bild a (Live) Golden Shiner lämnar anläggningen området (grön cirkel). B. bild av en (levande) gyllene Shiner i besluts området (grön cirkel) bland de virtuella fisk silhuetter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Noggrannhet och hastighet av riktade svar på förändringar i den relativa hastigheten på rörelsesignaler. A. Graf över fisk beslutet noggrannhet med vilken Golden Shiner följde "Leader" silhuetter plottas mot stimulus Speed (bl/s). B. Graf över fisk besluts hastigheten plottas mot stimulus Speed (bl/s). Data är medel ± standardfel, SE. grupper om 15 virtuella silhuetter var slumpmässigt fördelade i hela besluts zonen med en 67% enhetlighet nivå (10 av de 15 silhuetter fungerade som ledare, de återstående 5 silhuetter agerade som distraktorer) och vi varierade Rusat av ledarna från 0-10 BL/s. distractor rusar återstod fixade på 1 BL/s på alla rusar jämnar, undantar kontrollera i vilket ingen av silhuetterna gick. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Visuell ledtrådar är kända för att utlösa ett optomotor svar i fisk som utsätts för svarta och vita galler¹³ och det finns ökande teoretiska och empiriska belägg för att grannens hastighet spelar en inflytelserik roll i styrningen av dynamiska interaktioner observerats i fisk skolor^{7,14,15,16,17}. Kontrasterande hypoteser finns för att förklara hur individer i grupper integrera granne rörelser, som reagerar proportionellt på alla urskiljbara signaler¹⁴, anta en motion-tröskel svar¹⁷, eller övervakning kollisionstid ¹⁸. ett första steg i att testa dessa alternativa hypoteser är validering av deras underliggande antaganden. Här har vi visat nyttan av vårt protokoll för att identifiera den roll som en viss sensorisk funktion kan ha på vägledande beslut.

Vi isolerade hur individer av en social fiskarter, Golden Shiner, svarade på förändringar i den relativa hastigheten på visuella stimuli för att efterlikna artfränder i en skola. Golden Shiner riktnings noggrannhet förbättras med ökningar i den relativa hastigheten på visuella stimuli, men det funktionella förhållandet mellan dessa variabler var bara marginellt oproportionerligt. Förhållandet mellan besluts hastighet och stimulans hastighet, medan betydande, var mycket varierande och inkonsekvent. Resultaten visar dock att en hastighetsskillnad som finns i bilder spridda över synfältet av dessa fiskar spelar en viktig roll i att utlösa ett svar och vägleda deras öppen uppmärksamhet. Retas isär hur individer väljer bland de åtgärder av specifika grannar kan vara sonderade med den nuvarande utformningen genom att införa motstridiga riktningar i stimuli.

I ett nyligen experiment med zebrafisk, Danio rerio, hittade vi inga bevis på obeslutsamhet i solitära prövningar⁷, men Golden Shiner i denna demonstration visade en större motvilja att lämna jordbruksområdet. Skillnaderna mellan dessa två arter kan förklaras av deras livshistoria strategier och den relativa styrkan i deras sociala tendenser (eller tillit). Zebrafish verkar Visa mer varierande social enhetlighet än Golden shiners (t. ex. fakultativt kontra obligate schoolers³). Det är troligt att den starkare sociala samstämmigheten i Golden Shiner kan ha bidragit till ämnen som visar högre nivåer av blyghet, eller tveksamhet inom domänen än deras zebrafiskar motsvarigheter.

Ordningen på stegen är subtil men kritisk i protokollet. Processen att balansera lamporna, projektorn och program filtret kan ta längre tid än väntat för nya domäner. I detta protokoll har lärdomar tagits med för att minska tiden för inställning och ljusbalans, såsom användning av spår lampor som reflekterar från väggen (inte på domänen), justerbara ljus styrenheter och programgenererade filter för projektorn. Tänk också på att det som kan tyckas vara visuellt acceptabelt för det mänskliga ögat inte kommer att ses av kameran och programvara på samma sätt, så dina ljusförhållanden kan kräva ytterligare justeringar. Även smärre ändringar i bildskärms vinklar resulterar i bakgrundsotonbyten. Sålunda, detaljerad anteckning och spara filinställningar kommer att kraftigt minska sannolikheten för förändringar som inträffar under experimentet. Att gå igenom processen från fysisk till filtrering, som presenteras här, ger de snabbaste stegen till framgång.

Användningen av en ST-projektor möjliggör större rumslig flexibilitet över en bildskärm, men den här metoden skapar en oönskad visuell avvikelse som kallas en "hotspot". En hotspot är en ljuspunkt på projektionsytan som skapas av närheten till projektorns glödlampa. I protokollet, avsnitt 4 ägnades åt skapandet av bakgrunds filter och kontroll för homogena blixtar över hela domänen. De steg som anges här hjälper användarna att undvika, eller minimera, oönskade effekter av hotspot genom modellering någon oönskad gradient och använda modellen för att återge en omvänd gradient för att motverka effekterna. Slutligen kan ST-projektorns modell variera, men bildjusteringar (rotera, vänd, främre eller bakre skärmprojektion) och Keystone-korrigering (± 3-5 grader) är användbara funktioner för att säkerställa att lust bilden passar domänen och kan justeras för distorsion.

Med tiden uppdaterades experimentella rum för enkelheten genom förändringar i hårdvaran (dvs. kameror, kablage, grafikkort, bildskärmar). Det är anmärkningsvärt att nämna att maskinvaruförändringar sannolikt kommer att resultera i ytterligare starttid för att balansera belysning och arbeta igenom eventuella programfrågor. Därför rekommenderas att all hårdvara är dedikerad till ett system tills slutförandet av de önskade experimenten. De flesta utmaningarna har varit knutna till prestanda skillnader mellan bildskärmar, grafikkort och kamerorna som ibland resulterar i förändring av programmeringskoden. Sedan tiden för detta arbete har nya domäner utvecklats där den inre testdomänen kan tas bort och växlas för andra testdomäner. Vi rekommenderar denna flexibilitet övervägas när du utformar experimentella domäner och stödstrukturer.

Det nuvarande protokollet gör det möjligt för utredarna att isolera och manipulera visuella funktioner på ett sätt som både återspeglar den visuella miljön som förväntas inom en skola, samtidigt som man kontrollerar för störande faktorer som åtföljer exponering förverkliga artfränder (t. ex. , hunger, förtrogenhet, aggression)⁷. I allmänhet, datoranimering (ca) av virtuell fisk (dvs silhuetter) är en praxis som blir allt vanligare på grund av dess distinkta fördelar i stimulerande beteendemässiga svar^19,20,21. CA tillåter en att anpassa visuella ledtrådar (riktning, snabbhet, enhetlighet, eller morfologi), samtidigt införa en nivå av standardisering och repeterbarhet i önskad stimulans som överskrider vad som kan uppnås när du använder levande djur som stimulerande. Användningen av virtuell verklighet i beteendemässiga studier, på både djur²² och människor²³, ökar också stadigt och lovar att bli ett kraftfullt empiriskt verktyg som tekniken blir mer tillgänglig och tractable. Sammantaget, dessa virtuella metoder också ersätta och minska de levande djur kraven i djur etik inom vetenskapen (t. ex., IACUC, AAALAC, och ACURO)²⁴, medan samtidigt sänka laboratoriekostnader och bördor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black and white IP camera	Noldus, Leesburg, VA, USA		https://www.noldus.com/
Extruded aluminum	80/20 Inc., Columbia City, IN, USA	3030-S	https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets	Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA		http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners	Saul Minnow Farm, AR, USA		http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware	National Institute for Health (NIH), USA		https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting	Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA	BR20MW-M4	https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl	651Vinyl, Louisville, KY, USA	651-010M-12:5ft	http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector	Epson, Long Beach CA, USA	V11H605020	https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware	Processing Foundation		https://processing.org/
R (3.5.1) freeware	The R Project for Statistical Computing		https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen	Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA	1950	https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system	Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA		https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.