Summary
في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا
Abstract
الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) إنزيم مشتركة المعرب عنها في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة على حد سواء. أنه يحفز التحلل المائي للفوسفات مونوستيرس من العديد من الجزيئات في الأس الهيدروجيني القاعدي ويلعب دوراً لا غنى عنه في استقلاب الفوسفات. في البشر، وألب حقيقية النواة واحدة من الإشارات الانزيمية الأكثر استخداماً في تشخيص الأمراض المختلفة، مثل ركود صفراوي والكساح. في س. تم الكشف عن المكوّرات، الب حصرا على غشاء الخلية؛ وأعربت هو أيضا كنموذج افرازية، وكذلك. ومع ذلك، يعرف الكثير عن وظيفتها في تشكيل بيوفيلم.
والغرض من هذه المخطوطة هو القيام مقايسة سريعة ويمكن الاعتماد عليها لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم التي لا تتطلب عزل البروتين. استخدام الفوسفات p-نيتروفينيل (بنب) كركيزة، قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم شكلت في لوحات زراعة الأنسجة 96-جيدا. نشاط يستند تشكيل رد فعل للذوبان المنتج تقاس 405 نانومتر امتصاص. طبيعة إنتاجية عالية الأسلوب لوحة 96 زراعة الأنسجة جيدا يوفر طريقة حساسة واستنساخه لفحوصات نشاط حزب العمال الأسترالي. كما يمكن توسيع نفس تجريبي إعداد لقياس المؤشرات الجزيئية خارج الخلية الأخرى المتصلة بتشكيل بيوفيلم.
Introduction
وأعرب الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) هو أوبيكويتوسلي في كل خلايا بدائية وحقيقية النواة1. فإنه يمكن تحفيز التحلل الأدينوزين من جزيئات مختلفة مثل النيوكليوتيدات والقلويات، استرات الفوسفات والبروتينات أو أملاحه من حامض الفوسفوريك. في البشر، وألب حقيقية النواة الحالية في العديد من الأنسجة بما فيها الكبد والعظام و الأمعاء والمشيمة2. وهي تلعب أدواراً هامة في الفسفرة البروتين ونمو الخلايا، والمبرمج، وعمليات الخلايا الجذعية، فضلا عن تمعدن الهيكل العظمى العادي. الب حقيقية النواة أيضا مؤشر مصل رئيسية لوجود أمراض في العظام والكبد والأنسجة/الأجهزة الأخرى عند ارتفاع3،4.
تم الكشف عن الب بدائية في مجموعة متنوعة من الخلايا البكتيرية، بما في ذلك كولاي5و المذهبة س.6،7 وبعض البكتريا الكرش الشائعة في التربة8. وقد استخدمت البكتيرية الب النشاط بيوسينسور في الكشف عن مبيدات الآفات والمعادن الثقيلة9 والتلوث البكتيري10. وقد استخدمت التعبير التأسيسي لحزب العمال الأسترالي لتحديد العنقوديات11 والتفريق بين السراتية عن12. ومن المقترح كذلك أن التأسيسي الب الإنتاج يرتبط بالقدرة الإمراضية في العنقوديات13. على الرغم من أن حزب العمال الأسترالي ودرست في إعدادات مختلفة3،4، بعد قليل يقال للدالة في الثقافات الأغشية الحيوية والنشاط.
وتم توثيق بيوفيلم لحياة بكتيرية تعمل بشكل مختلف بالمقارنة نظيره الخلايا البكتيرية الشرانق14. في المذهبة س.، تم التعرف على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية وحسابات لمقاومة المضادات الحيوية والتهاب مزمن15،16. أبلغ العديد من الجزيئات التي يمكن العثور عليها في مصفوفة بيوفيلم مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون، ولكن هذه الآلية لتشكيل بيوفيلم ليست مفهومة تماما14. لفهم دور الب في تشكيل بيوفيلم، مثقف الأغشية الحيوية في المذهبة س. في 96 زراعة الأنسجة ولوحات، وقياس النشاط الب باستخدام الفقرة--نيتروفينيلفوسفاتي (بنب).
بنب جزيء هو ركيزة جاهزة للاستخدام لحزب العمال الأسترالي، وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس الب النشاط6،،من1718. يستند هذا الفحص اللونية تحويل فوسفات نيتروفينيل الفقرة (بنب) إلى الفقرة-نيتروفينول أسفر عن منتج ملونة في 405 نانومتر. مقارنة بسائر الإنزيم الب التقليدية، مثل [اغروس] هلام التفريد19، جرثومة القمح أجلوتينين (WGA) هطول الأمطار، ووغ-[هبلك]20، هذا التحليل محددة للغاية، حساسة، سهلة للتكاثر، ومعظم الأهم من ذلك، يسمح لارتفاع سرعة النقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد متوسطة
- تحضير 1 لتر من مرق الصويا تريبتيك (TSB): إضافة إلى 1 لتر من الماء المقطر، 15 غرام خلاصة البنكرياس الكازين، 5 غ خلاصة بابيك فول الصويا، والجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام من سكر العنب و 2.5 غرام من فوسفات ديبوتاسيوم. تعقيمها قبل الاستخدام.
- إضافة لاجار الصويا تريبتيك (TSA)، 15 غراما أجار إلى 1 لتر TSB، اﻷوتوكﻻف. ثم ندعه يبرد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، صب بنسبة 20 مل في طبق بتري (100 ملم × 15 ملم).
- بيوفيلم الثقافة المتوسطة: إضافة 10 جرام جلوكوز إلى 1 لتر TSB يعقم. تعقيم بالترشيح باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون.
2-"تشكيل بيوفيلم" S. aureus في لوحة زراعة الأنسجة جيدا 96
ملاحظة: هو مثقف بيوفيلم المذهبة س. كما هو موضح سابقا6،21.
- تطعيم مستعمرة فردية واحدة في المذهبة س. من حساب السياحة الفرعي في 10 مل لجان وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل TSB/الجلوكوز (10 غرام/لتر) بنسبة 1: 100 (v/v). الدوامة بلطف مزيج لتركيز متسقة.
- نقل 200 مل ثقافة المخفف إلى ما مجموعة 18 بئرا (أكثر للمجموعات التجريبية، مثل عنصر تحكم غير بيوفيلم لتشير إلى وجود علاقة ل نشاط حزب العمال الأسترالي6) من لوحة واحدة 96 جيدا. استخدم ثلاثة توائم لكل نقطة الوقت: 0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة ودقيقة 75. راجع الخطوة رقم 3.2.
- احتضان 96 لوحة جيدا في 37 درجة مئوية ح 24 عن بيوفيلم تشكيل6،21.
- صب المادة طافية بالطموح.
- تغسل كل جيدا مع 1 × الحل الفوسفات مخزنة (PBS، درجة الحموضة 7.4)، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15,000 س ز وصب المادة طافية بالطموح.
3-قياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم
ملاحظة: وتم قياس نشاط حزب العمال الأسترالي ك وصف6،18.
- إضافة 75 مل الركازة الب مخزنة تتألف من بنب المتاحة تجارياً لكل بئر من الخطوة 2.6 وبدء تسجيل الوقت. تسجيل كل نقطة الوقت في ثلاث نسخ.
- بعد حضانة لوقت متنوعة: 0 دقيقة (تحكم) 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة و 75 دقيقة على التوالي، إضافة ميليلتر 75 من هيدروكسيد الصوديوم م 5 التوقف عن رد فعل.
- الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 15,000 س ز.
- نقل 100 ميليلتر من المادة طافية في لوحة جيدا 96 جديدة للقياس اللونية.
- قياس امتصاص كل جيدا في 405 نانومتر باستخدام لوحة 96 كذلك القارئ. استخدام الوقت 0 دقيقة نقطة الآبار للسيطرة على 405 الضوضاء الخلفية في شمال البحر الأبيض المتوسط.
- تكرار التجربة كاملة في ثلاث لوحات جيدا 96 الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 نتيجة نشاط حزب العمال الأسترالي من الثقافات بيوفيلم في المذهبة س. ممثل في 96 زراعة الأنسجة ولوحات. ميكروليتر 75 من الحلول المتاحة تجارياً بنب أضيفت إلى كل خير والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة للأوقات المختلفة (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة و 75 دقيقة، على التوالي) أضيفت ميكروليتر 75 من 5 م هيدروكسيد الصوديوم إلى التوقف عن رد فعل. ثم تم قياس المنتج في قارئ لوحة جيدا 96 في 405 نانومتر. كل نقطة الوقت تكررت في ثلاثة توائم من صفيحة جيدا 96 واحدة، وتكررت التجربة كاملة في 3 لوحات جيدا 96 الفردية.
رقم 1: S. aureus بيوفيلم الثقافات كانت المحتضنة مع الركازة بنب لزمنية مختلفة (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة و 75 دقيقة) وتم قياس نشاطهم الب في 405 نانومتر. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في أعمالنا المقايسة، استخدمنا بنب الركيزة الب. هذا حل عمل المصممة لإليزا ولا تمييع المسبق. بعد التحلل من حزب العمال الأسترالي، يطور منتج أصفر ويمكن أن يقاس في 405 نانومتر. في نهاية رد فعل الانزيمية، نحن بإيجاز تثفيل 96 لوحة جيدا ونقل المادة طافية إلى صفيحة جيدا 96 جديدة لقياس امتصاص استخدام قارئ لوحة. لقد وجدنا أن هذه الخطوة الإضافية استخدام الطرد المركزي بالغة الأهمية، حيث أنه يزيد من اتساق امتصاص في 405 نانومتر، ربما عن طريق القضاء على أي خلايا معلقة ممكن المتكبدة أثناء التفاعل الأنزيمي.
لتكوين بيوفيلم، نستخدم 200 ميكروليتر من إضعاف 1: 100 (v/v) للثقافة بين عشية وضحاها كما ذكرت6،21. هذا هو تمييع الأمثل ل المكوّرات س. لتشكيل بيوفيلم مقارنة بغيرها تخفيف (البيانات لا تظهر). نظراً لأن الغرض من هذه الورقة لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في بيوفيلم، من المهم الحفاظ على ظروف الثقافة بيوفيلم الأمثل. كذلك أكد هذا الخيار في استخدام الجلوكوز في 10 غرام/لتر ل النمو الأمثل بيوفيلم6. تحتاج إلى تركيز الغلوكوز وعامل إضعاف الأمثل إذا كانت الخلايا البكتيرية المختلفة المستخدمة لتكوين بيوفيلم.
خلال احتضان ثقافة بيوفيلم مع الركازة بنب، سوف يستغرق الوقت للمنتج الملونة لتطوير. قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي بعد 15 و 30 نقاط زمنية دقيقة وعندما يحتفل صفراء اللون مرئية. مع تركيز الحالية، لاحظنا زيادة نشاط حزب العمال الأسترالي ليصل إلى 75 دقيقة كما هو مبين في الشكل 1. بعد 75 دقيقة، لوحظ عدم زيادة نشاط حزب العمال الأسترالي.
وأخيراً، نظراً لحزب العمال الأسترالي في المذهبة س. غشاء حصرياً ملزمة البروتين7، يمكن اختبار نشاطها دون تحلل الخلية. هناك فوائد مقايسة نشاط إنزيم تتطلب تدمير كل خلية. جدير بالذكر أن تؤتي عملية عزل البروتين أحياناً انخفاض نشاط إنزيم كمية22. ومع ذلك، لا يمكن استخدام هذا البروتوكول إذا لم تكن الب في النموذج المنضم لها غشاء.
كما ذكر سابقا6، هو ارتفاع نشاط حزب العمال الأسترالي في الثقافة بيوفيلم مقارنة بنظيرتها أفلاطوني. ويمكن تمديد الإعدادات التجريبية المستخدمة في الدراسة الحالية للتحقيق في العوامل/المركبات التي تؤثر على نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم. سوف توفر النتائج المستخلصة من هذه الدراسات الإضافية من التبصر في كيفية التحكم في تشكيل بيوفيلم الجرثومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر وليام Rainey هاربر كلية وجامعة إلينوي في شيكاغو لمرفق لإجراء هذه التجارب. كما نشكر "مؤسسة ماكجرو هيل" على دعمها السخي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
