Summary
В этой рукописи мы создали метод высокую пропускную способность для количественного определения активности щелочной фосфатазы в S. aureus биопленки культуры от 96-луночных культуры ткани пластины
Abstract
Щелочная фосфатаза (ALP) является общим фермент выразил в клетках прокариот и эукариот. Он катализирует гидролиз фосфат monoesters от многих молекул базовых pH и играет незаменимую роль в метаболизме фосфат. В организме человека эукариотических ALP является одним из наиболее часто используемых ферментативные сигналов в диагностики различных заболеваний, таких как холестаза и рахита. В S. золотистого стафилококка, ALP обнаруживается исключительно на клеточной мембраны; также выражается как секреторной формы также. Тем не менее мало что известно о ее функции в биопленки.
Цель этой рукописи заключается в разработке быстрого и надежного анализа для измерения активности ALP биопленки S. aureus , которые не требуют изоляции белка. С помощью p нитрофенил фосфат (pNPP) как субстрат, мы измерили ALP деятельность биопленки S. aureus , образованная в 96-луночных тканевой культуры пластин. Деятельность была основана на образовании продукта растворимых реакции, измеряется 405 нм поглощения. Высокая пропускная способность характер метода 96 хорошо культуры ткани пластины обеспечивает чувствительных и воспроизводимый метод для анализов деятельности ALP. То же экспериментальная Настройка также может распространяться для измерения других внеклеточного молекулярных маркеров, связанных с биопленки.
Introduction
Щелочная фосфатаза (ALP) повсеместно выражается в обеих клеток прокариот и эукариот1. Он может катализировать гидролиз монофосфат от различных молекул, таких как нуклеотидов, белки, алкалоиды, фосфатные эфиры и ангидриды фосфорной кислоты. В организме человека эукариотических ALP присутствует во многих тканях, в том числе печень, кости,2кишечника и плаценты. Она играет важную роль в фосфорилирование белков, рост клеток, апоптоз, стволовых клеток процессов, а также обычных скелетной минерализации. Эукариотические ALP также является показателем ключевых сыворотки на наличие заболеваний костей, печени и других тканей/органов при повышенных3,4.
Прокариот ALP был обнаружен в различных бактериальных клеток, включая E. coli5, S. aureus6,7 и некоторых распространенных бактерий рубца в почвах8. Бактериальной активности ALP был использован как биосенсора для обнаружения пестицидов, тяжелых металлов9 и10бактериального загрязнения. Учредительный выражение ALP был использован для идентификации стафилококков11 и дифференцировать Serratia Enterobacter12. Далее предлагается, что учредительный ALP производства связана с патогенностью стафилококки13. Хотя ALP был изучен в различные параметры3,4, еще мало сообщается, для его деятельности и функции в биопленке культур.
Биопленки были задокументированы, чтобы иметь по-разному функционирования бактериальной жизни по сравнению с его коллегой Свободноживущие бактериальной клетке14. В S. aureusобразование биопленки была выявлена в различных клинических условий и счетам по антибиотикорезистентности и хроническое воспаление15,16. Было сообщено много молекул можно найти в матрицу биопленки например полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и липидов, но механизм биопленки не полностью понял14. Чтобы понять роль ALP в биопленки, мы культивировали S. aureus биопленки в 96 хорошо культуры ткани пластины и измеряли активность ALP, используя пункт nitrophenylphosphate (pNPP).
PNPP молекула является готовым субстрат для ALP и широко используется для измерения ALP деятельности6,17,18. Этот assay колориметрические основывается на преобразование пункт нитрофенил фосфат (pNPP) в пункт нитрофенола результате цветные продукт на 405 нм. По сравнению с другими обычными пробирного ALP, такие как гель агарозы электрофореза19, зародышей пшеницы агглютининов (WGA) осадков, и WGA-ВЭЖХ20, этот assay весьма специфический, чувствительной, легко воспроизвести и, самое главное, позволяет для высокой пропускная способность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Средний подготовка
- Подготовка 1 Л Tryptic соевый бульон (БСЭ): В 1 Л дистиллированной воды, добавить 15 g поджелудочной железы дайджест казеина, 5 g papaic дайджест соевого жмыха, 3 g хлорида натрия, 2,5 г декстрозы и 2,5 г калия фосфата. Стерилизуйте перед использованием.
- Для Tryptic соевый агар (TSA), добавить 1 Л TSB, 15 г агара автоклава. Затем дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем налейте в соотношении 20 мл на Петри блюдо (100 x 15 мм).
- Биопленки питательной среды: добавить 10 г глюкозы в 1 Л газобетона TSB. Стерилизуют фильтрацией, с помощью фильтра 0,2 мкм.
2. S. aureus биопленки в 96 хорошо культуры ткани пластины
Примечание: S. aureus биопленки культивировали как описано6,21.
- Прививок одной отдельные колонии S. aureus от TSA в 10 мл TSB и расти на ночь при 37 ° C.
- Разбавьте ночь культуры в 10 мл TSB/глюкозы (10 г/Л) в соотношении 1: 100 (v/v). Вихревой мягко, чтобы смесь для постоянной концентрации.
- Перевести 200 мл разбавленной культуры на в общей сложности 18 скважин (больше для экспериментальной группы, такой элемент управления не биопленки предложить связь с ALP деятельности6) от одного 96 хорошо пластины. Используйте триплетов для каждой точки времени: 0 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин и 75 мин. Смотрите Шаг 3.2.
- Инкубируйте 96 хорошо пластины при 37 ° C в течение 24 ч для6,образование биопленки21.
- Декант супернатант путем аспирации.
- Мыть каждый хорошо с 1 x раствора фосфатного буфера (PBS, рН 7,4), центрифуги для 5 мин на 15000 x g и сцеживаться супернатант путем аспирации.
3. измерение активности ALP S. aureus биопленки
Примечание: Как описано в6,18измеряли активность ALP.
- Добавьте 75 мл буферизации ALP субстрат, состоящий из коммерчески доступных pNPP для каждой скважины от шага 2.6 и начать запись времени. Запишите каждый момент времени в трех экземплярах.
- После инкубации разнообразный время: 0 мин (управления), 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин и 75 мин соответственно, мкл 75 5 M NaOH остановить реакции.
- Центрифуга пластину для 5 мин на 15000 x g.
- Перевести 100 мкл супернатант в новой 96 хорошо пластины для колориметрических измерений.
- Измерение оптической плотности каждого на 405 нм с помощью 96 хорошо пластины читателя. Используйте 0 мин время точки скважин для контроля 405 нм фоновый шум.
- Повторите весь эксперимент в трех отдельных 96 хорошо пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает представитель результат деятельности ALP от биопленки культур S. aureus в 96 хорошо культуры ткани пластины. 75 мкл раствора коммерчески доступных pNPP был добавлен в каждый хорошо и инкубируют при комнатной температуре. После инкубации для разных времен (0 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин и 75 мин, соответственно) 75 мкл 5 M NaOH был добавлен для остановки реакции. Продукт затем измеряется в 96 хорошо пластины читателя на 405 нм. Каждый момент времени было повторено в тройняшек из одного 96 хорошо плиты, и весь эксперимент был повторен в 3 отдельных 96 хорошо пластины.
Рисунок 1: S. aureus биопленки культур были инкубировали с pNPP субстрат для различных время (0 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин и 75 мин) и их ALP активность была измерена на 405 нм. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашем assay мы использовали pNPP как ALP субстрата. Это рабочее решение предназначенных для ELISA и неразбавленный необходим. После гидролиза, ALP, желтый продукт развивается и может быть измерена в 405 нм. В конце ферментативные реакции мы кратко центрифугировали 96 хорошо пластины и переданы свежие 96 хорошо пластины для измерения оптической плотности, используя читателя пластины супернатант. Мы обнаружили, что этот дополнительный центрифугирования шаг очень важен, так как это увеличивает согласованность поглощения на 405 нм, вероятно, устраняя любые возможные приостановлено клетки, понесенные при ферментативной реакции.
Для биопленки мы используем 200 мкл разбавления 1: 100 (v/v) для ночь культуры как сообщил6,21. Это оптимальное разведение для S. aureus сформировать биопленки, по сравнению с другими разведений (данные не показаны). Поскольку цель этого документа – для измерения активности ALP биопленки, важно, что мы сохранить оптимальные биопленки культуры условий. Это было подчеркнуто на выбор в использовании глюкозы в 10 г/Л для оптимального биопленки роста6. Концентрация фактор и глюкозы разрежения необходимо оптимизировать если различные бактериальные клетки используются для биопленки.
Во время инкубации биопленки культуры с pNPP субстрата потребуется время для цветных продукта для разработки. Мы измерили ALP активности после 15 и 30 мин время очки, которые, когда наблюдается видимый желтый цвет. С текущей концентрации мы заметили повышение активности ALP до 75 минут, как указано на рисунке 1. После 75 мин было отмечено никакого увеличения активности ALP.
Наконец поскольку ALP в S. aureus является исключительно мембраны связаны белка7, ее деятельность может испытываться без лизис клеток. Есть преимущества для assay активность фермента, который не требует уничтожения всей ячейки. В частности процесс изоляции белка иногда может принести меньше количество активных ферментов22. Однако этот протокол не может использоваться, если ALP находится не в его мембраны присоединенную форму.
Как сообщалось ранее6ALP активность возводится в биопленки культуры по сравнению с его коллегой Платоническая. Экспериментальные параметры, используемые в текущем исследовании может быть продлен расследовать факторы/соединений, которые влияют на активность ALP S. aureus биопленки. Результаты этих исследований будет предоставлять дополнительную информацию о том, как управлять бактериальные биопленки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Уильям Рэйни Харпер колледж и Университет Иллинойса в Чикаго для объекта для проведения этих экспериментов. Мы также благодарим фонд McGraw Хилл за их щедрую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
