Summary
כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן
Abstract
אלקליין פוספטאז (ALP) הוא אנזים נפוצות הביע בתאים prokaryotic והן האיקריוטים. זה ה מזרז הידרוליזה של פוספט monoesters של מולקולות רבות ב- pH בסיסי והוא ממלא תפקיד חיוני בחילוף החומרים פוספט. בבני אדם, ALP האיקריוטים הוא אחד האותות אנזימטי שנמצאות בשימוש תכוף ביותר באבחון מחלות שונות, כגון לחסימת מרה תוך כבדית, רככת. ב- S. aureus, ALP מזוהה באופן בלעדי על קרום התא; זה מתבטא גם כטופס הפרשה גם כן. ובכל זאת, מעט מאוד ידוע על תפקודו של ביופילמים.
מטרתו של כתב יד זה היא לפתח וזמינותו מהיר ואמין למדידת פעילות ALP biofilm S. aureus שאינה דורשת בידוד חלבון. באמצעות פוספט p-nitrophenyl (pNPP) כמו מצע, מדדנו פעילות ALP biofilm S. aureus שהוקמה בשנת 96-ובכן תרביות רקמה צלחות. הפעילות מבוססת על היווצרות של המוצר מסיסים התגובה נמדד על ידי ספיגת 405 ננומטר. מהות השיטה צלחת 96 תרביות רקמה טוב תפוקה גבוהה מספק שיטה לשחזור והרגיש ALP פעילות מבחני. ניתן להאריך אותו הדבר הניסיונית להגדיר גם למדוד סמנים מולקולריים חוץ-תאית אחרים הקשורים ביופילמים.
Introduction
אלקליין פוספטאז (ALP) מתבטא ubiquitously בשני תאי האיקריוטים prokaryotic ו-1. זה יכול לעודד את הידרוליזה של monophosphate של מולקולות שונות כגון נוקלאוטידים, חלבונים, אלקלואידים, אסטרים פוספט ו- anhydrides של חומצה זרחתית. בבני אדם, ALP האיקריוטים קיים ברקמות רבות, כולל הכבד, עצם, המעי ו השליה2. זה משחק תפקידים חשובים זירחון חלבונים, צמיחת תאים, אפופטוזיס, תהליכים בתאי גזע, כמו גם מינרליזציה השלד נורמלי. ALP האיקריוטים הוא גם מחוון מפתח נסיוב לנוכחות של מחלות עצם, כבד, ובאיברים אחרים רקמות/כאשר מוגבה3,4.
Prokaryotic ALP זוהתה במגוון של תאים חיידקיים, כולל e. coli5,6, S. aureus7 וכמה חיידקים שכיחים של כרס מעלי גרה קרקעות8. פעילות ALP חיידקי שימשה ביוסנסור זיהוי חומרי הדברה, מתכות כבדות9 ו זיהום בקטריאלי10. הביטוי המכונן של ALP שימש כדי לזהות Staphylococci11 וכדי להבדיל בסרישיה Enterobacter12. בהמשך הוא הציע כי ייצור ALP המכונן הוא מתואם עם פתוגניות staphylococci13. למרות ALP נחקרה הגדרות שונות3,4, עדיין מעט הוא דיווח על הפעילות שלה פונקציה בתרבויות biofilms.
ממבנה biofilm תועד חיים חיידקי מתפקדת באופן שונה לעומת שלו עמיתו של תא החיידק אל-אווירני עצמאי14. ב- S. aureus, היווצרות biofilm זוהתה במגוון תנאים קליניים וחשבונות עמידות לאנטיביוטיקה, דלקת כרונית15,16. דווח כי הרבה מולקולות להימצא במטריצה biofilm כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, אך המנגנון של ביופילמים אינו מובן במלואו14. כדי להבין את התפקיד של ALP ב ביופילמים, אנו תרבותי S. aureus biofilms ב 96 תרביות רקמה טוב צלחות, מדדו את הפעילות ALP באמצעות פארא-nitrophenylphosphate (pNPP).
כבר בשימוש נרחב כדי למדוד ALP פעילות6,17,18, והיא מצע מוכן לשימוש עבור ALP pNPP המולקולה. זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים המבוסס על ההמרה של פוספט פארא-nitrophenyl (pNPP) כדי פארא-nitrophenol וכתוצאה מכך מוצר צבעוניים-405 ננומטר. לעומת אחרים assay ALP קונבנציונליים, כגון agarose ג'ל אלקטרופורזה19, משקעים agglutinin (WGA) נבט חיטה, WGA-HPLC20, וזמינותו הזה הוא מאוד ספציפי, רגיש, קל, והם הכי חשוב, מאפשר גבוהה תפוקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה בינונית
- להכנת 1 ליטר של ציר סויה Tryptic (TSB): לתוך 1 L של מים מזוקקים, להוסיף 15 גרם של הלבלב תקציר של קזאין, 5 גר' papaic תקציר של ארוחה סויה, דור 3 של נתרן כלורי, 2.5 גר' דקסטרוז ו- 2.5 גר' dipotassium פוספט. לעקר לפני השימוש.
- עבור Tryptic סויה אגר (TSA), להוסיף 15 גרם של אגר 1 ליטר של TSB, החיטוי. אז תן לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. בשלב הבא, יוצקים ביחס של 20 מ"ל לכל צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
- Biofilm תרבות בינוני: להוסיף 10 גרם של גלוקוז 1 ליטר של TSB בלוק. לחטא על-ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 µm.
2. S. aureus ביופילמים בצלחת תרביות רקמה טוב 96
הערה: Biofilm S. aureus הוא תרבותי כפי שתואר לעיל6,21.
- לחסן המושבה בודדים אחד של S. aureus מ TSA 10 מ"ל של TSB ולגדול בן לילה ב 37 º C.
- לדלל את התרבות לילה לתוך 10 מ"ל של TSB/גלוקוז (10 גרם/ליטר) ביחס של 1: 100 (v/v). מערבולת בעדינות כדי לערבב על ריכוז עקבית.
- להעביר 200 מ של תרבות מדולל לתוך סך של 18 וולס (יותר לקבוצות ניסיוני, כאלה שאינם biofilm פקד להציע יחסים ALP פעילות6) מ 96 אחד טוב בצלחת. להשתמש שלישיות עבור כל נקודה בזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות. ראה שלב 3.2.
- דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה biofilm היווצרות6,21.
- Decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- לשטוף כל טוב עם 1 x פתרון פוספט buffered (PBS, pH 7.4), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 15,000 x g ו decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
3. מדידה של ALP פעילות ב- S. aureus Biofilm
הערה: פעילות ALP נמדדה כפי שמתואר6,18.
- להוסיף 75 מ של מצע ALP במאגר המורכב pNPP זמינים מסחרית כדי מכל קידוח מהשלב 2.6 ולהתחיל את הזמן הקלטה. לתעד כל נקודת זמן דולר.
- לאחר דגירה לזמן מגוונת: 0 min (בקרה), 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות, ו- 75 דקות בהתאמה, להוסיף µL 75 של NaOH M 5 כדי לעצור את התגובה.
- Centrifuge את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 15,000 x g.
- העברת µL 100 של תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה טוב 96 למדידה ערכי צבע מוחלטים.
- למדוד את ספיגת מכל טוב-405 ננומטר באמצעות 96 ובכן צלחת הקורא. לנצל את הזמן 0 דקות הצבע בארות כדי לשלוט על רעש רקע של 405 ננומטר.
- חזור על הניסוי כולו בשלושה לוחות טוב 96 בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תוצאה נציג של ALP פעילות מתרבויות biofilm של S. aureus 96 צלחות טוב תרביות רקמה. 75 μL של פתרון זמין מסחרית pNPP נוספה כל טוב, מודגרות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה לזמנים שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות, בהתאמה) μL 75 של 5 M NaOH נוספה כדי לעצור את התגובה. המוצר ואז נמדד קורא צלחת טוב 96-405 ננומטר. כל נקודת זמן חזר על עצמו בשלישיות של לוח אחד טוב 96 ולאחר הניסוי כולו חזר על עצמו ב- 3 לוחות טוב 96 בודדים.
איור 1: S. aureus biofilm תרבויות היו מודגרות עם סובסטרט pNPP זמן שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות, 75 דקות) ואת פעילותם ALP נמדדה ב 405 ננומטר. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב- assay שלנו, השתמשנו pNPP כמו המצע אלפ. זהו הפתרון עובד המיועד אליסה, דילול לא נדרש. לאחר הידרוליזה על ידי ALP, מוצר צהוב מפתחת, ניתן למדוד-405 ננומטר. בסוף התגובה אנזימטיות, אנו בקצרה centrifuged את הצלחת היטב 96, להעביר את תגובת שיקוע צלחת טריים טוב 96 כדי למדוד את ספיגת באמצעות קורא צלחת. מצאנו כי צנטריפוגה נוסף השלב זה קריטי, כיוון שהיא מגבירה את מרקם של ספיגת-405 ננומטר, כנראה על ידי ביטול כל התאים מושעה אפשרי שייגרם במהלך התגובה אנזימטי.
עבור ביופילמים, אנו משתמשים μL 200 לדילול בטחונות (v/v) לתרבות לילה כמו שדווח6,21. זה דילול האופטימלי עבור S. aureus להקים biofilm לעומת אחרים דילולים (נתונים לא מוצג). מאז, מטרת מאמר זה היא למדוד פעילות ALP biofilm, זה היה חיוני לנו מתוחזק biofilm אופטימום תרבות תנאים. זה הודגש עוד יותר לפי הבחירה באמצעות גלוקוז-10 גרם/L biofilm אופטימום צמיחה6. גורם לדילול ריכוז הגלוקוז צריך להיות מותאם במיוחד אם תאים חיידקיים שונים משמשים ביופילמים.
במהלך הדגירה של התרבות biofilm עם סובסטרט pNPP, זה ייקח זמן עבור המוצר בצבע לפתח. מדדנו פעילות ALP לאחר 15 ו-30 דקות עת נקודות כאשר הצבע הצהוב גלוי נצפית. עם ריכוז הנוכחי, הבחנו פעילות ALP מוגבר עד 75 דקות כמצוין באיור1. לאחר 75 דקות, אין עלייה של הפעילות ALP נצפתה.
לבסוף, מאחר ALP ב S. aureus באופן בלעדי ממברנה מאוגד חלבון7, ניתן לבחון את פעילותה ללא פירוק התא. ישנם יתרונות assay פעילות אנזים שלא דורש הרס התא כולו. ראוי לציין, תהליך בידוד חלבון יכולה לעתים להביא כמות האנזים פעיל התחתון22. עם זאת, פרוטוקול זה אינו יכול לשמש אם ALP אינה בצורתו מאוגד ממברנה.
כפי שדווחה בעבר6, פעילות ALP הוא גבוה בתרבות biofilm לעומת המקביל אפלטונית. ניתן להאריך את ההגדרות ניסיוני המשמשות במחקר הנוכחי לחקור גורמים/שאמורות להשפיע על פעילות ALP biofilm S. aureus . ממצאי מחקרים אלה תספק תובנות נוספות כיצד לשלוט ביופילמים חיידקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ויליאם רייני הארפר המכללה, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו במתקן לערוך ניסויים אלה. אנו מודים גם היסוד מקגרו היל על תמיכתם הנדיבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
