Summary
本稿では、96-well ティッシュの培養皿から黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化のアルカリフォスファターゼ活性を定量化する高スループット方法を確立しました。
Abstract
アルカリフォスファターゼ (ALP) は原核生物と真核生物の細胞で発現した一般的な酵素であります。基本的な pH で多くの分子からリン酸モノエステル加水してリン酸の代謝に不可欠な役割を果たしています。ヒトでは、真核生物の ALP は、胆汁うっ滞や佝僂病などの各種疾患の診断に最も頻繁に使用される酵素の信号の一つです。S.細胞膜; 排他的に球菌ALP が検出されました。また同様に分泌形態として表されます。まだ、少しはバイオ フィルム形成の機能について知られています。
本稿の目的は、蛋白質の隔離を必要としない黄色ブドウ球菌バイオ フィルムにおける ALP 活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発することです。P-ニトロフェニル リン酸 (同時) を使用すると、基質として、96-well ティッシュの培養皿で形成された黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおける ALP 活性を測定しました。活動は、405 nm の吸光度を用いて水溶性反応生成物の形成に基づいていた。96 よく組織培養プレート法のスループットの高い自然は、高感度かつ再現性 ALP 活性アッセイ法を提供します。同じ実験のセットアップは、バイオ フィルム形成に関連する他の細胞外の分子マーカーを測定する拡張できます。
Introduction
アルカリフォスファターゼ (ALP) 普遍的、両方の原核生物と真核生物の細胞の1で表されます。核酸、タンパク質、アルカロイド、リン酸エステル、リン酸の無水物などの異なる分子からリン酸の加水分解を触媒することができますそれ。ヒトでは、真核生物の ALP は肝臓、骨、小腸、胎盤の2を含む多くの組織に存在です。それは通常骨格鉱化作用と同様、タンパク質リン酸化、細胞増殖、アポトーシス、幹細胞プロセスで重要な役割を果たしています。真核生物の ALP はまた、骨、肝臓、そして昇格したとき他の組織/臓器の疾患の有無をキー血清指標3,4。
土8にエシェリヒア属大腸菌5、黄色ブドウ球菌6,7いくつかの共通の第一胃内細菌などの細菌細胞の様々 な原核生物の ALP が検出されました。細菌の ALP 活性は、殺虫剤、重金属9および10細菌汚染の検出バイオ センサーとして使用されています。構成式の ALP はブドウ球菌11を識別し、エンテロバクター12からセラチアを区別するために使用されています。さらに、構成の ALP 生産病原性ブドウ球菌13と相関していることをお勧めします。ALP は、異なる設定3,4、研究されているがまだ少しはその活動とバイオ フィルム文化の機能の報告されます。
バイオ フィルムは、その自由生存細菌セル対応14と比較して異なる機能細菌生命に記載されています。黄色ブドウ球菌、さまざまな臨床状態と抗生物質耐性の慢性的な炎症15,16アカウントでバイオ フィルムの形成が確認されました。多くの分子は、多糖類、タンパク質、核酸、脂質などのバイオ フィルム マトリックスに報告されていたが、バイオ フィルム形成のメカニズムは完全に理解した14。バイオ フィルム形成における ALP の役割を理解し、96 のよく組織培養皿で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムを培養し、パラ nitrophenylphosphate (同時) を用いた ALP 活性を測定します。
分子同時は ALP のための準備ができて使用する基板を ALP 活性6,17,18を測定に広く使用されています。この比色定量法は、パラ-ニトロフェノール 405 色製品の結果にパラ-ニトロフェニル リン酸 (同時) の変換に基づいて nm。Agarose のゲルの電気泳動法19、小麦胚芽凝集素 (WGA) 沈殿物および WGA HPLC20、この試金は非常に特定のように、他の従来の alp と比較して、敏感な簡単に再現、そして最も重要なでは、高スループット。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 培地の準備
- 1 L のトリプシン大豆スープ (TSB) の準備: 1 L の蒸留水にはカゼイン、大豆ミール、塩化ナトリウム 3 g、2.5 g、ブドウ糖、リン酸水素二カリウム 2.5 g の馬肉のダイジェストの 5 g の 15 グラムを追加します。使用する前に消毒します。
- トリプシン大豆寒天 (TSA) の tsb、1 L に 15 g の寒天を追加オートクレーブ。それが室温まで冷却しなさい次に、ペトリ皿 (100 mm × 15 mm) あたり 20 mL の割合で注ぐ。
- バイオ培: オートクレーブ TSB の 1 L に 10 g のブドウ糖を追加。0.2 μ m フィルターを用いたろ過滅菌します。
2 96 ウェル培養プレートで黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム形成。
注:黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムは上記6,21として培養しました。
- TSB の 10 mL の TSA から黄色ブドウ球菌の各コロニーに接種し、37 ° C で一晩成長
- 1: 100 (v/v) 比で TSB/糖 (10 g/L) の 10 mL に一晩かけて培養を希釈します。一貫性のある濃度のミックスに優しく渦。
- 1 つの 96 ウェル プレートから 18 の井戸 (実験グループ、ALP 活性6との関係を示唆するような非バイオ フィルム制御について) の合計に希薄文化の 200 mL を転送します。各時点の三つ子を使用: 0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分。3.2 の手順を参照してください。
- バイオ フィルム形成6、21の 24 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。
- 吸引により、上清をデカントします。
- それぞれを洗ってリン酸緩衝液 (PBS、pH 7.4) x 1 でも 15,000 × gで 5 分間遠心し、吸引により、上清をデカントします。
3.ブドウ球菌バイオ フィルムにおける ALP 活性の測定
注:説明6,18と ALP 活性を測定しました。
- ステップ 2.6 から市販の同時の各ウェルで構成されるバッファーの ALP 基板の 75 mL を追加し、時間の記録を開始します。3 通の各時間ポイントを記録します。
- 様々 な時間の培養後: 反作用を停止する 5 M NaOH の 75 μ L をそれぞれ追加 (コントロール) 0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分。
- 15,000 × gで 5 分間プレートを遠心します。
- 比色測定のための新しい 96 well プレートに培養上清の 100 μ L を転送します。
- それぞれの吸光度を測定 405 nm を使用してでも、96 ウェル リーダーをプレートします。0 分の時間を使用して井戸の 405 nm のバック グラウンド ノイズの制御を指します。
- 3 つの個々 の 96 ウェル プレートで全体の実験を繰り返します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1は、96 のよく組織培養皿で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化から ALP 活性の代表的な結果を示します。市販, 耐溶液 75 μ L は、それぞれも、室温でインキュベートしたに追加されました。異なる時間の培養後 (0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分、それぞれ) 反作用を停止する 5 M NaOH の 75 μ L を追加しました。製品は、405 96 well プレート リーダーで測定した nm。時間の各ポイントが単一 96 well プレートから三つ子、3 の個々 の 96 ウェル プレートで全体の実験を繰り返した。
図 1:黄色ブドウ球菌バイオ フィルム文化, 耐基板上で培養し, 異なる時間 (0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分) と ALP 活性を測定した 405 nm 。エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々 の分析では、ALP 基板に同時を使用しました。ELISA 用に設計された実用的なソリューションで、希釈する必要はありません。Alp 企業様が、加水分解後黄色製品開発し、405 で測定できる nm。酵素反応の最後に、我々 は簡単に 96 ウェル プレートを遠心分離し、上澄みをプレート リーダーを使用して吸光度を測定する新鮮な 96 well プレートに転送。それは 405 で吸光度の一貫性を増加するのでこの余分なの遠心分離のステップが重要ですが分かった酵素反応中に発生したすべての可能な浮遊細胞を排除することによっておそらく nm。
バイオ フィルム形成報告6,21として一晩文化 (v/v) 1: 100 希釈 200 μ L を使用します。これは、黄色ブドウ球菌他の希釈液 (データは示されていない) と比較してバイオ フィルムを形成するための最適な希釈です。本稿の目的はバイオ フィルムにおける ALP 活性を測定するため、バイオ フィルムの最適な培養条件を維持して非常に重要だった。これは、最適なバイオ フィルムの成長6の 10 g/L にブドウ糖を使用して選択することによってさらに強調されました。希釈率とグルコース濃度はバイオ フィルム形成細菌の異なるセルを使用する場合を最適化する必要があります。
同時基質とバイオ フィルム文化のインキュベーション中に色の製品を開発するための時間がかかります。目に見える黄色の色の観察は、15 〜 30 分時間ポイント後 ALP 活性を測定しました。図 1に示すように現在の濃度と我々 は 75 分の増加の ALP 活性を気づいた。75 分後 ALP 活性の増加が認められなかった。
最後に、黄色ブドウ球菌の ALP は、専ら膜結合タンパク質7セル換散せずその活動にテストすることができます。全細胞破壊を必要としない酵素活性測定法の利点があります。特に、タンパク質分離プロセスは時々 低い活性酵素量22をもたらすことができます。しかし、ALP がその膜の縛られた形態でない場合は、このプロトコルを使用することはできません。
以前に報告された6、ALP 活性は、プラトンの相手と比較するとバイオ フィルム文化の高架です。現在の研究で使用される実験の設定は、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおける ALP 活性に影響を与える要因・化合物の調査に拡張できます。これらの研究からの調査結果は、細菌のバイオ フィルム形成を制御する方法に追加の洞察を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ウィリアム Rainey ハーパー大学とこれらの実験を行うための施設のためのシカゴのイリノイ大学に感謝します我々 はまた彼らの寛大なサポートの McGraw 丘財団を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
