Summary
I dette manuskript etablerede vi en høj overførselshastighed metode til at kvantificere alkalisk fosfataseaktivitet i S. aureus biofilm kultur fra 96-brønd vævskultur plade
Abstract
Alkalisk fosfatase (ALP) er en fælles enzym udtrykt i både prokaryote og eukaryote celler. Det katalyserer hydrolyse af fosfat monoesters fra mange molekyler på grundlæggende pH og spiller en uundværlig rolle i fosfat stofskiftet. Hos mennesker er eukaryote ALP en af de hyppigst anvendte enzymatisk signaler i diagnosticering af forskellige sygdomme, såsom kolestase og rakitis. I S. aureus, ALP registreres udelukkende på cellemembranen; Det er også udtrykt som en sekretoriske form så godt. Men lidt er kendt om dens funktion i Biofilmdannelse.
Formålet med dette manuskript er at udvikle en hurtig og pålidelig analyse for at måle ALP aktivitet i S. aureus biofilm, der ikke kræver protein isolation. Brug af p-nitrophenylfosfat fosfat (pNPP) som substrat, målte vi ALP aktivitet i S. aureus biofilm dannet i 96-brønd vævskultur plader. Aktivitet var baseret på dannelsen af de opløselige reaktionsprodukt målt ved 405 nm absorbans. Den høje overførselshastighed karakter af 96 godt vævskultur plade metode giver en følsom og reproducerbar metode til ALP aktivitet assays. Den samme eksperimentelle oprettet kan også udvides til at måle andre ekstracellulære molekylære markører relateret til Biofilmdannelse.
Introduction
Alkalisk fosfatase (ALP) er allestedsnærværende udtrykt i både prokaryote og eukaryote celler1. Det kan katalyserer hydrolyse af monophosphate fra forskellige molekyler som nukleotider, proteiner, alkaloider, fosfat estere og anhydrider af fosforsyre. Hos mennesker findes eukaryote ALP i mange væv, herunder lever, knogle, tarmen og moderkagen2. Det spiller vigtige roller i protein fosforylering, cellevækst, apoptose, stamcelle processer samt normale skelet mineralisering. Eukaryote ALP er også en vigtig serum indikator for tilstedeværelsen af sygdomme i knogler, leveren og andre væv/organer når forhøjet3,4.
Prokaryote ALP er blevet opdaget i en bred vifte af bakterieceller, herunder E. coli5, S. aureus6,7 og nogle fælles vommen bakterier i jord8. Bakteriel ALP aktivitet har været brugt som en biosensor i påvisning af pesticider, tungmetaller9 og bakteriel forurening10. Den konstitutive udtryk for ALP har været anvendt til identifikation af stafylokokker11 og at differentiere Serratia fra Enterobacter12. Yderligere foreslås det, at konstitutiv ALP produktion er korreleret med sygdomsfremkaldende stafylokokker13. Selvom ALP er blevet undersøgt i forskellige indstillinger3,4, men lidt er rapporteret for sin aktivitet og funktion i biofilm kulturer.
En biofilm er dokumenteret for at have en anderledes fungerende bakteriel liv sammenlignet med dens fritlevende bakteriel celle modstykke14. I S. aureus, blevet dannelse af biofilm identificeret i en række kliniske tilstande og konti for antibiotikaresistens og kronisk inflammation15,16. Mange molekyler var blevet rapporteret at være fundet i en biofilm matrix som polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer og lipider, men mekanismen i Biofilmdannelse er ikke fuldt forstået14. For at forstå rollen af ALP i Biofilmdannelse, vi kulturperler S. aureus biofilm i 96 godt vævskultur plader og målt ALP aktivitet ved hjælp af para-nitrophenylphosphate (pNPP).
Molekyle pNPP er en klar-til-brug substrat for ALP og har været meget anvendt til at måle ALP aktivitet6,17,18. Denne kolorimetriske assay er baseret på konvertering af para-nitrophenylfosfat fosfat (pNPP) til para-nitrofenol resulterer i et farvet produkt ved 405 nm. I forhold til andre konventionelle ALP assay, såsom Agarosen gel elektroforese19, hvedekim agglutinin (WGA) nedbør, og WGA-HPLC20, denne analyse er meget specifikke, følsomme, let at reproducere, og de fleste vigtigere, giver mulighed for høj overførselshastighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. medium forberedelse
- Forberede 1 L af Tryptic soja bouillon (TSB): I 1 L destilleret vand, tilsættes 15 g af pancreas fordøje af kasein, 5 g af papaic udtog af sojaskrå, 3 g natriumchlorid, 2,5 g af dextrose og 2,5 g af dikalium fosfat. Sterilisere før brug.
- For Tryptic soja Agar (TSA), tilsættes 15 g agar til 1 L af TSB, autoklave. Så lad det køle ned til stuetemperatur. Næste, hæld i forholdet 20 mL per petriskål (100 mm x 15 mm).
- Biofilm næringssubstratet: tilsættes 10 g glukose til 1 L af autoklaveres TSB. Sterilisere ved filtrering ved hjælp af en 0,2 µm filter.
2. S. aureus Biofilmdannelse i 96 godt vævskultur plade
Bemærk: S. aureus biofilm er kulturperler som tidligere beskrevet6,21.
- Podes en individuel koloni af S. aureus fra TSA i 10 mL af TSB og vokse natten over ved 37 ° C.
- Fortynd den overnight kultur i 10 mL af TSB/glucose (10 g/L) i forholdet 1: 100 (v/v). Vortex forsigtigt at blande for en konsekvent koncentration.
- Overføre 200 mL fortyndet kultur til ialt 18 brønde (mere for eksperimentelle grupper, sådan en ikke-biofilm kontrol til at foreslå en relation til ALP aktivitet6) fra en 96 godt plade. Bruge trillinger for hvert tidspunkt: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. Se trin 3.2.
- Inkuber 96 godt pladen ved 37 ° C i 24 timer for biofilm dannelse6,21.
- Dekanteres supernatanten ved aspiration.
- Vask hver godt med 1 x fosfatbufferet løsning (PBS, pH 7,4), centrifugeres i 5 min på 15.000 x g og dekanteres supernatanten ved aspiration.
3. måling af ALP aktivitet i S. aureus Biofilm
Bemærk: ALP aktivitet blev målt som beskrevet6,18.
- Tilsættes 75 mL "buffered" ALP substrat bestående af kommercielt tilgængelige pNPP til hver brønd fra trin 2.6 og begynder at optage tiden. Optage hvert tidspunkt i tre eksemplarer.
- Efter inkubation i et varieret tid: 0 min (kontrol), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min henholdsvis tilføje 75 µL af 5 M NaOH til reaktionen standses.
- Der centrifugeres plade i 5 min på 15.000 x g.
- Overføres 100 µL af supernatanten til en ny 96 godt plade for kolorimetrisk måling.
- Absorbansen af hver godt på 405 nm ved hjælp af en 96 godt plade læser. Brug 0 min tid peger wells kontrolelementet til 405 nm baggrundsstøj.
- Gentag hele eksperimentet i tre individuelle 96 godt plader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et repræsentativt resultat af ALP aktivitet fra biofilm kulturer af S. aureus i 96 godt vævskultur plader. 75 μl af kommercielt tilgængelige pNPP løsning blev føjet til hver godt og inkuberes ved stuetemperatur. Efter inkubation i forskellige tidspunkter (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min, henholdsvis) 75 μl af 5 M NaOH blev føjet til reaktionen standses. Produktet blev derefter målt i en 96 godt Pladelæser ved 405 nm. Hvert tidspunkt blev gentaget i trillinger fra en enkelt 96 godt plade, og hele eksperimentet blev gentaget i 3 individuelle 96 godt plader.
Figur 1: S. aureus biofilm kulturer var inkuberes med pNPP-substrat for anden gang (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min) og deres ALP aktivitet blev målt ved 405 nm. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores analyse brugte vi pNPP som ALP substrat. Dette er en arbejdsgruppe løsning designet til ELISA og ingen fortynding er nødvendig. Efter hydrolyse af ALP, en gul produkt udvikler og kan måles ved 405 nm. For enden af enzymatisk reaktion vi kortvarigt centrifugeres 96 godt pladen og overførte supernatanten til en frisk 96 godt plade til måling af absorbans ved hjælp af i pladelæseren. Vi fandt, at denne ekstra centrifugering skridt er kritisk, da det forøger konsistens af absorbans ved 405 nm, formentlig ved at fjerne enhver mulig suspenderede celler afholdt under enzymatisk reaktion.
Til Biofilmdannelse af bruger vi 200 μl af en 1: 100 (v/v) opløsning for natten kultur som rapporteret6,21. Dette er den optimale opløsning for S. aureus danner biofilm i forhold til andre fortyndinger (data ikke vist). Da formålet med dette papir er at måle ALP aktivitet i biofilm, var det afgørende, at vi fastholdt optimal biofilm kultur betingelser. Dette blev yderligere understreget af valg i ved hjælp af glucose på 10 g/L for optimal biofilm vækst6. Fortynding faktor og glukose koncentration skal optimeres, hvis forskellige bakterieceller bruges til Biofilmdannelse.
Under inkubation af biofilm kultur med pNPP-substrat, vil det tage tid for den farvet produkt til at udvikle. Vi målte ALP aktivitet efter 15-30 min. tid point, som når den synlige gule farve er observeret. Med den nuværende koncentration bemærket vi en øget ALP aktivitet for op til 75 min. som angivet i figur 1. Efter 75 min, blev ingen stigning i ALP aktivitet observeret.
Endelig, da ALP i S. aureus er en udelukkende membran bundet protein7, dens aktivitet kan afprøves uden celle lysering. Der er fordele ved at en enzym aktivitet assay, som ikke kræver hele celle destruktion. Navnlig, kan protein isoleret proces nogle gange give en lavere aktive enzym mængde22. Denne protokol kan ikke bruges hvis ALP ikke er i sin membran bundet form.
Som tidligere rapporteret6, er ALP aktivitet forhøjet i biofilm kultur i forhold til sin platoniske modstykke. De eksperimentelle indstillinger, der bruges i den aktuelle undersøgelse kan udvides til også for at undersøge faktorer/forbindelser, der påvirker ALP aktivitet i S. aureus biofilm. Resultaterne fra disse undersøgelser vil give yderligere indblik i hvordan man styrer bakterielle Biofilmdannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke William Rainey Harper College og University of Illinois i Chicago for mulighed for at udføre disse eksperimenter. Vi takker også McGraw Hill fundament for deres generøse støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
