Summary
이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립
Abstract
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. 미 에 균, ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.
이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.
Introduction
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포1편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반2를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표3,4.
간결한 ALP 토양8에서 대장균5, S. 구 균6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균성 ALP 활동은 농약, 중 금속9 및 세균 오염10의 검출 바이오 센서로 사용 되었습니다. ALP의 제정 식 포도 상 구 균11 을 식별 하 고 Serratia Enterobacter12에서 차별화 하는 데 사용 되었습니다. 그것은 추가 제정 ALP 생산 포도 상 구 균13pathogenicity와 상관은 좋습니다. ALP 다른 설정3,4, 공부는 비록 아직 약간 biofilms 문화에 그것의 기능과 활동에 대 한 보고 됩니다.
Biofilm는 그것의 자유 롭 살아있는 세균성 세포 대응14에 비해 다르게 작동 세균성 생활을 문서화 되었습니다. S. 구 균, biofilm의 형성 다양 한 임상 조건 및 항 생 저항 및 만성 염증15,16에 대 한 계정에서에서 확인 되었습니다. 많은 분자 등 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질, biofilm 매트릭스에서 찾을 수 보고 왔다 하지만 biofilm 형성의 메커니즘은 완전히 이해14. Biofilm 형성에서 ALP의 역할을 이해 하려면 우리 미 균 biofilms 96 잘 조직 배양 접시에 배양 하 고 파라-nitrophenylphosphate (pNPP)를 사용 하 여 높은 산 활동 측정.
분자 pNPP 높은 산에 대 한 준비-사용 기판 이며 ALP 활동6,,1718측정에 널리 사용 되었습니다. 이 색도계 분석 결과 파라 nitrophenyl 인산 염 (pNPP)의 변환에 파라-nitrophenol 405에서 색된 제품의 결과를 기반으로 nm. 와 같은 agarose 젤 전기 이동 법19, 밀 세균 agglutinin (WGA) 강 수, WGA HPLC20이 분석 결과 매우 구체적인 다른 기존의 ALP 분석 결과에 비해, 민감한, 쉽게 재현, 그리고 가장 중요 한 것은, 허용 높은 처리량입니다.
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Protocol
1. 매체 준비
- 1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.
- TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비율로 붓는 다.
- Biofilm 문화 매체: 압력가 TSB의 1 리터에 포도의 10 g를 추가. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 여과 하 여 소독.
2. 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 Biofilm 형성
참고: S. 구 균 biofilm는 앞에서 설명한6,21으로 교양 이다.
- TSB의 10 mL에 TSA에서 S. 구 균 에의 한 개별 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 성장
- 1: 100 (v/v) 비율로 TSB/포도 당 (10 g/L)의 10 mL에 숙박 문화를 희석. 일관 된 농도 대 한 혼합을 부드럽게 소용돌이.
- 한 96 잘 접시에서 18 우물 (실험 그룹, ALP 활동6관계 제안 비 biofilm 컨트롤에 대 한 더 많은)의 총에 희석 문화의 200 mL를 전송. 세 쌍둥이 사용 하 여 각 시간 포인트: 0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분. 3.2 단계를 참조 하십시오.
- Biofilm 형성6,2124 h에 대 한 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.
- 열망 하 여는 상쾌한을 가만히 따르다.
- 각 씻어 잘 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS, pH 7.4) x 1, 15000 x g 에 5 분 동안 원심과 포부에 의해는 상쾌한 가만히 따르다.
3. S. 구 균 Biofilm에서 ALP 활동의 측정
참고: ALP 활동 설명된6,18로 측정 되었다.
- 버퍼링 된 ALP 기판 단계 2.6에서에서 각 잘 상용 pNPP의 구성의 75 mL를 추가 하 고 시간 기록을 시작 합니다. 3 중에 각 시간 포인트를 기록 합니다.
- 다양 한 시간에 대 한 부 화 후: 0 분 (제어), 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분 각각 75 µ L 반응을 중지를 5 M NaOH의 추가.
- 15000 x g에 5 분 동안 접시 원심
- 색도계 측정을 위한 새로운 96 잘 접시에 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.
- 각각의 흡 광도 측정 405 nm를 사용 하 여에서 잘 한 96 잘 접시 리더. 0 분 시간을 사용 하 여 405 nm 배경 잡음에 대 한 제어를 우물을 가리킨.
- 3 개별 96 잘 접시에서 전체 실험을 반복 합니다.
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Representative Results
그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 96 잘 접시 리더에서 측정 되었다 nm. 각 시간 점에 단일 96 잘 접시에서 세 쌍둥이에 반복 되었다 그리고 전체 실험 3 개별 96 잘 접시에 반복 되었다.
그림 1: S. 구 균 biofilm 문화 다른 시간 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 75 분)에 대 한 pNPP 기판으로 incubated 했다와 그들의 ALP 활동 405에서 측정 했다 nm. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광도의 증가 때문에 발견 nm, 아마도 효소 반응 동안 발생 가능한 정지 셀을 제거 하 여.
Biofilm 형성에 대 한 우리 보고6,21로 숙박 문화에 대 한 1: 100 (v/v) 희석의 200 μ 사용합니다. 이것은 다른 희석 (데이터 표시 되지 않음)에 비해 biofilm 형성 S. 구 균 에 대 한 최적의 희석 이다. 이 문서의 목적은 biofilm에서 ALP 활동을 측정 하는, 이후 중요 한 우리가 최적의 biofilm 문화 상태를 유지 했다. 이것은 최적의 biofilm 성장610 g/L에서 포도 당을 사용 하 여 선택에 의해 더 강조 된다. 희석 비율과 포도 당 농도 다른 세균성 세포 biofilm 형성을 위해 사용 하는 경우 최적화가 필요 합니다.
PNPP 기판 biofilm 문화권의 부 화, 동안 컬러 제품 개발을 위한 시간이 소요 됩니다. 우리는 15 30 분 시간 포인트 때 보이는 노란색 색상 관찰 후 ALP 활동을 측정. 현재 농도와 우리 최대 75 분에 대 한 활동을 증가 ALP를 발견 하는 그림 1에 표시 된 대로. 75 분 후 알프 활동의 증가 관찰 되었다.
마지막으로, 이후 S. 구 균 에서 ALP는 독점적으로 막 단백질7, 그것의 활동은 세포 세포의 용 해 하지 않고 테스트할 수 있습니다. 전체 세포 파괴를 요구 하지 않는 효소 활동 분석 결과에 대 한 혜택을 확인 하 고 있습니다. 특히, 단백질 격리 프로세스 때로는 낮은 활성 효소 수량22를 얻을 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜 ALP의 막 바인딩 폼에 없는 경우 사용할 수 없습니다.
이전에 보고 된6, ALP 활동은 플라톤 대응에 비해 biofilm 문화에서 상승 된. 현재 연구에 사용 된 실험 설정 S. 구 균 biofilm에서 ALP 활동에 영향을 주는 요인/화합물을 조사 하기 위해 확장할 수 있습니다. 이러한 연구 결과 세균의 biofilm 형성을 제어 하는 방법에 대 한 추가적인 통찰력을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 이러한 실험을 실시 시설에 대 한 시카고에 일리노이의 대학 윌리엄 Rainey Harper 대학 감사. 우리는 또한 그들의 관대 한 지원에 대 한 맥 그로 힐 재단을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
