Summary
In questo manoscritto, abbiamo stabilito un metodo di alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina nella coltura di biofilm di S. aureus dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti
Abstract
Fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima comune espresso in cellule sia procariote ed eucariote. Esso catalizza l'idrolisi di monoesteri di fosfato da molte molecole a base pH e svolge un ruolo indispensabile nel metabolismo del fosfato. In esseri umani, eucariotiche ALP è uno dei segnali enzimatici maggiormente utilizzati nella diagnosi di varie malattie, quali la colestasi ed il rachitismo. In S. aureus, ALP è rilevato esclusivamente sulla membrana cellulare; essa si esprime anche come una forma secretiva pure. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la sua funzione nella formazione del biofilm.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di sviluppare un'analisi rapida e affidabile per misurare l'attività ALP nel biofilm di S. aureus che non richiedono l'isolamento di proteine. Utilizzando p-nitrofenil fosfato (pNPP) come substrato, abbiamo misurato ALP attività in biofilm di S. aureus formata in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Attività si basava sulla formazione del prodotto solubile reazione misurata di assorbanza di 405 nm. La natura elevato throughput del metodo della piastra di coltura del tessuto ben 96 fornisce un metodo sensibile e riproducibile per analisi di attività ALP. Lo stesso sperimentale istituito può essere esteso anche per misurare altri marcatori molecolari extracellulare legate alla formazione del biofilm.
Introduction
Fosfatasi alcalina (ALP) è espressa ubiquitariamente in entrambe le cellule procariote ed eucariote1. Esso può catalizzare l'idrolisi di monofosfato da diverse molecole come nucleotidi, proteine, alcaloidi, esteri fosforici e anidridi di acido fosforico. In esseri umani, ALP eucariotica è presente in molti tessuti compreso fegato, ossa, intestino e placenta2. Svolge i ruoli importanti nella fosforilazione della proteina, crescita cellulare, apoptosi, i processi delle cellule staminali come pure normale mineralizzazione scheletrica. Eucariotiche ALP è anche un indicatore chiave del siero per la presenza di malattie in ossa, fegato e altri tessuti/organi quando elevati3,4.
Prokaryotic ALP è stato rilevato in una varietà di cellule batteriche, tra cui5di e. coli, Staphylococcus aureus6,7 e alcuni comuni batteri ruminali in suoli8. Attività batterica ALP è stato usato come un biosensore nella rilevazione di pesticidi, metalli pesanti9 e10di contaminazione batterica. L'espressione costitutiva di ALP è stato utilizzato per identificare gli stafilococchi11 e per differenziare Serratia da Enterobacter12. Più ulteriormente è suggerito che la produzione costitutiva di ALP è correlato con patogenicità in stafilococchi13. Anche se ALP è stato studiato in diverse impostazioni3,4, ancora poco è segnalato per la sua attività e la funzione nelle culture di biofilm.
Un biofilm è stato documentato per avere una vita batterica in modo diverso funzionamento rispetto ai suoi dissipati cellula batterica controparte14. In S. aureus, la formazione del biofilm è stata identificata in una varietà di condizioni cliniche e conti per la resistenza agli Antibiotico e l'infiammazione cronica15,16. Molte molecole erano stati segnalati per essere trovato in una matrice di biofilm come polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi, ma il meccanismo di formazione del biofilm non è pienamente compreso14. Per comprendere il ruolo di ALP nella formazione del biofilm, abbiamo coltivato i biofilm di S. aureus in 96 piatti di coltura di tessuto ben e misurato l'ALP attività utilizzando para-nitrophenylphosphate (pNPP).
La molecola pNPP è un substrato di ready-to-use per l'Alpe ed è stato ampiamente usato per misurare ALP attività6,17,18. Questo saggio colorimetrico si basa sulla conversione del para-nitrofenil fosfato (pNPP) a para-nitrofenolo risultante in un prodotto colorato a 405 nm. Rispetto ad altri test ALP convenzionali, come l'elettroforesi19, germe di grano precipitazione dell'agglutinina (WGA), gel dell'agarosi e WGA-HPLC20, questo test è altamente specifico, sensibile, facile da riprodurre e la maggior parte importante, consente ad alta velocità di trasmissione.
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Protocol
1. preparazione media
- Preparare 1 L di brodo di soia triptico (TSB): in 1 L di acqua distillata, aggiungere 15 g di digerito pancreatico di caseina, 5 g di papaico di farina di soia, 3 g di cloruro di sodio, 2,5 g di destrosio e 2,5 g di fosfato dipotassico. Sterilizzare prima dell'uso.
- Per Tryptic Soy Agar (TSA), aggiungere 15 g di agar a 1 L di TSB, autoclave. Poi lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente. Successivamente, versare in un rapporto di 20 mL per piastra di Petri (100 x 15 mm).
- Terreno di coltura di biofilm: aggiungere 10 g di glucosio a 1 L di TSB in autoclave. Sterilizzare mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,2 µm.
2. formazione di Biofilm di S. aureus nella piastra di coltura del tessuto ben 96
Nota: Il biofilm di S. aureus è coltivato come precedentemente descritto6,21.
- Inoculare una colonia individuo di S. aureus da TSA in 10 mL di TSB e crescere durante la notte a 37 ° C.
- Diluire la cultura pernottamento in 10 mL di TSB/glucosio (10 g/L) con un rapporto di 1: 100 (v/v). Vortice delicatamente a mescolare per una concentrazione costante.
- Trasferire 200 mL di coltura diluita in un totale di 18 pozzetti (più per gruppi sperimentali, un tale controllo non-biofilm a suggerire una relazione di ALP attività6) dalla piastra ben uno 96. Utilizzare triplette per ogni punto di tempo: 0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min. Vedere il punto 3.2.
- Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C per 24 h per biofilm formazione6,21.
- Decantare il supernatante dall'aspirazione.
- Lavare ogni bene con 1 x soluzione tamponata fosfato (PBS, pH 7.4), centrifugare per 5 min a 15.000 x g e decantare il supernatante dall'aspirazione.
3. misurazione dell'attività ALP nel Biofilm di S. aureus
Nota: Attività ALP è stata misurata come descritto6,18.
- Aggiungere 75 mL di tampone substrato ALP composto pNPP commercialmente disponibili in ciascun pozzetto da passo 2.6 e iniziare a registrare il tempo. Registrare ogni punto temporale in triplice copia.
- Dopo incubazione per vario tempo: 0 min (controllo), 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min rispettivamente, aggiungere 75 µ l di NaOH M 5 per arrestare la reazione.
- Centrifugare la piastra per 5 min a 15.000 x g.
- Trasferire 100 µ l del surnatante in una nuova piastra ben 96 per misurazione colorimetrica.
- Misurare l'assorbanza di ciascun bene a 405 nm utilizzando lettore di micropiastra a 96 pozzetti. Utilizzare il tempo 0 min scegliere pozzi controllo per rumore di fondo 405 nm.
- Ripetere l'intero esperimento in tre singoli 96 pozzetti.
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Representative Results
La figura 1 Mostra un risultato rappresentativo dell'attività ALP da culture di biofilm di S. aureus in piastre di coltura tissutale ben 96. 75 μL di soluzione di pNPP commercialmente disponibile è stato aggiunto a ogni bene e incubate a temperatura ambiente. Dopo incubazione per diverse volte (0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min, rispettivamente) 75 μL di 5 M NaOH è stato aggiunto per arrestare la reazione. Il prodotto quindi è stato misurato in un lettore di piastra ben 96 a 405 nm. Ogni punto del tempo è stato ripetuto in terzine da una singola piastra ben 96, e l'intero esperimento fu ripetuto in 3 singoli 96 pozzetti.
Figura 1: S. aureus biofilm culture sono state incubate con substrato pNPP per diverso tempo (0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min) e la loro attività ALP è stata misurata a 405 nm. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nella nostra analisi, abbiamo usato pNPP come il substrato ALP. Si tratta di una soluzione di lavoro progettata per ELISA e Nessuna diluizione è necessaria. Dopo l'idrolisi di ALP, un prodotto giallo si sviluppa e può essere misurato a 405 nm. Alla fine della reazione enzimatica, abbiamo brevemente centrifugato la piastra ben 96 e trasferito il surnatante in un piatto ben 96 fresco per misurare l'assorbanza utilizzando il lettore di piastra. Abbiamo trovato che questo passaggio di centrifugazione supplementare è fondamentale, poiché aumenta la consistenza dell'assorbanza a 405 nm, probabilmente eliminando qualsiasi possibile cellule sospese sostenute durante la reazione enzimatica.
Per la formazione di biofilm, usiamo 200 μL di una diluizione di 1: 100 (v/v) per la coltura durante la notte come segnalato6,21. Questa è la diluizione ottima per S. aureus formare biofilm rispetto ad altre diluizioni (dati non mostrati). Poiché lo scopo di questa carta è di misurare l'attività ALP nel biofilm, era fondamentale che abbiamo mantenuto condizioni di coltura ottimale biofilm. Questo è stato ulteriormente enfatizzato dalla scelta nell'utilizzo del glucosio a 10 g/L per biofilm ottimale crescita6. La concentrazione di glucosio e del fattore di diluizione devono essere ottimizzate se diverse cellule batteriche vengono utilizzate per la formazione di biofilm.
Durante l'incubazione della cultura biofilm con substrato pNPP, ci vorrà tempo per il prodotto colorato sviluppare. Abbiamo misurato ALP attività dopo 15 e 30 punti di tempo min che è quando si osserva il colore giallo visibile. Con l'attuale concentrazione, abbiamo notato un'aumentata attività ALP per fino a 75 min come indicato nella Figura 1. Dopo 75 min, è stato osservato alcun aumento dell'attività ALP.
Infine, poiché ALP in S. aureus è un esclusiva membrana associata proteina7, sua attività può essere testato senza lisi cellulare. Ci sono vantaggi per un'analisi di attività dell'enzima che non richiedono la distruzione di tutta la cella. In particolare, il processo di isolamento della proteina può a volte produrre una bassa quantità di enzima attivo22. Tuttavia, questo protocollo non può essere utilizzato se ALP non è nella sua forma di associazione a membrana.
Come precedentemente segnalato6, ALP sono elevati in biofilm cultura rispetto alla sua controparte platonico. Le impostazioni sperimentali utilizzate nello studio corrente possono essere esteso per indagare i fattori/composti che influiscono sull'attività ALP nel biofilm di S. aureus . I risultati da questi studi forniranno ulteriori approfondimenti in come controllare la formazione di biofilm batterici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Grazie a William Rainey Harper College e la University of Illinois a Chicago per la possibilità di condurre questi esperimenti. Ringraziamo anche McGraw Hill Foundation per il loro generoso sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
