Un metodo di laboratorio per misurare lo sbadiglio contagioso nei ratti

Summary

Il metodo qui descritto mira ad ottenere curve di contagio dello sbadiglio in coppie di ratti maschi familiari o sconosciuti. Le gabbie con fori separati da partizioni chiare o opache con (o senza) fori vengono utilizzate per rilevare se il contagio visivo, olfattivo o entrambi i tipi di segnali sensoriali possono stimolare il contagio dello sbadiglio.

Abstract

La comunicazione è un aspetto essenziale della vita sociale animale. Gli animali possono influenzarsi a vicenda e riunirsi nelle scuole, nelle greggi e nelle mandrie. La comunicazione è anche il modo in cui i sessi interagiscono durante il corteggiamento e come i rivali risolvono le controversie senza combattere. Tuttavia, ci sono alcuni modelli comportamentali per i quali è difficile testare l'esistenza di una funzione di comunicatore, perché sono probabilmente coinvolti diversi tipi di modalità sensoriali. Ad esempio, lo sbadiglio contagioso è un atto di comunicazione nei mammiferi che potenzialmente si verifica attraverso la vista, l'udito, l'olfatto o una combinazione di questi sensi a seconda che gli animali siano familiari tra loro. Pertanto, per testare ipotesi sul possibile ruolo comunicatorio di tali comportamenti, è necessario un metodo adatto per identificare le modalità sensoriali partecipanti.

Il metodo qui proposto mira ad ottenere curve di contagio dello sbadiglio per ratti familiari e sconosciuti e valutare la partecipazione relativa delle modalità sensoriali visive e olfattive. Il metodo utilizza materiali poco costosi, e con alcune piccole modifiche, può essere utilizzato anche con altre specie di roditori come i topi. Nel complesso, il metodo prevede la sostituzione di divisori chiari (con o senza fori) con divisori opachi (con o senza fori) che consentono o impediscono la comunicazione tra ratti posizionati in gabbie adiacenti con fori nei lati adiacenti. Di conseguenza, si possono testare quattro condizioni: comunicazione olfattiva, comunicazione visiva, comunicazione visiva e olfattiva, né comunicazione visiva né olfattiva. Come l'interazione sociale si verifica tra i ratti, queste condizioni di test simulano ciò che può verificarsi in un ambiente naturale. A questo proposito, il metodo qui proposto è più efficace dei metodi tradizionali che si basano su presentazioni video la cui validità biologica può sollevare preoccupazioni. Tuttavia, non discrimina tra il potenziale ruolo dell'udito e i ruoli dell'olfatto e della visione nel contagio dello sbadiglio.

Introduction

Tradizionalmente, il comportamento dei comunicatori è stato studiato da due prospettive. Da un punto di vista, gli etologi osservano e registrano il comportamento degli animali in ambienti naturali e tentano di riconoscere il suo valore adattivo¹. Il senso o i sensi particolari coinvolti non sono stati l'interesse primario di questi studi. Da un'altra prospettiva, i fisiologi sono più interessati a svelare i meccanismi con cui gli animali comunicano¹; quindi, studi di laboratorio hanno fornito metodi per affrontare il ruolo che le modalità sensoriali svolgono nella comunicazione^2,3. Queste due prospettive sono infatti complementari, perché la conoscenza sia del valore adattivo che dei meccanismi immediati è necessaria per ottenere una comprensione completa dei comportamenti comunicativi nella vita sociale degli animali.

Il comportamento dello sbadiglio è una componente cospicua del repertorio comportamentale in diverse specie di vertebrati⁴, che vanno dai pesci ai primati⁵. Può essere descritto come una lenta apertura della bocca e il mantenimento della sua posizione aperta, seguita da una chiusura più rapida della bocca⁵. La durata dell'intera sequenza dipende dalla specie; ad esempio, i primati sbadigliano per durate più lunghe rispetto alle specie non-primati⁶. In molte specie, con gli esseri umani che fanno l'eccezione, i maschi tendono a sbadigliare più frequentemente delle femmine⁷. Questa funzione potrebbe essere alla base della possibile funzione comunicativa dello sbadiglio, anche se i modelli regolari di sbadiglie e la sua frequenza giornaliera possono anche suggerire una funzione fisiologica. Nei ratti, lo sbadiglio spontaneo segue un ritmo circadiano, con picchi di alta frequenza che si verificano al mattino e al pomeriggio^8,9.

Una caratteristica interessante del comportamento sbadiglio è che può essere un atto contagioso (quando lo stimolo di rilascio di un comportamento sembra essere un altro animale che si comporta allo stesso modo¹⁰) in diverse specie di vertebrati^{11,12, 13,14,15,16}, compresi gli uccelli¹⁷ e roditori¹⁸. Inoltre, prove recenti hanno indicato che lo sbadiglio contagioso può riflettere un ruolo comunicativo, perché lo sbadiglio di un ratto può influenzare lo stato fisiologico di un altro quando esposto a spunti olfattivi¹⁹. Tuttavia, se lo sbadiglio ha o meno un ruolo comunicante è ancora in discussione^20,21, e analizzare lo sbadiglio contagioso è un primo passo essenziale per risolvere questo problema.

D'altra parte, lo sbadiglio contagioso è stato collegato alla capacità di un animale di immedesimarsi con le prospettive di altri animali; quindi, gli individui strettamente correlati sono più propensi a mostrare contagio⁴. Questa ipotesi è stata spesso testata in condizioni di laboratorio in cui gli animali sono presentati con stimoli di sbadiglio sul video^12,13; quindi, il contagio può avvenire solo attraverso segnali visivi. Altre indagini hanno valutato il contagio dello sbadiglio in condizioni più naturali utilizzando gruppi di animali^14,15. Uno dei principali problemi di questo è che gli animali socialmente interagenti spesso rispondono a segnali e si scambiano segnali che vengono trasmessi attraverso combinazioni di modalità sensoriali. Disentangling i sensi effettivi coinvolti in un determinato comportamento dai loro effetti combinati non è sempre un compito facile. Tipicamente, i ricercatori farmacologicamente o chirurgicamente ostacolano l'uso di un animale di un determinato senso, quindi deducono il ruolo di quel senso nel comportamento pertinente^2,3,18,22. Fortunatamente, ci sono altri metodi in cui solo le barriere fisiche vengono utilizzate per consentire o ostacolare la comunicazione tra gli animali^23,24,25, ottenendo così una maggiore validità biologica.

Il metodo qui proposto è stato specificamente progettato per studiare lo sbadiglio contagioso in ratti familiari e sconosciuti in un ambiente sociale. Secondo l'ipotesi empatica, il primo gruppo dovrebbe essere più suscettibile allo sbadiglio contagioso. Il metodo non richiede agli animali di essere chirurgicamente o farmacologicamente privati di qualsiasi senso. Invece, funziona posizionando i ratti in gabbie adiacenti con fori e ostruendo fisicamente la loro comunicazione utilizzando divisori chiari o opachi con o senza fori. Pertanto, si possono esaminare quattro condizioni di prova: (1) comunicazione olfattiva (OC, divisore opaco perforato), (2) comunicazione visiva (VC, divisore chiaro non forato), (3) comunicazione visiva e olfattiva (VOC, divisore chiaro perforato) e (4) nessuno dei due comunicazione visiva né olfattiva (NVOC, divisore opaco non forato). Pertanto, i ricercatori possono confrontare i contributi relativi di olfattivo, visivo, e in una certa misura, spunti uditivi in contagio sbadiglio. Questo approccio non è nuovo, in quanto metodi simili sono stati utilizzati per isolare i sensi coinvolti in determinati comportamenti comunicatori in animali come lucertole²³ e topi²⁶. Infatti, Gallup e colleghi²⁷ hanno usato un metodo simile per dimostrare il ruolo dei segnali visivi nello sbadiglio contagioso nei budgerigars. Le caratteristiche principali di questi metodi sono la simulazione di un contesto sociale e lo stress minimo inflitto agli animali. Inoltre, l'uso di animali interagenti aumenta la validità biologica delle conclusioni.

Ci sono diversi modi per misurare lo sbadiglio contagioso^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicazione personale, 2015) ci ha aiutato ad adattare numericamente un metodo precedentemente impiegato dai primatologi^13,14 per una precedente analisi dei dati utilizzati qui¹⁸. Presentato in questo protocollo è una versione migliorata di questo metodo con una più ampia gamma di applicazioni. Consiste nel pesare il numero totale di sbadigli di un ratto, all'interno e all'esterno di una determinata finestra temporale, in base alla proporzione del tempo di osservazione corrispondente agli sbadigli all'interno e all'esterno della finestra temporale.

Ad esempio, se si presume che i ratti A e B siano osservati per 12 min, il loro sbadiglio viene registrato al minuto più vicino e un intervallo di tempo di 3 minuti è impostato per misurare lo sbadiglio contagioso. Successivamente, vengono considerate le seguenti sequenze di sbadigli per ciascuno di questi ratti: ratto A (0,0,0,0,0,2,0,0,0,2,1) e ratto B (0.1,1,0,1,0,0, 0,0,3). Va notato che ogni numero (0-3) corrisponde al numero di sbadigli segnati ad ogni min. Per il ratto A, durante i minuti 1, 10 e 11 (numeri in grassetto), il ratto B non sbadiglia entro i 3 minuti precedenti (l'intervallo di tempo scelto) o entro quel minuto. In quei minuti, il ratto A sbadiglia per un totale di 2 volte. Pertanto, la frequenza di sbadigli omeno del ratto A senza alcun stimolo di sbadiglio (tasso di sbadiglio non post-post-sbadiglio) è 2/3 (cioè 0,67 sbadigli/min). Nei restanti 9 minuti, il ratto B sbadiglia almeno una volta nello stesso minuto o nei 3 minuti precedenti. RatA sbadiglia un totale di quattro volte in quei 9 min. Pertanto, il tasso di sbadiglio del ratto A in risposta a uno stimolo dello sbadiglio (tasso di sbadiglio post-sbadiglio) è 4/9 (cioè., 0,44 sbadigli/min). L'applicazione della stessa procedura al ratto B produce un tasso di sbadiglio non post-sbadiglio di 2/3 (cioè 0,66) e un tasso di sbadiglio post-yawn di 5/9 (0,55).

D'altra parte, se lo sbadiglio è registrato al decimale più vicino di un minuto, il contagio dello sbadiglio si tradurrà in un tempo post-sbadigliato regolato. Ad esempio, se i seguenti tempi di sbadiglio vengono registrati in un periodo di osservazione di 12 min per i ratti A e B: ratto A (2.3, 5.1, 5.8, 10.4, 10.8, 11.1) e ratto B (1.2, 2.4, 4.5, 5.1, 11.2, 11.6, 11.8). Per il ratto A, i periodi di tempo durante i quali il ratto B non si sbadiglia negli ultimi 3 min vanno da 0 a 1,2 min e da 8,1 a 11,2 min (cioè 3,1 min), che produce un totale di 4,3 min di tempo non post-yawn. Il numero di volte in cui il ratto A sbadiglia in quei periodi è tre (numeri in grassetto), quindi il tasso di sbadiglio non post-yawn è 3/4.3 (cioè 0,69), mentre il tasso di yawn post-yawn è 3/7.7 (cioè 0,38; il denominatore da 12-4,3 min). Allo stesso modo, per il ratto B, i periodi di tempo durante i quali il ratto A non sbadiglia negli ultimi 3 min vanno da 0 a 2,3 min e da 8,8 a 10,4 min, che produce un totale di 3,9 min. Il numero di volte in cui il ratto B si sbava all'interno di tali periodi è uno, quindi il tasso di sbadiglio non post-sbadigliato è 1/3,9 (cioè 0,25). Di conseguenza, il tasso di sbadiglio post-sbadiglio è 6/8.1 (cioè 0,74).

Mentre una corrispondenza quasi-contemporanea nel comportamento è un criterio ideale per dimostrare la presenza di un contagio, aspetti come i vincoli su ciò che un individuo frequenta, il tempo di reazione a uno stimolo, la distribuzione del comportamento nel tempo (ad esempio, lo sbadiglio può verificarsi in episodi), e il tempo di acclimatarsi all'impostazione sperimentale tutti danno origine a differenze di specie, rendendo difficile l'uso di un intervallo di tempo unico. Questo può essere il motivo per cui i ricercatori hanno utilizzato le finestre di tempo che variano da secondi⁵ a diversi minuti¹¹, che crea problemi quando si confrontano i risultati²⁸. Per questo motivo, si propone di ripetere la procedura descritta sopra per una serie di intervalli di tempo per ottenere curve di contagio dello sbadiglio e confrontare le curve di contagio dello sbadiglio tra le specie.

Le curve di contagio dello sbadiglio equivalenti possono essere confrontate distribuendo casualmente il numero di sbadigli osservati per ogni ratto durante il periodo di osservazione. Così, il metodo proposto per misurare il contagio dello sbadiglio offre due tipi di controlli: il tasso di (1) tasso di sbadigli osidio che si verificano al di fuori della finestra temporale (tempo non post-sbadiglia) e (2) curva di contagio dello sbadiglio artificiale ottenuta dalla distribuzione casuale del numero di sbadigli. Pertanto, questo approccio per analizzare il contagio dello sbadiglio è un passo avanti rispetto ad altre procedure, come quelle che confrontano la percentuale o la frequenza dello sbadiglio entro un singolo intervallo di tempo con quelle che si verificano al di fuori di questa finestra²⁵, senza tenere conto del tempi effettivi fotogrammi. Il metodo è completato da un programma basato su R²⁹ per calcolare comodamente e oggettivamente la probabilità di sbadigli contagioso per uno o più intervalli di tempo.

Per illustrare l'utilità di questo metodo e i vantaggi del programma basato su R, viene utilizzato un set di dati da uno studio pubblicato in precedenza^18. La condizione sperimentale consisteva di 144 ratti maschi assegnati a una condizione familiare o sconosciuta. I ratti in ogni condizione sperimentale sono stati suddivisi in quattro sottogruppi di nove coppie ed esposti a una delle quattro situazioni di prova descritte sopra. I comportamenti sbadigli dei ratti in ogni condizione sperimentale e situazione di prova sono stati poi registrati per un periodo di 60 min.

Protocol

I protocolli sperimentali e l'allevamento degli animali sono stati condotti in conformità con gli orientamenti istituzionali.

1. Materiali

1. Trovare un elenco completo dei materiali utilizzati per implementare il metodo nella Tabella dei materiali. Utilizzare la Figura 1 e consultare un esperto per costruire una tabella a forma di T rovesciata, gabbie di osservazione e divisori a gabbia. Seguire le indicazioni di sicurezza per l'uso di utensili affilati e materiali potenzialmente pericolosi.
2. Crea un tavolo a forma di T invertito incollando due barre di legno simili a rotaie (lunghezza 45 cm, separate a 0,6 cm l'una dall'altra) sulla parte superiore e al centro di un pezzo di legno (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). Quindi, posizionare un secondo pezzo di legno (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) verticalmente tra le barre simili a rotaie. Assicurarsi che questo secondo pezzo di legno impedisca alla coppia di ratti su un lato di vedere l'altra coppia sul lato opposto (Figura 1).
3. Utilizzare vetro e acrilico per creare otto gabbie di osservazione. Assicurarsi che ogni gabbia (19 cm di larghezza, 19 cm di lunghezza, 10 cm di altezza, 3 mm di spessore) abbia 24 fori equidistanti (5 mm di diametro) disposti in tre file al centro di uno dei suoi lati. Fai questo lato di acrilico (3 mm di spessore) e accorcia l'altezza del lato opposto di 0,7 cm per consentire al ratto di respirare.
   1. Assicurarsi che ogni gabbia di osservazione abbia un coperchio scorrevole in acrilico per evitare che il ratto si alleva e si distragga durante il periodo di osservazione di 60 min.
4. Crea quattro divisori di acrilico (19 cm di larghezza, 30 cm di altezza, 3 mm di spessore). Forare 24 fori (5 mm di diametro) che corrispondono a quelli nelle gabbie di osservazione, ciascuno in un divisore chiaro e un divisore opaco.
5. Preparare le schede tecniche in anticipo per registrare l'occorrenza di sbadigli. Includere, nell'intestazione di ogni scheda dati, il nome dell'osservatore, la condizione sperimentale (ad esempio, ratti familiari o sconosciuti), la situazione di prova pertinente (OC, VC, VOC, NVOC), la data e le prime e finali ore dell'osservazione. Dividere il resto della scheda dati in due colonne, ognuna con il numero del ratto scritto nella parte superiore, per registrare il comportamento sbadigliante dei ratti.

2. Procedura

1. Casa 144 ratti maschi in gruppi di quattro in gabbie di plastica (gabbia domestica) dallo svago fino a raggiungere 2,5 mesi di età. Non usare ratti femminili, perché tendono a mostrare una maggiore variazione nel comportamento a causa di cicli ormonali, che possono essere confusi con gli effetti della situazione di prova. Assicurarsi che i ratti in ogni gabbia non siano fratelli.
   NOTA: Potrebbe essere difficile ottenere tutti i ratti insieme. In tal caso, creare blocchi di almeno 8 ratti familiari e 8 ratti sconosciuti in modo che ogni situazione di prova sia rappresentata una volta in ogni condizione sperimentale³⁰.
2. Per identificare i ratti, contrassegnarli con numeri simbolici sulle code utilizzando un marcatore commerciale. Ad esempio, rappresentare i numeri da 1 a 4 combinando punti e linee (ad esempio, un punto per il numero 1 e una riga per il numero 4). Identificare i ratti familiari e sconosciuti utilizzando colori diversi.
   NOTA: maneggiare i ratti seguendo le indicazioni di sicurezza fornite dal personale della struttura animale e rispettare le raccomandazioni relative all'uso corretto degli animali da laboratorio presso l'istituto in cui verranno effettuati esperimenti.
3. Scegli casualmente quali gabbie di casa ospiteranno il gruppo di ratti familiari e che ospiteranno il gruppo sconosciuto. Ad esempio, supponiamo che ci siano 16 ratti disponibili che vivono in quattro gabbie domestiche: numera le gabbie di casa da 1 a 4, quindi usa R (scaricalo a http://cran.r-project.org/) come segue [dopo il prompt (>)]:
   > campione(4,4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Raggruppa i ratti familiari (o sconosciuti) nelle gabbie di casa 4 e 3 e raggruppa i ratti sconosciuti (o familiari) nelle gabbie di casa 2 e 1. Assicurarsi che il personale della struttura animale mantenga l'identità di ogni gabbia e gestisca i ratti allo stesso modo di tutti gli altri ratti nell'impianto animale.
   2. Utilizzare di nuovo il programma R e scegliere casualmente i ratti per formare ogni coppia in ogni condizione sperimentale. Assicurarsi che i ratti in ogni coppia di ratti familiari provengano dalla stessa gabbia domestica e che sia vero il contrario per le coppie nel gruppo sconosciuto. Scegliere casualmente coppie di ratti per ogni situazione di prova in ogni condizione sperimentale.
4. Eseguire due sessioni di test al giorno con due delle otto possibili situazioni di test (quattro per ogni ratto familiare e sconosciuto) per ogni sessione di test (ad esempio, 60 min periodo di osservazione). Condurre le due sessioni di test consecutivamente entro 3 h.
   NOTA: Assicurarsi di condurre tutte le sessioni di prova (quattro coppie di ratti al giorno) al mattino o al pomeriggio per evitare fattori di confusione. Eseguire una replica completa (otto situazioni di test) dell'esperimento per due giorni consecutivi.
   1. Assicurarsi di utilizzare le situazioni di test in una sequenza casuale per ogni replica dell'esperimento. Ad esempio, usare i numeri da 1 a 8 per identificare ogni situazione di test, quindi usare R come segue:For example, use numbers 1 to 8 to identify each test situation, then use R as follows:
      >campione(8,8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Allocare le situazioni di test 8 e 7 alla sessione di test 1, alle situazioni di test 4 e 6 alla sessione di test 2 e così via. Quindi, scegli casualmente il lato del tavolo a forma di T invertito in cui verrà posizionata ogni coppia di ratti (situazione di prova).
5. Ripetere la stessa procedura (passaggi da 2.3 a 2.4.2) per una seconda replica (ovveroblocco) dell'esperimento.
   NOTA: Se lo scopo dello studio è quello di testare gli effetti di una condizione sociale (cioè due ratti che interagiscono) sulla frequenza di sbadigliaggio, utilizzare un ratto posto in una gabbia di osservazione accanto a una gabbia di osservazione vuota come controllo per ciascuna delle quattro situazioni di prova. Eseguire questo esperimento 2x per ogni situazione di test per un gruppo di controllo di otto ratti.
6. Impostare la sessione di prova trasferendo i primi quattro ratti dalla struttura animale alla sala di osservazione, dove rimarranno per 15 min per acclimatarsi al nuovo ambiente. Trasportare i ratti in gabbie individuali e tenerli separati l'uno dall'altro durante il trasporto e nella sala di osservazione.
   NOTA: Seguire le indicazioni di sicurezza per il trasporto degli animali forniti dal personale della struttura animale e utilizzare i vestiti indicati per lavorare con gli animali in laboratorio. I ratti non avranno accesso al cibo e all'acqua mentre si trovano nella sala di osservazione.
7. Dopo che il periodo di acclimatazione è passato, posizionare il tavolo a forma di T invertito su un tavolo rettangolare più grande. Assicurarsi che ci sia una lampada a soffitto che illumina sufficientemente la stanza quando si effettuano osservazioni.
8. Mettere la carta da filtro sul fondo di ogni gabbia di osservazione e posizionare le gabbie in coppia su ciascun lato del tavolo a forma di T invertito. Posizionare il divisore corrispondente tra ogni coppia di gabbie.
   NOTA: La carta da filtro facilita la pulizia delle gabbie e fornisce una superficie ruvida su cui i ratti possono muoversi senza scivolare.
9. Posiziona strategicamente due camcorder digitali in modo che ognuna registri il comportamento di sbadigliamento di ogni coppia di ratti. Assicurarsi che i camcorder siano fissati in modo sicuro ai treppiedi e correttamente orientati alle gabbie di osservazione. Collegare i videocamere a un computer desktop per monitorare contemporaneamente il comportamento dei ratti.
   NOTA: memorizzare le informazioni digitali sulle unità flash per archiviare in modo permanente le sessioni sperimentali. Utilizzare unità flash con un'elevata capacità di archiviazione.
10. Dopo il periodo di acclimatazione, collocare i ratti nelle gabbie di osservazione in base all'assegnazione precedentemente determinata. Impostare la messa a fuoco automatica del camcorder e avviare la registrazione video contemporaneamente con un cronometro. Interrompere la registrazione video alla fine del periodo di osservazione di 60 min.
    NOTA: Mentre gli sperimentatori possono essere al di fuori della stanza durante la sessione di test e osservare da remoto, si raccomanda che una persona si trova nella sala di osservazione (il più lontano possibile dall'impostazione sperimentale) mentre monitora il comportamento dei ratti per garantire che la sessione di test proceda senza interruzioni.
11. Quando l'osservazione è finita, riportare i ratti alle loro gabbie di casa nella struttura animale. Chiedere al personale della struttura per gli animali di assicurarsi che i ratti abbiano di nuovo accesso al cibo e all'acqua. Pulire accuratamente le gabbie di osservazione utilizzando un detergente non tossico e preparare il set-up sperimentale per eseguire la seconda e ultima sessione di prova della giornata.
    NOTA: Pulire il legno per rimuovere eventuali profumi lasciati dai ratti quando vengono collocati nelle gabbie di osservazione, che potrebbero influenzare il comportamento della coppia successiva di ratti testati.
12. Formare da uno a due volontari parzialmente ciechi ai trattamenti assegnati per identificare e registrare lo sbadiglio utilizzando un metodo di campionamento per tutte le occorrenze. Assicurarsi che gli osservatori utilizzino la definizione di sbadiglio descritta nella sezione introduttiva.
13. Riprodurre e proiettare ogni video sullo schermo di un computer utilizzando qualsiasi sistema di riproduzione standard. Chiedi all'osservatore di visualizzare ogni video e osservare e registrare il comportamento dello sbadiglio utilizzando le schede tecniche preparate in precedenza, quindi consentigli di rivedere i video a velocità più basse per migliorare la capacità di osservare e misurare lo sbadiglio.
    1. Chiedere agli osservatori di segnare sbadigli utilizzando un sistema di notazione simile al seguente: utilizzare linee verticali con il minuto scritto come un apice per rappresentare l'occorrenza di uno sbadiglio (ad es. ³ N. di lavoro ⁶ . ⁹, che indica uno sbadiglio al minuto 3, due sbadigli al minuto 6 e uno sbadiglio al minuto 9). Punteggio sbadigliando come sequenza (ad esempio, 1.2, 2.2, 3.2, 5.0, 5.8) per registrarlo con maggiore precisione (minuti arrotondati a una cifra decimale).
    2. In alternativa, inserisci direttamente i dati dai video in un computer utilizzando programmi standard di raccolta dati. Assicurarsi che l'osservatore è a conoscenza di tali programmi.
       NOTA: se necessario, consentire all'osservatore di visualizzare ogni video in più di una sessione. Assicurati che un osservatore levi vivano tutti i video corrispondenti a un blocco di esperimenti. Se due diversi osservatori hanno visto questi video, ci può essere il rischio che le differenze nelle loro capacità di osservare e registrare lo sbadiglio confondano gli effetti delle situazioni di prova. È importante ottenere l'affidabilità intra-osservatore tra diversi osservatori sul 10%-20% dei video per garantire che lo sbadiglio sia annotato nello stesso modo.

3. Trattamento dei dati

1. Trascrivi la sequenza temporale degli sbadigli in ogni ratto dalle schede tecniche a un foglio di calcolo. Assicurarsi che vi sia una colonna per ogni ratto con una breve voce (ad esempio., fr1.l e fr1.r per indicare la prima coppia di ratti familiari sui lati sinistro e destro, rispettivamente). Assicurarsi che tutte le colonne siano della stessa lunghezza riempiendo le celle vuote con 0 o NA (vedere di seguito).
   NOTA: utilizzare la guida generale fornita come documento supplementare per comprendere appieno i seguenti passaggi per elaborare i dati, misurare lo sbadiglio contagioso e ottenere curve contagiose di sbadiglio.
   1. Se lo sbadiglio è stato registrato al minuto più vicino, digitare il numero di sbadigli ad ogni minuto pertinente e utilizzare 0 (senza sbadiglio) per riempire le celle quando non si è verificato alcuno sbadiglio in un determinato minuto. Salvare il foglio di lavoro come file di testo (.txt).
   2. Se lo sbadiglio è stato registrato al decimale più vicino di un minuto, digitare la sequenza dall'alto verso il basso e utilizzare "NA" per riempire gli spazi vuoti delle colonne (ratti) in cui il numero di sbadigli (righe) è inferiore a quello della colonna con il numero massimo (righe) di sbadigli registrati per un r a. Salvare il foglio di lavoro come file di testo (.txt).
      NOTA: Poiché R ha la possibilità di lavorare con celle vuote, il foglio di lavoro può essere salvato con colonne di diverse lunghezze. Usare le opzioni della Guida fornite da R per gestire i dati mancanti.
2. Avviare R. Importare i dati dal file in cui si trovavano in precedenza.
3. Salvare i codici di programma con l'estensione ". R" (fornito come materiale supplementare), quindi scaricare il codice del programma specifico (vedi guida generale) a seconda che gli sbadigli siano stati registrati come numeri interi o frazionari. Eseguire il programma per ogni coppia di ratti e il numero desiderato di intervalli di tempo.
   1. Eseguire nuovamente il programma, ora utilizzando una distribuzione casuale del numero di sbadigli da ogni ratto (vedi guida generale). Seguire gli stessi passaggi (passaggi da 3.3 a 3.3.1) per tutte le condizioni sperimentali (ad esempio, ratti familiari e sconosciuti) e/o tutte le situazioni di test. Procedere come indicato nella guida generale ed esportare i risultati in Excel.
      NOTA: invece di importare un programma salvato in precedenza, come suggerito in precedenza utilizzando un editor di testo, copiare e incollare direttamente il programma nell'area di lavoro di R.
4. Per creare curve di contagio yawn, utilizzare i dati salvati in precedenza in un foglio di calcolo. Sottrarre i tassi di non contagio dai tassi di contagio per ogni coppia di ratti, intervallo di tempo e situazione di test. Separare le analisi dei dati osservati e i dati artificiali (distribuiti in modo casuale).
   1. Successivamente, calcolare gli intervalli di confidenza (CI) per ogni intervallo di tempo e la situazione di test utilizzando una procedura di bootstrap (vedere la guida generale). Separare le analisi per ratti familiari e sconosciuti. Quindi, combinare i dati artificiali delle quattro situazioni di test per ogni condizione sperimentale e calcolare il CI per ogni intervallo di tempo utilizzando una procedura di bootstrap.
   2. Successivamente, creare grafici per ogni situazione di test e condizione sperimentale (vedere Figura 2 e Figura 3). Infine, eseguire un'analisi di regressione multipla per confrontare l'intensità del contagio dello sbadiglio tra le situazioni di test (vedere di seguito).

Representative Results

I ratti sono stati selezionati da una sotto-linea di ratti Sprague-Dawley prodotta in precedenza che sono stati selezionati per frequenti sbadigli (circa 22 sbadigli all'ora³¹). Tuttavia, le nove coppie di ratti maschi sconosciuti e nove di ratti maschi familiari (tra i 2,5 e i 3 mesi di età) utilizzati per situazione di prova sbadigliavano circa 12 volte all'ora, in media¹⁸. Pertanto, le situazioni di prova per misurare il contagio dello sbadiglio parzialmente inibito comportamento di sbadiglio.

Il contagio dello sbadiglio è stato misurato in un intervallo di finestre temporali che variavano da 1 a 10 min. Queste curve di contagio dello sbadiglio indicano che solo i ratti OC (in gabbie con un divisore perforato e opaco) hanno mostrato un contagio dello sbadiglio, che è evidente dall'intervallo temporale 4 e in poi, perché la CI delle medie non si sovrappone alla CI dei numeri assegnati casualmente di sbadigli nel periodo di 60 min. La banda ha indicato, come previsto, che un'allocazione casuale del numero di sbadigli in ogni ratto nel periodo di osservazione ha prodotto tassi di sbadiglio che oscillavano a circa zero, senza mostrare alcun modello apparente.

Il modello di regressione lineare multiplo adattato ai dati indicava che le curve delle quattro situazioni di test erano significativamente diverse (F_1,3 x 11,5, p < 0.0001). In particolare, il contagio dello sbadiglio era più forte nei ratti OC rispetto a: ratti VC (ratti in gabbie con un divisore chiaro e non forato; t - -3,8, p < 0,001), ratti VOC (ratti in gabbie con un divisore chiaro e perforato; t - 5,74, p < 0.0001) e ratti NVOC (ratti in gabbie con un divisore opaco non forato; t - -2,64, p < 0,01). In tutti i casi, i gradi di libertà erano 695, dal momento che l'analisi ha preso in considerazione non solo le quattro situazioni di prova, ma anche le 10 finestre temporali. Poiché queste condizioni hanno generato misurazioni autocorrelate, è stato aggiunto un termine di autocorrelazione (ARMA, media mobile autoregressiva) al modello statistico. Le tendenze generali nel corso dei 10 intervalli di tempo differivano statisticamente anche da una pendenza 0 (F_1,1 x 11,99, p < 0.0001). Figura 3 Mostra la stessa analisi di quella in Figura 2, applicata ai ratti maschi familiari. In questo caso, nessuna delle quattro situazioni di prova ha stimolato il contagio dello sbadiglio perché la loro CI si sovrapponeva alla banda CI generata casualmente. Non vi sono state differenze tra le quattro situazioni di prova (F_1,3 , p e 0,14); tuttavia, l'aumento complessivo del contagio dello sbadiglio nel corso dei 10 intervalli di tempo differiva da una pendenza 0 (F_1,1 , 9, p < 0,01).

Il ruolo dell'olfatto nella vita sociale dei mammiferi può essere il motivo per cui solo i ratti OC hanno mostrato contagio sbadiglio e sbadigliato più frequentemente rispetto ai ratti VC¹⁸. I segnali visivi potrebbero non aver facilitato lo sbadiglio, perché i ratti albini non vedono così come i ratti non albini. Tuttavia, i ratti VC sbadigliavano il doppio del gruppo di ratti collocati individualmente in una gabbia di osservazione accanto a una gabbia vuota¹⁸. Questa scoperta sostiene definitivamente la natura sociale dello sbadiglio e suggerisce che il contagio dello sbadiglio nei ratti dipende da spunti olfattivi. Tuttavia, quest'ultimo supporta solo il grado di familiarità tra coppie di ratti come coinvolti nel contagio dello sbadiglio, e gli spunti uditivi sono il canale probabile con cui si verifica il contagio dello sbadiglio¹⁸.

Nel complesso, questi sono risultati inaspettati secondo la previsione che ratti noti piuttosto che sconosciuti mostreranno sbadigli contagiosi. Anche se i risultati presentati non utilizzano un controllo positivo (non abbiamo dati in cui lo sbadiglio contagioso è osservato in individui strettamente correlati), si ritiene che questo metodo è imparziale per sbadigli contagiosi in ratti sconosciuti. Diversi elementi sostengono tale affermazione. In primo luogo, i ratti familiari e sconosciuti non differivano nelle frequenze medie dello sbadiglio¹⁸; così, le differenze nel contagio dello sbadiglio rilevato qui non sembravano dipendere da quanto spesso sbadigliavano. In secondo luogo, il fatto che lo stesso numero di sbadigli per ratto sia stato assegnato casualmente al periodo di osservazione e che ciò non producesse contagiosità di sbadigli in alcun gruppo rende più robusto il ritrovamento di sbadigli contagiosi in ratti sconosciuti. Infine, un'analisi di correlazione incrociata (per rilevare la corrispondenza contemporanea del comportamento) è stata precedentemente applicata¹⁸ allo stesso set di dati utilizzato in questo caso e il risultato è coinciso con quanto trovato. Pertanto, questo metodo è abbastanza sensibile da rilevare e misurare i cambiamenti nello sbadiglio contagioso.

In alternativa, ci si può chiedere se ciò che è stato trovato qui è contagioso sbadigliare. Tale preoccupazione non riguarda questo studio. Ci sono due prospettive da cui lo sbadiglio contagioso e la sua causalità hanno suscitato preoccupazioni. In primo luogo, l'empatia non sembra essere l'unico fattore alla base dello sbadiglio contagioso¹⁸, poiché le specie che non dovrebbero mostrare empatia e/o capacità di attribuzione dello stato mentale come pecore e ratti possono ancora mostrare uno sbadiglio contagioso. In secondo luogo, vi è una crescente preoccupazione che ciò che viene chiamato sbadigli contagioso potrebbe non essere tale. Per molti decenni (Thorpe, 1956; citato in precedenza¹⁰), modelli di comportamento contagiosi e stereotipati e sbadigli contagiosi in particolare sono stati considerati come un'espressione di facilitazione sociale. Più di recente, Kapitàny e Nielsen²⁵ hanno suggerito attraverso l'uso di dati simulati che ciò che è un errore di riconoscimento dei modelli percettivi può essere erroneamente chiamato sbadiglio contagioso. Pertanto, il problema potrebbe non risiedere nel modo in cui viene misurato lo sbadiglio contagioso, ma piuttosto nel modo in cui è definito.

In sintesi, il metodo qui proposto è utile per rilevare il contagio dello sbadiglio. Inoltre, è utile scartare alcuni segnali sensoriali, riducendo così il numero di segnali sensoriali a uno o due. Ulteriori esperimenti per testare previsioni specifiche sono necessari per distinguere gli effetti di un senso dall'altro.

Figura 1 : Schema dell'impostazione di osservazione per misurare lo sbadiglio contagioso. Quattro gabbie individuali sono state disposte in coppie su ciascun lato del tavolo a forma di T invertito. In ogni coppia, le gabbie erano una di fronte all'altra con divisori acrilici in mezzo. La situazione di prova specifica determina se il divisore tra le gabbie ha fori e se è chiaro o opaco. I camcorder sono stati posizionati strategicamente per registrare qualsiasi istanza del comportamento di sbadigliamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : curve di contagio dello Sbadiglio per nove coppie di ratti maschi sconosciuti esposti a (A) segnali olfattivi, (B) segnali visivi, (C) segnali olfattivi e visivi e (D) né segnali visivi né olfattivi. Ogni cerchio rappresenta la differenza media nel tasso di sbadiglio con 95% intervalli di confidenza (CI) da un ratto che sbadigliava nello stesso minuto o nel minuto (finestra temporale) che precede lo sbadiglio dell'altro ratto e quando non sbadigliava. I valori del tasso di sbadiglio al di sopra della linea tratteggiata indicano il contagio dello sbadiglio, mentre i valori al di sotto della linea tratteggiata indicano un contagio non sbadiglio. La linea continua che unisce i punti a ogni intervallo di tempo viene utilizzata per indicare la differenza media nei tassi di sbadiglio in ogni finestra temporale, quando il numero di sbadigli di ogni ratto è stato assegnato casualmente al periodo di osservazione di 60 min. La banda grigio scuro indica un CI del 95% ottenuto combinando il set di dati casuale delle quattro situazioni di prova ad ogni finestra temporale (una tonalità continua viene utilizzata per facilitare l'interpretazione della figura). Una coppia di ratti esposti a segnali olfattivi è stata rimossa dall'analisi perché nessuno dei ratti sbadigliò. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : curve di contagio dello Sbadiglio per nove paia di ratti maschi familiari esposti a (A) spunti olfattivi, (B) segnali visivi, (C) segnali olfattivi e visivi e (D) né segnali visivi né olfattivi. Ogni cerchio rappresenta la differenza media nel tasso di sbadiglio con 95% intervalli di confidenza (CI) da un ratto che sbadigliava nello stesso minuto o nel minuto (finestra temporale) che precede lo sbadiglio dell'altro ratto e quando non sbadigliava. I valori del tasso di sbadiglio al di sopra della linea tratteggiata indicano il contagio dello sbadiglio, mentre i valori al di sotto della linea tratteggiata indicano un contagio non sbadiglio. La linea continua indica la differenza media nei tassi di sbadigli osa alla finestra di ogni tempo in cui il numero di sbadigli di ogni ratto è stato assegnato casualmente al periodo di osservazione di 60 min. La banda grigio scuro indica un CI del 95% ottenuto combinando il set di dati casuale delle quattro situazioni di test in ogni finestra temporale. Una coppia di ratti esposti a segnali visivi è stata rimossa dall'analisi perché uno dei ratti non ha sbadigliato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Ci sono passaggi critici nel metodo che devono essere presi in considerazione per ottenere risultati positivi. I ratti familiari devono condividere le gabbie domestiche per almeno 1,5 mesi dopo lo svezzamento e prima di eseguire gli esperimenti. Tuttavia, ratti sconosciuti devono vivere in gabbie separate. In entrambi i casi, le coppie di ratti devono provenire da diverse cucciolate, ma devono essere il più simile possibile in base all'età. Per quanto riguarda le gabbie di osservazione, i loro fori dovrebbero corrispondere a quelli dei divisori, perché questo è l'unico modo per garantire il contatto olfattivo tra i ratti. I divisori, d'altra parte, dovrebbero essere abbastanza chiari da garantire un contatto visivo o abbastanza opaco da non garantire alcun contatto visivo. La partizione in legno tra una coppia di ratti e l'altra deve essere sufficiente per impedire ai ratti da un lato di vedere quelli dall'altro lato. Un altro aspetto cruciale è la progettazione appropriata dell'esperimento. Ogni volta che c'è il sospetto che un processo possa essere di parte, una procedura casuale dovrebbe essere attuata³⁰.

Il metodo non dovrebbe presentare seri problemi agli utenti. Fare i fori nel vetro era il principale problema tecnico affrontato, e per questo, invece, l'acrilico è stato utilizzato. Tuttavia, il vetro può essere utilizzato per realizzare tutte le gabbie di osservazione, a condizione che si ottenga una consulenza professionale. Si deve garantire che i bordi dei fori sono depositati per evitare schegge di vetro che possono ferire i ratti. Tuttavia, non è consigliabile modificare il metodo principale (ad esempio, rendere i fori più grandi). Inoltre, l'uso di un gruppo combinato di maschi e femmine può rendere difficile rilevare il contagio dello sbadiglio.

I divisori utilizzati qui possono essere insufficienti per impedire ai ratti di utilizzare segnali acustici, perché i ratti sono in grado di produrre e percepire suoni a frequenze a cui i materiali delle gabbie di osservazione e dei divisori probabilmente non si bloccavano. Tuttavia, questa situazione stessa consente di dedurre che i segnali uditivi hanno causato il contagio dello sbadiglio¹⁸ e che gli spunti olfattivi hanno facilitato solo il riconoscimento del grado di familiarità del partner. Pertanto, il metodo qui proposto fornisce ancora prove ragionevoli per identificare i sensi coinvolti nello sbadiglio contagioso e le loro intensità.

I metodi precedenti sono stati progettati per studiare lo sbadiglio contagioso in condizioni di laboratorio principalmente presentando video agli individui sperimentali^12,13, ma questi erano approcci discutibili in termini di validità biologica. Il metodo qui presentato risolve questa preoccupazione utilizzando animali socialmente interagenti in condizioni più simili a quelle che si verificano nel mondo reale. Inoltre, è possibile esplorare contemporaneamente la partecipazione di diverse modalità sensoriali in un unico set-up sperimentale. È riconosciuto che questo metodo non discrimina assolutamente tra gli effetti dei segnali uditivi e di altri segnali sensoriali. Tuttavia, un ulteriore esperimento ben progettato può consentire ai ricercatori di dedurre la modalità sensoriale più probabile coinvolta^{in 18}. Una possibile soluzione non invasiva è l'uso del rumore bianco per mascherare i suoni ed eliminare i segnali uditivi. Allo stesso modo, i ricercatori possono esporre ratti ingenui alla biancheria da letto dai ratti OC per determinare il ruolo dei segnali olfattivi, che è una procedura collaudata negli studi di social facilitation³².

L'uso di questo metodo può essere esteso per studiare il contagio dello sbadiglio in altre specie. Ad esempio, questo set-up può essere utilizzato dopo semplici modifiche con animali come topi e criceti per confrontare le curve di contagio dello sbadiglio. I confronti tra specie diverse possono rivelare modelli imprevisti. Il piano sperimentale di base può funzionare con animali più grandi come porcellini d'India, gatti e conigli. Allo stesso modo, il metodo può essere utilizzato per studiare altri comportamenti potenzialmente contagiosi come toelettatura e graffi. Il programma basato su R può ridurre il tempo impiegato per calcolare il contagio dello sbadiglio per diverse finestre temporali e può essere utilizzato per misurare il contagio dello sbadiglio in altre specie di vertebrati, a condizione che l'utente abbia precedentemente raccolto dati rilevanti.

In sintesi, i principali vantaggi di questo metodo sono il principale vantaggio dell'acquisizione di curve di contagio dello sbadiglio e l'aiuto alla discriminazione tra i ruoli relativi delle modalità sensoriali coinvolte. L'acquisizione di curve di contagio dello sbadiglio è, per quanto ne sappiamo, un nuovo approccio che può essere utile per misurare la forza di un contagio e osservare come questa intensità varia tra le specie. Di conseguenza, il metodo può essere utilizzato anche con alcune modifiche in altre specie animali come pecore¹⁶, lupi¹⁵, cani³³, serpenti³⁴, e pesce⁵. In tutte queste specie, ad eccezione dei serpenti, lo sbadiglio è stato precedentemente documentato. Infatti, un metodo simile a quello qui presentato è stato utilizzato con successo in budgerigars²⁷. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare altri tipi di comportamento che sono contagiosi. Ad esempio, comportamenti come la reattività emotiva, la toelettatura e graffi nei roditori possono essere contagiosi. Infatti, il metodo qui proposto ha mostrato una reattività emotiva contagiosa nei ratti familiari¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.