Summary
Описанный здесь метод направлен на получение кривых зеваций в парах знакомых или незнакомых самцов крыс. Клетки с отверстиями, разделенными либо четкими или непрозрачными перегородками с (или без) отверстия используются для обнаружения того, визуальные, обонятельные, или оба типа сенсорных сигналов могут стимулировать заразу зевоты.
Abstract
Общение является важным аспектом социальной жизни животных. Звери могут влиять друг на друга и собираются вместе в школах, стаях и стадах. Общение также способ половых взаимодействий во время ухаживания и как соперники урегулировать споры без борьбы. Тем не менее, есть некоторые поведенческие модели, для которых трудно проверить существование функции коммуникативной связи, потому что несколько типов сенсорных методов, вероятно, участвуют. Например, заразное зевая является коммуникационным актом у млекопитающих, который потенциально происходит через зрение, слух, запах, или сочетание этих чувств в зависимости от того, животные знакомы друг с другом. Поэтому для проверки гипотез о возможной коммуникативной роли такого поведения необходим подходящий метод для определения участвующих сенсорных условий.
Предложенный здесь метод направлен на получение кривых зеваций для знакомых и незнакомых крыс и оценку относительного участия визуальных и обонятельных сенсорных методов. Метод использует недорогие материалы, и с некоторыми незначительными изменениями, он также может быть использован с другими видами грызунов, таких как мыши. В целом, метод предполагает замену четких разделителей (с или без отверстий) непрозрачными разделителями (с отверстиями или без них), которые либо позволяют, либо препятствуют общению между крысами, помещенными в соседние клетки с отверстиями в соседних сторонах. Соответственно, можно протестировать четыре условия: обонятельная коммуникация, визуальная коммуникация, как зрительная, так и обонятельная коммуникация, и ни зрительная, ни обонятельная коммуникация. Как социальное взаимодействие происходит между крысами, эти условия испытаний моделируют то, что может произойти в естественной среде. В этой связи предлагаемый здесь метод более эффективен, чем традиционные методы, которые опираются на видеопрезентации, биологическая достоверность которых может вызывать озабоченность. Тем не менее, он не делает различий между потенциальной ролью слуха и ролью запаха и зрения в зевать заразу.
Introduction
Традиционно, коммуникативное поведение было изучено с двух точек зрения. С одной стороны, этиологи наблюдают и фиксируют поведение животных вестественных условиях и пытаются распознать его адаптивное значение 1. Особое чувство или чувства участие не были основным интересом этих исследований. С другой стороны, физиологи больше заинтересованы в распутывании механизмов, с помощью которых животные общаются1; следовательно, лабораторные исследования предоставили методы для решения роли, которую сенсорные методы играют в связи2,3. Эти две точки зрения действительно взаимодополняют друг друга, поскольку знание как адаптивной ценности, так и непосредственных механизмов необходимо для получения всестороннего понимания коммуникативного поведения в социальной жизни животных.
Зевая поведение является заметным компонентом поведенческого репертуара в нескольких видов позвоночных4, начиная от рыбы до приматов5. Его можно охарактеризовать как медленное открытие рта и поддержание его открытогоположения, за которым следует более быстрое закрытие рта 5. Продолжительность всей последовательности зависит от вида; например, приматы зевают дольше, чемнеприматные виды 6. Во многих видах, с людьми, являясь исключением, мужчины, как правило, зевают чаще, чем женщины7. Эта функция может лежать в основе возможной коммуникативной функции зевая, хотя регулярные модели зевая и его ежедневная частота может также предложить физиологическую функцию. У крыс спонтанное зевая следует циркадный ритм, с пиками высокой частоты, происходящими утром и днем8,9.
Одна интересная особенность зевая поведение является то, что это может быть заразным актом (когда освобождение стимул поведения случается быть другое животное ведет себя таким же образом10) в нескольких видов позвоночных11,12, 13,14,15,16, в том числе птиц17 и грызунов18. Кроме того, последние данные показали, что заразное зевая может отражать коммуникативную роль, потому что зевая одной крысы может повлиять на физиологическое состояние другого при воздействии обонятельных сигналов19. Однако, является ли или не зевая имеет коммуникальную роль по-прежнему обсуждается20,21, и анализ заразных зевая является важным первым шагом для решения этого вопроса.
С другой стороны, заразное зевая было связано со способностью животного сопереживать взглядам других животных; следовательно, тесно связанные лица, скорее всего, чтобы показать заразу4. Эта гипотеза часто тестировалась в лабораторных условиях, в которых животные представлены с зевотой стимулы на видео12,13; следовательно, заражение может произойти только через визуальные сигналы. Другие исследования оценили зевоту инфекции в более естественных условиях с использованием групп животных14,15. Основная проблема заключается в том, что социально взаимодействующие животные часто реагируют на сигналы и обмениваются сигналами, которые передаются через комбинации сенсорных способов. Разъяснение фактических чувств, участвующих в данном поведении от их комбинированных эффектов не всегда является легкой задачей. Как правило, исследователи фармакологически или хирургически препятствуют использованию животным того или иногочувства, а затем делают вывод о роли этого чувства в соответствующем поведении 2,3,18,22. К счастью, есть и другие методы, в которых только физические барьеры используются либо позволяют или препятствуют общению между животными23,24,25, тем самым достигнув большей биологической достоверности.
Предложенный здесь метод был специально разработан для изучения заразной зевая у знакомых и незнакомых крыс в социальной обстановке. Согласно эмпатической гипотезе, бывшая группа должна быть более восприимчива к заразному зевну. Метод не требует, чтобы животные были хирургически или фармакологически лишены каких-либо чувств. Вместо этого, он работает путем размещения крыс в соседних клетках с отверстиями и физически препятствуя их связи с помощью либо четкие или непрозрачные разделители с или без отверстий. Таким образом, можно изучить четыре тестовых условия: (1) обонятельная коммуникация (OC, перфорированный непрозрачный разделитель), (2) визуальная коммуникация (VC, неперфорированный прозрачный разделитель), (3) зрительная и обонятельная связь (VOC, перфорированный четкий разделитель) и (4) ни визуальной или обонятельной связи (NVOC, неперфорированный непрозрачный разделитель). Таким образом, исследователи могут сравнить относительный вклад обонятельных, визуальных и в некоторой степени, слуховые сигналы в зевоту инфекции. Этот подход не является новым, так как аналогичные методы были использованы для изоляции чувств, участвующих в некоторых коммуникативного поведения у животных, таких как ящерицы23 и мышей26. В самом деле, Gallup и коллеги27 использовали аналогичный метод, чтобы продемонстрировать роль визуальных сигналов в заразной зевая в budgerigars. Основными особенностями этих методов являются моделирование социального контекста и минимального стресса, нанесенного животным. Кроме того, использование взаимодействующих животных повышает биологическую обоснованность выводов.
Есть несколько способов измерения заразной зевая25,28. Д-р Стивен Е. Г. Леа (личное общение, 2015) помог нам численно адаптировать метод, ранее используемый приматологами13,14 для более раннего анализа данных, используемых здесь18. Представленный в этом протоколе расширенный вариант этого метода с более широким спектром приложений. Она состоит из взвешивания общего числа зевков крысы, внутри и за пределами данного временного окна, по доле времени наблюдения, соответствующей зевая внутри и за пределами временного окна.
Например, если предполагается, что крысы А и В наблюдаются в течение 12 мин, их зевая записывается до ближайшей минуты, и 3 мин время окна установлен для измерения заразной зевая. Далее рассматриваются следующие последовательности зевок для каждой из этих крыс: крыса А (0,0,0,0,0,0,2,0,0,0,0,2,1) и крыса B (0,1,0,0,1,1,0,0,0,0,3). Следует отметить, что каждое число (0-3) соответствует количеству зевок, забитых на каждом минуте. Для крысы А, в течение минут 1, 10 и 11 (числа жирным шрифтом), крыса B не зевает в течение предыдущих 3 минут (выбранное время) или в течение этой минуты. В эти минуты, крыса зевает в общей сложности 2 раза. Таким образом, скорость зевоты крысы без каких-либо зевать стимул (не-пост-зевок зевать скорость) составляет 2/3 (т.е., 0,67 зевает / мин). В оставшиеся 9 мин, крыса B зевает по крайней мере один раз в той же минуте или 3 предыдущих минут. Крыса зевает в общей сложности четыре раза в эти 9 мин. Таким образом, скорость зевоты крысы в ответ на зевоту стимула (пост-зевок зевать скорость) составляет 4/9 (т.е., 0,44 зевает / мин). Применение той же процедуры к крысе B дает не-пост-зевок скорость 2/3 (т.е., 0,66) и после зевоты скорость 5/9 (0,55).
С другой стороны, если зевая записывается до ближайшего десятичной минуты, зевать зараза приведет к скорректированной пост-зевая времени. Например, если в течение 12 мин период наблюдения за крысами А и В регистрируются следующие случаи зевоты: крысы А (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1)и крысы В (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Для крысы А, периоды времени, в течение которых крыса B не зевает в течение последних 3 мин, варьируются от 0 до 1,2 мин и от 8,1 до 11,2 мин (т.е. 3,1 мин), что дает в общей сложности 4,3 мин не-пост-зевав времени. Количество раз, что крыса зевает в те времена составляет три (числа жирным шрифтом), так что не-пост-зевок зевать ставка 3/4.3 (т.е., 0,69), в то время как после зевоты зевать ставка 3/7.7 (т.е., 0.38; деноминация от 12-4.3 мин). Аналогичным образом, для крысb B, периоды времени, в течение которых крыса не зевать в течение последних 3 мин варьируются от 0 до 2,3 мин и от 8,8 до 10,4 мин, что дает в общей сложности 3,9 мин. Количество раз крысы B зевает в течение этих периодов является одним, так что не-пост-зевок зевать ставка 1/3.9 (т.е., 0,25). Соответственно, скорость зевоты после зевоты составляет 6/8,1 (т.е. 0,74).
В то время как почти современный матч в поведении является идеальным критерием, чтобы продемонстрировать наличие инфекции, такие аспекты, как ограничения на то, что человек посещает, время реакции на стимул, распределение поведения с течением времени (например, зевая может произойти в эпизодах), и время, чтобы акклиматизироваться к экспериментальной настройки все приводят к различиям видов, что затрудняет использование уникального временного окна. Это может быть причиной, почему исследователи использовали временные окна, которые варьируются от секунд5 до нескольких минут11, что создает проблемы при сравнении результатов28. В связи с этим предлагается повторить описанную выше процедуру для различных временных окон для получения кривых зевать заразы и сравнить кривые заразы зевоты между видами.
Эквивалентные кривые заразы зевоты можно сравнить путем случайного распределения количества зевок, наблюдаемых для каждой крысы в течение периода наблюдения. Таким образом, предлагаемый метод измерения заразы зевоты предлагает два типа элементов управления: (1) скорость зевоты, возникающая вне временного окна (не после зевоты) и (2) кривая искусственного зевоты, полученная из случайного распределения числа зевоков. Таким образом, этот подход к анализу зевоты инфекции является шагом вперед от других процедур, таких, как сравнение процента или частоты зевая в течение одного временного окна, что происходит за пределами этого окна25, без учета фактические кадры раз. Метод дополняется R-программой29 для удобного и объективного расчета вероятности заразного зевания на один или несколько временных окон.
Чтобы проиллюстрировать полезность этого метода и преимущества программы на основе R, используется набор данных из ранее опубликованного исследования18. Экспериментальное состояние состояло из 144 крыс-самцов, выделенных либо в знакомое, либо в незнакомом состоянии. Крысы в каждом экспериментальном состоянии были подразделены на четыре подгруппы по девять пар и подверглись воздействию любой из четырех описанных выше ситуаций тестирования. Зевая поведения крыс в каждом экспериментальном состоянии и испытания ситуации были затем записаны в течение 60 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные протоколы и животноводство проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами.
1. Материалы
- Найдите полный список материалов, используемых для реализации метода, в таблицематериалов. Используйте рисунок 1 и обратитесь за советом экспертов, чтобы построить перевернутый Т-образный стол, клетки наблюдения, и клетки делителей. Следуйте показаниям по безопасности при использовании острых инструментов и потенциально опасных материалов.
- Сделайте перевернутый Т-образный стол, склеив два железнодорожных деревянных бруса (длина 45 см, отделенные 0,6 см друг от друга) на вершину и в середине кусок дерева (100 см х 45 см х 1,5 см). Затем поместите второй кусок дерева (50 см х 45 см х 0,6 см) вертикально между рельсоподобными решетками. Убедитесь, что этот второй кусок дерева предотвращает пару крыс с одной стороны от просмотра другой пары на противоположной стороне (Рисунок 1).
- Используйте стекло и акрил для создания восьми смотровых клеток. Убедитесь, что каждая клетка (19 см в ширину, 19 см в длину, 10 см в высоту, 3 мм толщиной) имеет 24 равномерных отверстия (диаметром 5 мм) в три ряда в середине одной из ее сторон. Сделайте эту сторону акрила (3 мм толщиной) и сократить высоту противоположной стороны на 0,7 см, чтобы крыса дышать.
- Убедитесь, что каждая клетка наблюдения имеет раздвижную крышку из акрила, чтобы предотвратить крысу от воспитания и отвлекает себя в течение 60 минут наблюдения период.
- Сделать четыре разделителя из акрила (19 см в ширину, 30 см в высоту, 3 мм толщиной). Просверлите 24 отверстия (диаметр 5 мм), которые соответствуют тем, которые в клетках наблюдения, каждый в одном прозрачном делителе и одном непрозрачном делителе.
- Заранее подготовьте листы данных для записи появления зевок. Включите в заголовки каждого листа данных имя наблюдателя, экспериментальное состояние (т.е. знакомые или незнакомые крысы), соответствующую ситуацию тестирования (OC, VC, VOC, NVOC), дату и начальное и окончательное время наблюдения. Разделите остальную часть листа данных на две колонки, каждая с числом крыс, написанных в верхней части, чтобы записать зевая поведение крыс.
2. Процедура
- Дом 144 самцов крыс в группах по четыре человека в пластиковых клетках (домашних клетках) от отлохоты до тех пор, пока они не достигнут 2,5 месяцев в возрасте. Не используйте самок крыс, потому что они, как правило, показывают большую вариацию в поведении из-за гормональных циклов, которые могут быть спутаны с последствиями тестовой ситуации. Убедитесь, что крысы в каждой клетке не братья и сестры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть трудно получить все крысы вместе. В этом случае, создать блоки по крайней мере 8 знакомых крыс и 8 незнакомых крыс, так что каждая тестовая ситуация представлена один раз в каждом экспериментальном состоянии30. - Чтобы идентифицировать крыс, пометьте их символическими числами на хвостах с помощью коммерческого маркера. Например, представляют числа от 1 до 4, комбинируя точки и линии (например, одна точка для числа 1 и одна линия для числа 4). Определите знакомых и незнакомых крыс с использованием разных цветов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте крыс в соответствии с инструкциями по безопасности, предоставляемыми персоналом животного комплекса, и соблюдайте рекомендации относительно правильного использования лабораторных животных в учреждении, где будут проводиться эксперименты. - Случайно выберите, в каких домашних клетках разместится группа знакомых крыс, а в каких будет размещена незнакомая группа. Например, предположим, что в четырех домашних клетках живут 16 крыс: число домашних клеток от 1 до 4, а затем используйте R (загрузите его в http://cran.r-project.org/) следующим образом: «после подсказки (зgt;)»:
Образец (4,4)
4 3 2 1- Группируйте знакомых (или незнакомых) крыс в домашних клетках 4 и 3, и группируйте незнакомых (или знакомых) крыс в домашних клетках 2 и 1. Убедитесь, что животные персонала объекта поддерживает личность каждой клетки и обрабатывает крыс таким же образом, как и все другие крысы в животном объекта.
- Используйте программу R снова и случайным образом выбрать крыс, чтобы сформировать каждую пару в каждом экспериментальном состоянии. Убедитесь, что крысы в каждой паре знакомых крыс происходят из одной домашней клетки, и убедитесь, что противоположное верно для пар в незнакомой группе. Случайно выбирайте пары крыс для каждой тестовой ситуации в каждом экспериментальном состоянии.
- Выполните два тестовых сеанса в день с двумя из восьми возможных тестовых ситуаций (четыре для каждой знакомой и незнакомой крысы) за тестовую сессию (т.е. 60 мин периода наблюдения). Проведите два тестовых сеанса последовательно в течение 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы провести все тестовые сессии (четыре пары крыс в день) либо утром или днем, чтобы избежать каких-либо смешанных факторов. Выполнить полную реплику (восемь тестовых ситуаций) эксперимента в течение двух дней подряд.- Убедитесь в том, чтобы использовать тестовые ситуации в случайной последовательности для каждого репликации эксперимента. Например, используйте номера от 1 до 8 для определения каждой тестовой ситуации, а затем используйте R следующим образом:
Образец (8,8)
8 7 4 6 5 1 2 3 - Выделите тестовые ситуации 8 и 7 для тестирования сессии 1, тестовые ситуации 4 и 6 для тестирования сессии 2 и так далее. Затем случайным образом выберите сторону перевернутой Т-образной таблицы, где будет размещена каждая пара крыс (тестовая ситуация).
- Убедитесь в том, чтобы использовать тестовые ситуации в случайной последовательности для каждого репликации эксперимента. Например, используйте номера от 1 до 8 для определения каждой тестовой ситуации, а затем используйте R следующим образом:
- Повторите ту же процедуру (шаги от 2,3 до 2,4,2) для второй репликации (т.е.блока) эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если цель исследования состоит в том, чтобы проверить последствия социального состояния (т.е. двух взаимодействующих крыс) на частоте зевая, используйте одну крысу, помещенную в клетку наблюдения рядом с пустой клеткой наблюдения в качестве контроля для каждой из четырех тестовых ситуаций. Выполните этот эксперимент 2x для каждой тестовой ситуации для контрольной группы из восьми крыс. - Настроили тестовый сеанс, перенеся первых четырех крыс из животного объекта в смотровую комнату, где они останутся в течение 15 минут, чтобы акклиматизироваться к новой среде. Транспорт крыс в отдельных клетках и держать их отдельно друг от друга во время транспортировки и в комнате наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям безопасности для перевозки животных, предоставляемых персоналом животного объекта и использовать указанную одежду для работы с животными в лаборатории. Крысы не будут иметь доступ к пище и воде, пока они находятся в комнате наблюдения. - После того, как период акклиматизации пройден, поместите перевернутый Т-образный стол на большую прямоугольную таблицу. Убедитесь, что есть потолк лампы, что достаточно освещает комнату при проведении наблюдений.
- Положите фильтровальную бумагу на дно каждой клетки наблюдения и поместите клетки парами с каждой стороны перевернутой Т-образной таблицы. Расположите соответствующий разделитель между каждой парой клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтровная бумага облегчает очистку клеток и обеспечивает шероховатую поверхность, по которой крысы могут двигаться без скольжения. - Стратегически место два цифровых видеокамер таким образом, что каждый записи зевая поведение каждой пары крыс. Убедитесь, что видеокамеры надежно закреплены на штативы и правильно ориентированы на клетки наблюдения. Подключите видеокамеры к настольному компьютеру, чтобы одновременно следить за поведением крыс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните цифровую информацию на флэш-накопителях, чтобы постоянно архивировать экспериментальные сеансы. Используйте флэш-накопители с высокой емкостью памяти. - После периода акклиматизации, поместите крыс в клетки наблюдения в соответствии с распределением ранее определены. Установите автоматический фокус видеокамеры и запустите видеозапись одновременно с помощью стоп-часа. Остановите видеозапись в конце периода наблюдения 60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как экспериментаторы могут находиться за пределами комнаты во время тестовой сессии и наблюдать удаленно, рекомендуется, чтобы один человек находится в комнате наблюдения (как можно дальше от экспериментальной настройки) при мониторинге поведения крыс, чтобы обеспечить, чтобы тестовый сеанс проходил без перерыва. - Когда наблюдение закончится, верните крыс в их домашние клетки в животном объекте. Попросите сотрудников животного комплекса, чтобы убедиться, что крысы имеют доступ к пище и воде снова. Тщательно очистите клетки наблюдения с помощью неоксичного моющего средства и подготовьте экспериментальную установку для выполнения вторых и заключительных тестовых сессий дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите древесину, чтобы удалить любые ароматы, оставленные крысами при размещении в клетках наблюдения, которые могут повлиять на поведение следующей пары крыс испытания. - Обучить одного-двух добровольцев частично слепым к назначенным процедурам для выявления и записи зевая с помощью метода выборки. Убедитесь, что наблюдатели используют определение зевая, описанное в разделе введения.
- Воспроизведение и проецировать каждое видео на экране компьютера с помощью любой стандартной системы воспроизведения. Попросите наблюдателя просмотреть каждое видео и наблюдать и записывать зияющее поведение с помощью ранее подготовленных листов данных, а затем позвольте ему просмотреть видео на более низких скоростях, чтобы повысить способность наблюдать и измерять зевая.
- Попросите наблюдателей забить зевая с помощью системы обозначения, аналогичной следующему: используйте вертикальные линии с минутой, написанной в качестве суперскрипта, чтобы представить появление зевоты (например,., 3 евро 6 евро 9, указывая один зевок на 3-й минуте, два зеват на 6-й минуте и один зевок на 9-й минуте). Оценка зевая как последовательность (например,1,2, 2,2, 3,2, 5,0, 5,8), чтобы записать его с большей точностью (минутокруг до одного десятичного места).
- Кроме того, непосредственно вводя данные из видео на компьютер с помощью стандартных программ сбора данных. Убедитесь, что наблюдатель знаком с такими программами.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости позвольте наблюдателю просматривать каждое видео более чем за один сеанс. Убедитесь, что один наблюдатель просматривает все видео, соответствующие одному блоку экспериментов. Если два разных наблюдателя просмотрели эти видео, может возникнуть риск того, что различия в их способности наблюдать и записывать зевая будут смужать последствия тестовых ситуаций. Важно набрать внутринаблюдатели надежность между различными наблюдателями на 10%-20% видео, чтобы гарантировать, что зевая аннотируется таким же образом.
3. Обработка данных
- Транскрибировать височная последовательность зевает в каждой крысы из листов данных в электронную таблицу. Убедитесь, что есть одна колонка для каждой крысы с коротким заголовком (например, fr1.l и fr1.r, чтобы указать первую пару знакомых крыс на левой и правой сторонах, соответственно). Убедитесь, что все столбцы имеют одинаковую длину, заполнив пустые ячейки 0 или NA (см. ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте общее руководство, представленное в качестве дополнительного документа, чтобы полностью понять следующие шаги по обработке данных, измерению заразного зевания и получению заразных кривых зевая.- Если зевая был записан до ближайшей минуты, введите число зевков в каждую соответствующую минуту и использовать 0 (без зевоты), чтобы заполнить клетки, когда не зевок произошло в данной минуте. Сохранить лист в виде текстового файла (.txt).
- Если зевая была записана до ближайшего десятичной минуты, введите в последовательности сверху вниз и используйте "NA" для заполнения пустых пространств столбцов (крыс), в которых количество зевок (рядов) ниже, чем у столбца с максимальным числом (рядами) зевает, записанных для r В. Сохранить лист в виде текстового файла (.txt).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку R имеет возможность работать с пустыми ячейками, лист может быть сохранен с помощью столбцов различной длины. Используйте параметры справки, предоставляемые R для обработки недостающих данных.
- Инициировать R. Импортируйте данные из файла, в котором они были ранее расположены.
- Сохранить коды программы с расширением ". R" (предоставляется в качестве дополнительного материала), а затем скачать конкретный код программы (см. общее руководство) в зависимости от того, зевает были записаны в качестве целых или дробных чисел. Запустите программу для каждой пары крыс и желаемого количества временных рамок.
- Запустите программу снова, теперь с помощью случайного распределения числа зевок от каждой крысы (см. общее руководство). Выполните одни и те же шаги (шаги от 3,3 до 3.3.1) для всех экспериментальных условий (т.е. знакомых и незнакомых крыс) и/или всех тестовых ситуаций. Продолжить, как указано в общем руководстве и экспортировать результаты в Excel.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо импорта ранее сохраненной программы, как предлагалось выше с помощью текстового редактора, скопировать и непосредственно вставить программу в рабочее пространство R.
- Запустите программу снова, теперь с помощью случайного распределения числа зевок от каждой крысы (см. общее руководство). Выполните одни и те же шаги (шаги от 3,3 до 3.3.1) для всех экспериментальных условий (т.е. знакомых и незнакомых крыс) и/или всех тестовых ситуаций. Продолжить, как указано в общем руководстве и экспортировать результаты в Excel.
- Для создания кривых заразы зевоты используйте данные, ранее сохраненные в электронной таблице. Вычесть не-зараза ставки для каждой пары крыс, временное окно, и тест ситуации. Отделить анализ наблюдаемых данных и искусственных (случайно распределенных) данных.
- Далее вычислите доверительные интервалы (CI) для каждого временного окна и тестовую ситуацию с помощью процедуры загрузки (см. общее руководство). Отделить анализы для знакомых и незнакомых крыс. Затем объедините искусственные данные из четырех тестовых ситуаций для каждого экспериментального состояния и вычислите CI для каждого временного окна с помощью процедуры загрузки.
- Далее создавайте сюжеты для каждой тестовой ситуации и экспериментального состояния (см. рисунок 2 и рисунок3). Наконец, выполнить многократный регрессионный анализ, чтобы сравнить интенсивность заражения зевотой между тестовыми ситуациями (см. ниже).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Крысы были отобраны из ранее произведенной подлинии Крыс Ыпраг-Доули, которые были выбраны для частого зевая (примерно 22 зевает в час31). Тем не менее, девять пар незнакомых и девять пар знакомых крыс мужского пола (между 2,5 и 3 месяцев) используется в тестовой ситуации зевнул примерно 12 раз в час, в среднем18. Поэтому тестовые ситуации для измерения зева заразы частично тормозят зевая поведение.
Зараза зевка была измерена в течение ряда временных окон, которые варьировались от 1 до 10 мин. На рисунке 2 показана средняя разница в показателях зевоты между незнакомыми крысами-мужчинами в условиях заражения и незараженными условиями для каждого временного окна и тестовой ситуации. Эти кривые зеваза указывают на то, что только крысы OC (в клетках с перфорированным, непрозрачным разделителем) показали зевоту зараза, которая очевидна из временного окна 4 и далее, потому что CI средних не пересекается с CI случайно выделенных чисел зевает в течение 60 мин. Группа указала, как и ожидалось, что случайное распределение числа зевок в каждой крысе в период наблюдения производится зевота ставки, которые колебались на уровне примерно нуля, не показывая каких-либо видимых закономерностей.
Многоличная модель регрессии, приспомещаемые к данным, показала, что кривые из четырех тестовых ситуаций были значительно разными (F1,3 и 11,5, стр. 0,0001). В частности, зевая зараза была сильнее у OC крыс, чем: VC крыс (крысы в клетках с неперфорированным, ясным разделителем; t -3.8, стр. 0.001), крысы ЛОС (крысы в клетках с перфорированным, прозрачным разделителем; t -5.74, стр. 0.0001) и крысы NVOC (крысы в клетках с неперфорированным, непрозрачным разделителем; t -2.64, стр. Во всех случаях степень свободы составила 695, поскольку в анализе учитывались не только четыре тестовые ситуации, но и 10 временных окон. По мере того как эти условия произвели автокоррелированные измерения, термин автокорреляции был добавлен (ARMA, autoregressive moving average) к статистической модели. Общие тенденции в течение 10 временных окон такжеотличались статистически от 0 наклона (F1,1 и 11,99, стр. 0,0001). Рисунок 3 показывает тот же анализ, что и на рисунке 2,применяемый к знакомым крысам-мужчинам. В этом случае ни одна из четырех тестовых ситуаций не стимулировала заразу зевоты, потому что их CI перекрывался со случайно сгенерированной полосой CI. Между четырьмя тестовыми ситуациямине было различий (F1,3 и стр. 0,14); хотя, общее увеличение зевоты зараза в течение 10 временных оконотличается от 0 склона (F1,1 и 9, стр. 0.01).
Роль olfaction в социальной жизни млекопитающих может быть причиной, почему только OC крысы показали зевоту зараза и зевнул чаще, чем VC крыс18. Визуальные сигналы, возможно, не способствовали зевая, потому что крысы-альбиносы не видят, а также не альбинокрысы. Тем не менее, VC крыс зевнул в два раза больше, чем группа крыс индивидуально помещены в клетку наблюдения рядом с пустой клетке18. Этот вывод окончательно поддерживает социальную природу зевая и предполагает, что зевота инфекции у крыс зависит от обонятельных сигналов. Тем не менее, последний только поддерживает степень знакомства между парами крыс, как участие в зевоте инфекции, и слуховые сигналы являются вероятным каналом, по которому зевая зараза происходит18.
В целом, это неожиданные результаты в соответствии с прогнозом, что знакомые, а не незнакомые крысы покажут заразной зевая. Хотя результаты, представленные не используют положительный контроль (у нас нет данных, в которых заразное зевая наблюдается в тесно связанных лиц), считается, что этот метод является беспристрастным для заразного зевая в незнакомых крыс. Несколько элементов поддерживают такое утверждение. Во-первых, знакомые и незнакомые крысы не отличались в средних частотах зевая18; таким образом, различия в зевотовой инфекции, обнаруженные здесь, как представляется, не зависят от того, как часто они зевают. Во-вторых, тот факт, что такое же количество зевок на крысу были случайным образом распределены в период наблюдения, и что это не производит зевоту зараза в любой группе делает вывод заразной зевая в незнакомых крыс более надежным. Наконец, кросс-корреляционный анализ (для обнаружения одновременного сопоставления поведения) ранее применялся18 к тому же набору данных, который использовался здесь, и результат совпал с найденным. Таким образом, этот метод является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить и измерить изменения в заразной зевая.
Кроме того, может возникнуть вопрос о том, что было найдено здесь заразной зевая. Такая озабоченность не является исключительной для этого исследования. Есть две точки зрения, с которых заразное зевая и его причинно-следственной связи вызвали озабоченность. Во-первых, сочувствие, кажется, не является единственным фактором, лежащим в основе заразной зевая18, как виды не ожидается, чтобы показать сочувствие и / или психического состояния атрибуции навыки, такие как овцы и крысы все еще может показать заразной зевая. Во-вторых, растет обеспокоенность тем, что так называемый заразный зевок может быть не как таковой. На протяжении многих десятилетий (Thorpe, 1956; цитируется ранее10), заразные, стереотипные модели поведения и заразной зевая, в частности, были рассмотрены как выражение социального упрощения. Совсем недавно Капитани и Нильсен25 предложили с помощью смоделированных данных, что то, что является ошибкой распознавания перцептивов, может быть неправильно названо заразным зевая. Таким образом, проблема может заключаться не в том, как измеряется заразная зевая, а в том, как она определяется.
Таким образом, предложенный здесь метод полезен для обнаружения зевации. Кроме того, полезно отказаться от некоторых сенсорных сигналов, тем самым уменьшая количество сенсорных сигналов только до одного или двух. Необходимы дальнейшие эксперименты для проверки конкретных прогнозов, чтобы отличить эффекты одного чувства от других.
Рисунок 1 : Схема настройки наблюдения для измерения заразного зевания. Четыре отдельные клетки были расположены парами с каждой стороны перевернутого Т-образного стола. В каждой паре клетки стояли лицом друг к другу с акриловыми разделителями между ними. Специфическая тестовая ситуация определяет, есть ли у разделителя между клетками отверстия и является ли он ясным или непрозрачным. Видеокамеры были стратегически помещены для записи любого случая зевая поведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Кривые заразы зевок для девяти пар незнакомых самцов крыс, подвергшихся воздействию (A) обонятельных сигналов, (B) визуальных сигналов, (C) обонятельных и визуальных сигналов, и (D) ни визуальных, ни обонятельных сигналов. Каждый круг представляет собой среднюю разницу в скорости зевоты с 95% доверительных интервалов (CI) от крысы, которая зевнула в ту же минуту или в минуту (время окна), предшествующих зевоту другой крысы и когда он не зевать. Значения скорости зевоты выше линии, указанной в заразе зевоты, в то время как значения ниже линии, накоторойбый утеса, указывают на заразу без зевоты. Твердая линия, соединяющая точки в каждом временном окне, используется для обозначения средней разницы в темпах зевоты в каждом временном окне, когда количество зевок каждой крысы случайным образом распределялось до периода наблюдения за 60 минут. Темно-серая полоса указывает на 95% CI, полученный путем объединения случайного набора данных из четырех тестовых ситуаций в каждом временном окне (непрерывный оттенок используется для облегчения интерпретации фигуры). Одна пара крыс, подвергшихся обонятельным сигналам, была удалена из анализа, потому что ни одна из крыс не зевнула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Кривые заразы зевок для девяти пар знакомых крыс-самцов, подвергающихся воздействию (A) обонятельных сигналов, (B) визуальных сигналов, (C) обонятельных и визуальных сигналов, и (D) ни визуальных, ни обонятельных сигналов. Каждый круг представляет собой среднюю разницу в скорости зевоты с 95% доверительных интервалов (CI) от крысы, которая зевнула в ту же минуту или в минуту (время окна), предшествующих зевоту другой крысы и когда он не зевать. Значения скорости зевоты выше линии, указанной в заразе зевоты, в то время как значения ниже линии, накоторойбый утеса, указывают на заразу без зевоты. Твердая линия указывает на среднюю разницу в темпах зевоты в каждое время окна, когда количество зевок каждой крысы было случайным образом распределены до 60 минут периода наблюдения. Темно-серая полоса указывает на 95% CI, полученный путем объединения случайного набора данных из четырех тестовых ситуаций в каждом временном окне. Одна пара крыс, подвергшихся воздействию визуальных сигналов, была удалена из анализа, потому что одна из крыс не зевнула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть критические шаги в методе, которые должны быть приняты во внимание для получения успешных результатов. Знакомые крысы должны делить домашние клетки, по крайней мере 1,5 месяца после отлохоты и перед запуском экспериментов. Однако незнакомые крысы должны жить в отдельных домашних клетках. В обоих случаях, пары крыс должны исходить из разных пометов, но быть как можно более похожими по возрасту, как это возможно. Что касается наблюдения клетки, их отверстия должны соответствовать тем, в разделителях, потому что это единственный способ гарантировать обонятельный контакт между крысами. Разделители, с другой стороны, должны быть достаточно четкими, чтобы обеспечить визуальный контакт или достаточно непрозрачным, чтобы не обеспечить визуальный контакт. Деревянная перегородка между одной парой крыс и другой должна быть достаточной, чтобы крысы с одной стороны не видели тех, кто находится на другой стороне. Другим важным аспектом является соответствующая конструкция эксперимента. Всякий раз, когда есть подозрение, что процесс может быть предвзятым, случайная процедура должна быть реализована30.
Метод не должен представлять серьезные проблемы для пользователей. Создание отверстий в стекле было главной технической проблемой, и из-за этого вместо него использовался акрил. Тем не менее, стекло может быть использовано для изготовления всех клеток наблюдения, при условии получения профессиональной консультации. Следует обеспечить, чтобы края отверстий подаются, чтобы избежать осколков стекла, которые могут ранить крыс. Однако изменение основного метода не рекомендуется (например, увеличение отверстий). Кроме того, использование комбинированной группы мужчин и женщин может затруднить обнаружение зеваза.
Разделители, используемые здесь, могут быть недостаточными для предотвращения использования крыс слуховыми сигналами, потому что крысы способны производить и воспринимать звуки на частотах, на которых материалы клетки наблюдения и разделители, вероятно, не блокировали. Тем не менее, эта ситуация сама по себе позволяет сделать вывод, что слуховые сигналы вызвали зевоту зараза18 и что обонятельные сигналы только способствовали признанию степени знакомства партнера. Таким образом, предложенный здесь метод по-прежнему предоставляет разумные доказательства для определения чувств, связанных с заразной зевая и их интенсивности.
Более ранние методы были разработаны для изучения заразного зевая в лабораторных условиях в основном путем представления видео для экспериментальных лиц12,13, но это были сомнительные подходы с точки зрения биологической достоверности. Представленный здесь метод решает эту проблему, используя социально взаимодействующих животных в условиях, более похожих на то, что происходит в реальном мире. Кроме того, можно одновременно изучить участие нескольких сенсорных способов в одной экспериментальной настройке. Признается, что этот метод не является абсолютно различать эффекты слуховых сигналов и других сенсорных сигналов. Тем не менее, хорошо продуманный дальнейший эксперимент может позволить исследователям сделать вывод о наиболее вероятной сенсорной модальности участие18. Одним из возможных неинвазивных решениеявляется использование белого шума, чтобы замаскировать звуки и устранить слуховые сигналы. Аналогичным образом, исследователи могут подвергать наивных крыс постельных принадлежностей от OC крыс, чтобы определить роль обонятельных сигналов, которая является проверенной процедурой в исследованиях социального облегчения32.
Использование этого метода может быть расширено для изучения зевоты инфекции у других видов. Например, эта настройка может быть использована после простых изменений с животными, такими как мыши и хомяки, чтобы сравнить кривые зевать заразы. Сравнения между различными видами могут выявить неожиданные закономерности. Основной экспериментальный план может работать с более крупными животными, такими как морские свинки, кошки и кролики. Аналогичным образом, метод может быть использован для изучения других потенциально заразных поведений, таких как уход и царапины. Программа на основе R может сократить время, затрачиваемые на расчет зевоты в течение нескольких временных окон, и может быть использована для измерения заражения зевотой у других видов позвоночных, при условии, что пользователь ранее собрал соответствующие данные.
Таким образом, основные преимущества этого метода приводят к приобретению кривых зеваций и пособничеству в дискриминации между относительными ролями сенсорных методов. Приобретение зияющие кривые инфекции, насколько нам известно, новый подход, который может быть полезен для измерения силы инфекции и наблюдать, как эта интенсивность варьируется между видами. Соответственно, метод также может быть использован с некоторыми изменениями в других видов животных, таких как овцы16,волки15, собаки33, змеи34, и рыба5. Во всех этих видах, кроме змей, зевая ранее были задокументированы. В самом деле, метод похож на тот, представленный здесь был успешно использован в budgerigars27. Этот метод также может быть использован для изучения других типов поведения, которые являются заразными. Например, такие виды поведения, как эмоциональная реактивность, уход и царапины у грызунов, могут быть заразными. В самом деле, метод, предложенный здесь показал заразной эмоциональной реактивности у знакомых крыс18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
А. М. частично финансировался Вместрестамия де Доченсия, Бенемерита университет Аутенома де Пуэбла. Мы особенно в долгу перед персоналом животного объекта "Клод Бернар" за использование крыс для съемки. Мы благодарим анонимных арбитров за их комментарии по ранним версиям этой рукописи. Презентация менее резкий и более сбалансированным из-за их вдумчивые комментарии
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic dividers | Handcrafted | Not available | Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction. |
| An R-based program | Benemérita Universidad Autónoma de Puebla | Not available | This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used. |
| Data sheets | The user can elaborate them | Not available | These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text. |
| Desktop computer | Any maker | Not available | Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour. |
| Digital camcorders | Any maker | Not available | They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session. |
| Flash drive | Any maker | Not available | Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording. |
| Glass cages | Handcrafted | Not available | Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken. |
| Markers | Sharpie or any other maker | Not available | Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail. |
| Pencils | Any maker | Not available | They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system. |
| R software | R Development Core Team | Not available | Download R at: http://cran.r-project.org/ |
| Rail-like wooden bars | Handcrafted | Not available | They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction. |
| Rectangular table | Any maker | Not available | This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour. |
| Sprague-Dawley male rats | Any local supplier of laboratory animals | Not available | Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Not available | Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription. |
| Square filter papers | Any maker | Not available | They are used for covering the cage's bottom. |
| Tripods | Any maker | Not available | They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages. |
| Wooden Inverted T-shaped table | Handcrafted | Not available | Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication. |
References
- Cézilly, F. A. History of Behavioural Ecology. Behavioural Ecology. Danchin, E., Giraldeau, L. A., Cézilly, F. , Oxford University Press. 3-27 (2008).
- Medina, L. M., Garcia, C. M., Urbina, A. F., Manjarrez, J., Moyaho, A. Female vibration discourages male courtship behaviour in the Amarillo fish (Girardinichthys multiradiatus). Behavioural Processes. 100, 163-168 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. Journal of Experimental Biology. 221 (8), 175166 (2018).
- Walusinski, O. Contagious Yawning. Encyclopedia of Animal Cognition. Vonk, J., Shackelford, T. K. , Springer Nature. Switzerland. 1-5 (2018).
- Baenninger, R. Some comparative aspects of yawning in Bettasplendens, Homosapiens, Pantheraleo, and Papio sphinx. Journal of Comparative Psychology. 101 (4), 349-354 (1987).
- Gallup, A. C., Church, A. M., Pelegrino, A. J. Yawn duration predicts brain weight and cortical neuron number in mammals. Biology Letters. 12, 20160545 (2016).
- Baenninger, R. On yawning and its functions. Psychonomic Bulletin and Review. 4 (2), 198-207 (1997).
- Anías, J., Holmgren, B., Urbá-Holmgren, R., Eguíbar, J. R.
- Holmgren, B., et al. Food anticipatory yawning rhythm in the rat. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 51 (3-4), 97-105 (1991).
- Byrne, R. W. The evolution of intelligence. Behaviour and Evolution. Slater, P. J. B., Halliday, T. R. , Cambridge University Press. Cambridge. 223-265 (1994).
- Provine, R. R. Yawning as a stereotyped action pattern and releasing stimulus. Ethology. 72 (2), 109-122 (1986).
- Provine, R. R. Faces as releasers of contagious yawning: An approach to face detection using normal human subjects. Bulletin of the Psychonomic Society. 27 (3), 211-214 (1989).
- Anderson, J. R., Myowa-Yamakoshi, M., Matsuzawa, T.
- Palagi, E., Leone, A., Mancini, G., Ferrari, P. F. Contagious yawning in gelada baboons as a possible expression of empathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (46), 19262-19267 (2009).
- Romero, T., Ito, M., Saito, A., Hasegawa, T. Social modulation of contagious yawning in wolves. PLoS One. 9 (8), e105963 (2014).
- Yonezawa, T., Sato, K., Uchida, M., Matsuki, N., Yamazaki, A.
- Miller, M. L., Gallup, A. C., Vogel, A. R., Vicario, S. M., Clark, A. B. Evidence for contagious behaviors in budgerigars (Melopsittacus undulatus): an observational study of yawning and stretching. Behavioral Process. 89 (3), 264-270 (2012).
- Moyaho, A., Rivas-Zamudio, X., Ugarte, A., Eguíbar, J. R., Valencia, J. Smell facilitates auditory contagious yawning in stranger rats. Animal Cognition. 18 (1), 279-290 (2015).
- Moyaho, A., Flores Urbina, A., Monjaraz Guzmán, E., Walusinski, O. Yawning: a cue and a signal. Heliyon. 3 (1), e00437 (2017).
- Gallup, A. C. Why do we yawn? Primitive versus derived features. Neuroscience&BiobehavioralReviews. 35, 765-769 (2011).
- Gallup, A. C., Clark, A. B. Commentary: Yawning, acute stressors, and arousal reduction in Nazca booby adults and nestlings. Frontiers in Psychology. 6, 1654 (2015).
- Fentress, J. C. Development of grooming in mice with amputated forelimbs. Science. 179 (4074), 704-705 (1973).
- Nicoletto, P. F. The roles of vision and the chemical senses in predatory behavior of the skink, Scincella lateralis. Journal of Herpetology. 19 (4), 487-491 (1985).
- Fehér, O., Wang, H., Saar, S., Mitra, P. P., Tchernichovski, O. De novo establishment of wild-type song culture in the zebra finch. Nature. 459 (7246), 564-568 (2009).
- Kapitány, R., Nielsen, M. Are yawns really contagious? A critique and quantification of yawn contagion. Adaptive Human Behavior Physiology. 3 (2), 134-155 (2017).
- Langford, D. J., et al. Social modulation of pain as evidence for empathy in mice. Science. 312 (5782), 1967-1970 (2006).
- Gallup, A. C., Swartwood, L., Militello, J., Sackett, S. Experimental evidence of contagious yawning in budgerigars (Melopsittacus undulatus). Animal Cognition. 18, 1051-1058 (2015).
- Campbell, M. W., de Waal, F. B. Methodological Problems in the Study of Contagious Yawning. The mystery of yawning in physiology and disease. Walusinski, O. , Karger Publishers. Basel. 120-127 (2010).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. http://www.R-project.org (2009).
- Moyaho, A., Beristain-Castillo, E. Experimental Design: Basic Concepts. Encyclopedia of Animal Behavior. Choe, J. C. 3, Second Edition, Academic Press. 471-479 (2019).
- Urbá-Holmgren, R., et al. Genotypic dependency of spontaneous yawning frequency in the rat. Behavioral Brain Research. 40 (1), 29-35 (1990).
- Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E.
- Joly-Mascheroni, R. M., Senju, A., Shepherd, A. J.
- Barthalmus, G. T., Zielinski, W. J. Xenopus skin mucus induces oral dyskinesias that promote escape from snakes. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 30 (4), 957-959 (1988).
