Un método de laboratorio para medir el bostezo contagioso en ratas

Summary

El método descrito aquí tiene como objetivo obtener curvas de contagio bostezan en pares de ratas macho familiares o desconocidas. Las jaulas con agujeros separados por particiones claras u opacas con (o sin) agujeros se utilizan para detectar si los tipos visuales, olfativos o ambos tipos de señales sensoriales pueden estimular el contagio bostezo.

Abstract

La comunicación es un aspecto esencial de la vida social animal. Los animales pueden influir unos en otros y unirse en escuelas, rebaños y rebaños. La comunicación es también la forma en que los sexos interactúan durante el noviazgo y cómo los rivales resuelven las disputas sin luchar. Sin embargo, hay algunos patrones de comportamiento para los que es difícil probar la existencia de una función de comunicación, porque varios tipos de modalidades sensoriales son probablemente involucrados. Por ejemplo, el bostezo contagioso es un acto comunicador en mamíferos que potencialmente ocurre a través de la vista, la audición, el olfato o una combinación de estos sentidos dependiendo de si los animales son familiares entre sí. Por lo tanto, para probar hipótesis sobre el posible papel comunicador de tales comportamientos, es necesario un método adecuado para identificar las modalidades sensoriales participantes.

El método propuesto aquí tiene como objetivo obtener curvas de contagio bostezo para ratas familiares y desconocidas y evaluar la participación relativa de las modalidades sensoriales visuales y olfativas. El método utiliza materiales baratos, y con algunos cambios menores, también se puede utilizar con otras especies de roedores como ratones. En general, el método implica la sustitución de divisores claros (con o sin agujeros) por divisores opacos (con o sin agujeros) que permiten o impiden la comunicación entre ratas colocadas en jaulas adyacentes con agujeros en los lados adyacentes. En consecuencia, se pueden probar cuatro condiciones: comunicación olfativa, comunicación visual, comunicación visual y olfativa, ni comunicación visual ni olfativa. A medida que se produce la interacción social entre las ratas, estas condiciones de prueba simulan lo que puede ocurrir en un entorno natural. A este respecto, el método propuesto aquí es más eficaz que los métodos tradicionales que se basan en presentaciones en vídeo cuya validez biológica puede suscitar preocupaciones. Sin embargo, no discrimina entre el papel potencial de la audición y los roles del olfato y la visión en el contagio bostezo.

Introduction

Tradicionalmente, el comportamiento comunicador se ha estudiado desde dos perspectivas. Desde una perspectiva, los etólogos observan y registran el comportamiento de los animales en entornos naturales e intentan reconocer su valor adaptativo¹. El sentido particular o los sentidos involucrados no han sido el interés principal de estos estudios. Desde otra perspectiva, los fisiólogos están más interesados en desentrañar los mecanismos por los cuales los animales comunican¹; por lo tanto, los estudios de laboratorio han proporcionadométodos para abordar el papel que desempeñan las modalidades sensoriales en la comunicación 2,³. Estas dos perspectivas son de hecho complementarias, porque el conocimiento tanto del valor adaptativo como de los mecanismos inmediatos es necesario para obtener una comprensión integral de los comportamientos comunicadores en la vida social de los animales.

El comportamiento bostezo es un componente visible del repertorio conductualen varias especies de vertebrados 4, que van desde peces hasta primates^5. Se puede describir como una lenta apertura de la boca y el mantenimiento de su posición abierta, seguido de un cierre más rápido de la boca⁵. La duración de toda la secuencia depende de la especie; por ejemplo, los primates bostezan durante más tiempo que las especies no primates⁶. En muchas especies, siendo los humanos la excepción, losmachos tienden a bostezar con más frecuencia que las hembras 7. Esta característica podría apuntalar la posible función comunicante de bostezar, aunque los patrones regulares de bostezo y su frecuencia diaria también pueden sugerir una función fisiológica. En ratas, el bostezo espontáneo sigue un ritmo circadiano, con picos de alta frecuencia que ocurren en la mañana y la tarde^8,9.

Una característica interesante del comportamiento bostezo es que puede ser un acto contagioso (cuando la liberación del estímulo de un comportamiento resulta ser otro animal que se comporta de la misma manera¹⁰) en varias especies de vertebrados^{11,12, 13,14,15,16}, incluyendo aves¹⁷ y roedores¹⁸. Además, la evidencia reciente ha indicado que el bostezo contagioso puede reflejar un papel comunicador, porque el bostezo de una rata puede afectar el estado fisiológico de otra cuando se expone a las señales olfativas¹⁹. Sin embargo, si el bostezo tiene o no un papel comunicador todavía está en debate^20,21,y analizar el bostezo contagioso es un primer paso esencial para resolver este problema.

Por otro lado, el bostezo contagioso se ha relacionado con la capacidad de un animal para empatizar con las perspectivas de otros animales; por lo tanto, los individuos estrechamente relacionados son más propensos a mostrar contagio⁴. Esta hipótesis ha sido frecuentemente probada en condiciones de laboratorio en las que los animales se presentan con estímulos de bostezo en el vídeo^12,13; por lo tanto, el contagio sólo puede ocurrir a través de señales visuales. Otras investigaciones han evaluado el contagio de bostezos en condiciones más naturales utilizando grupos de animales^14,15. Un problema importante de esto es que los animales que interactúan socialmente a menudo responden a señales e intercambian señales que se transmiten a través de combinaciones de modalidades sensoriales. Desenredar los sentidos reales involucrados en un comportamiento dado de sus efectos combinados no siempre es una tarea fácil. Típicamente, los investigadores farmacológicamente o quirúrgicamente obstaculizan el uso de un animal de un sentido dado, luego infieren el papel de ese sentido en el comportamiento relevante^2,3,18,22. Afortunadamente, existen otros métodos en los que sólo se utilizan barreras físicas para permitir o impedir la comunicación entre animales^23,24,25,logrando así una mayor validez biológica.

El método propuesto aquí ha sido diseñado específicamente para estudiar el bostezo contagioso en ratas familiares y desconocidas en un entorno social. Según la hipótesis empática, el grupo anterior debería ser más susceptible al bostezo contagioso. El método no requiere que los animales sean privados quirúrgica o farmacológicamente de ningún sentido. En su lugar, funciona colocando a las ratas en jaulas adyacentes con agujeros y obstruyendo físicamente su comunicación utilizando divisores claros u opacos con o sin agujeros. Así, se pueden examinar cuatro condiciones de prueba: (1) comunicación olfativa (OC, divisor opaco perforado), (2) comunicación visual (VC, divisor claro no perforado), (3) comunicación visual y olfativa (COV, divisor transparente perforado), y (4) ni comunicación visual ni olfativa (NVOC, divisor opaco no perforado). Por lo tanto, los investigadores pueden comparar las contribuciones relativas de olfativo, visual, y en cierta medida, señales auditivas en el contagio de bostezos. Este enfoque no es nuevo, ya que se han utilizado métodos similares para aislar los sentidos involucrados en ciertos comportamientos de comunicación en animales como lagartos²³ y ratones^26. De hecho, Gallup y sus colegas²⁷ han utilizado un método similar para demostrar el papel de las señales visuales en el bostezo contagioso en los budgerigars. Las principales características de estos métodos son la simulación de un contexto social y el mínimo estrés infligido a los animales. Además, el uso de animales que interactúan aumenta la validez biológica de las conclusiones.

Hay varias maneras de medir el bostezo contagioso^25,28. El Dr. Stephen E. G. Lea (comunicación personal, 2015) nos ayudó a adaptar numéricamente un método previamente empleado por los primatólogos^13,14 para un análisis anterior de los datos utilizados aquí¹⁸. En este protocolo se presenta una versión mejorada de este método con una gama más amplia de aplicaciones. Consiste en ponderar el número total de bostezos de una rata, dentro y fuera de una ventana de tiempo determinada, por la proporción de tiempo de observación correspondiente a los bostezos dentro y fuera de la ventana de tiempo.

Por ejemplo, si se supone que las ratas A y B se observan durante 12 minutos, su bostezo se registra en el minuto más cercano, y una ventana de tiempo de 3 minutos se establece para medir el bostezo contagioso. A continuación, se tienen en cuenta las siguientes secuencias de bostezos para cada una de esas ratas: rata A (0,0,0,1,0,0,2,0,0,0,0,2,1) y rata B (0,1,1,0,1,1,0,0,0, 0,0,0,3). Cabe señalar que cada número (0-3) corresponde al número de bostezos anotados en cada minuto. Para la rata A, durante los minutos 1, 10 y 11 (números en negrita), la rata B no bosteza dentro de los 3 minutos anteriores (la ventana de tiempo elegida) o dentro de ese minuto. En esos minutos, la rata A bosteza un total de 2 veces. Por lo tanto, la tasa de bostezos de la rata A sin ningún estímulo de bostezo (tasa de bostezo no post-bostezo) es 2/3 (es decir, 0,67 bostezos/min). En los 9 min restantes, la rata B bosteza al menos una vez en el mismo minuto o los 3 minutos anteriores. Rata Un bosteza un total de cuatro veces en esos 9 min. Por lo tanto, la tasa de bostezos de la rata A en respuesta a un estímulo de bostezo (tasa de bostezo sembrado post-bostezo) es 4/9 (es decir, 0,44 bostezos/min). La aplicación del mismo procedimiento a la rata B produce una tasa de bostezo no post-bostezo de 2/3 (es decir, 0,66) y una tasa de bostezo post-bostezo de 5/9 (0,55).

Por otro lado, si el bostezo se registra en el decimal más cercano de un minuto, el contagio bostezo resultará en un tiempo ajustado después de la bosteza. Por ejemplo, si se registran los siguientes tiempos de bostezo durante un período de observación de 12 minutos para ratas A y B: rata A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) y rata B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Para la rata A, los períodos de tiempo sobre los cuales la rata B no bosteza dentro de los últimos 3 min oscilan entre 0 y 1,2 min y de 8,1 a 11,2 min (es decir, 3,1 min), lo que produce un total de 4,3 min de tiempo no post-bostezo. El número de veces que la rata A bosteza durante esos tiempos es de tres (números en negrita), por lo que la tasa de bostezos no post-bostezos es 3/4.3 (es decir, 0.69), mientras que la tasa de bostezo post-bostezo es 3/7.7 (es decir, 0.38; el denominador de 12-4.3 min). Del mismo modo, para la rata B, los períodos de tiempo sobre los cuales la rata A no bosteza dentro de los últimos 3 min oscilan entre 0 y 2,3 min y de 8,8 a 10,4 min, lo que produce un total de 3,9 min. El número de veces que la rata B bosteza dentro de esos períodos es uno, por lo que la tasa de bostezos no post-bostezos es de 1/3,9 (es decir, 0,25). En consecuencia, la tasa de bostezos post-bostezos es 6/8.1 (es decir, 0,74).

Si bien una coincidencia casi contemporánea en el comportamiento es un criterio ideal para demostrar la presencia de un contagio, aspectos como las restricciones sobre lo que un individuo atiende, el tiempo de reacción a un estímulo, la distribución del comportamiento a lo largo del tiempo (por ejemplo, bostezar pueden ocurrir en episodios), y el tiempo para aclimatarse al entorno experimental todos dan lugar a diferencias de especies, lo que dificulta el uso de una ventana de tiempo única. Esta puede ser la razón por la que los investigadores han utilizado ventanas de tiempo que varían de segundos⁵ a varios minutos¹¹, lo que crea problemas al comparar los resultados²⁸. Debido a esto, se propone repetir el procedimiento descrito anteriormente para una gama de ventanas de tiempo para obtener curvas de contagio bostezo y comparar las curvas de contagio bostezo entre especies.

Las curvas de contagio de bostezos equivalentes se pueden comparar distribuyendo aleatoriamente el número de bostezos observados para cada rata durante el período de observación. Por lo tanto, el método propuesto para medir el contagio de bostezos ofrece dos tipos de controles: la (1) tasa de bostezos que se produce fuera de la ventana de tiempo (tiempo no post-bostezo) y (2) curva de contagio de bostezo artificial obtenida de la distribución aleatoria del número de bostezos. Por lo tanto, este enfoque para analizar el contagio bostezo es un paso adelante de otros procedimientos, como los que comparan el porcentaje o la frecuencia de bostezar dentro de una sola ventana de tiempo con la que ocurre fuera de esta ventana^25,sin tener en cuenta la marcos de tiempos reales. El método se complementa con un programa basado en R²⁹ para calcular de manera cómoda y objetiva la probabilidad de bostezo contagioso para una o más ventanas de tiempo.

Para ilustrar la utilidad de este método y las ventajas del programa basado en R, se utiliza un conjunto de datos de un estudio publicado anteriormente^18. La condición experimental consistía en 144 ratas macho asignadas a una condición familiar o desconocida. Las ratas en cada condición experimental fueron subdivididas en cuatro subgrupos de nueve pares y expuestas a cualquiera de las cuatro situaciones de prueba descritas anteriormente. Los comportamientos bostezos de las ratas en cada condición experimental y situación de prueba se registraron durante un período de 60 minutos.

Protocol

Los protocolos experimentales y la cría de animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales.

1. Materiales

1. Encuentre una lista completa de los materiales utilizados para implementar el método en la Tabla de materiales. Utilice la Figura 1 y busque asesoramiento experto para construir una mesa en forma de T invertida, jaulas de observación y divisores de jaulas. Siga las indicaciones de seguridad para el uso de herramientas afiladas y materiales potencialmente peligrosos.
2. Hacer una mesa invertida en forma de T pegando dos barras de madera similares a rieles (45 cm de longitud, separadas 0,6 cm una sella una de la otra) en la parte superior y en medio de un trozo de madera (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). A continuación, coloque una segunda pieza de madera (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) verticalmente entre las barras tipo riel. Asegúrese de que esta segunda pieza de madera impida que el par de ratas de un lado vea el otro par en el lado opuesto (Figura1).
3. Utilice vidrio y acrílico para crear ocho jaulas de observación. Asegúrese de que cada jaula (19 cm de ancho, 19 cm de largo, 10 cm de alto, 3 mm de espesor) tenga 24 agujeros equidistantes (5 mm de diámetro) dispuestos en tres filas en el medio de uno de sus lados. Haga este lado del acrílico (3 mm de espesor) y acorte la altura del lado opuesto en 0,7 cm para permitir que la rata respire.
   1. Asegúrese de que cada jaula de observación tiene una tapa deslizante hecha de acrílico para evitar que la rata se entretey y distraiga durante el período de observación de 60 minutos.
4. Hacer cuatro divisores de acrílico (19 cm de ancho, 30 cm de alto, 3 mm de espesor). Taladre 24 orificios (5 mm de diámetro) que coincidan con los de las jaulas de observación, cada uno en un divisor transparente y un divisor opaco.
5. Preparar hojas de datos con antelación para registrar la ocurrencia de bostezos. Incluya, en el encabezado de cada hoja de datos, el nombre del observador, la condición experimental (es decir, ratas familiares o desconocidas), la situación de prueba pertinente (OC, VC, VOC, NVOC), la fecha y los tiempos inicialy final de la observación. Divida el resto de la hoja de datos en dos columnas, cada una con el número de la rata escrito en la parte superior, para registrar el comportamiento bostezo de las ratas.

2. Procedimiento

1. Casa 144 ratas macho en grupos de cuatro en jaulas de plástico (jaulas para el hogar) desde el destete hasta que alcanzan los 2,5 meses de edad. No utilice ratas hembra, porque tienden a mostrar una mayor variación en el comportamiento debido a los ciclos hormonales, que pueden confundirse con los efectos de la situación de prueba. Asegúrese de que las ratas de cada jaula no sean hermanos.
   NOTA: Puede ser difícil obtener todas las ratas juntas. En ese caso, crear bloques de al menos 8 ratas familiares y 8 ratas desconocidas para que cada situación de prueba se represente una vez en cada condición experimental³⁰.
2. Para identificar a las ratas, márquelas con números simbólicos en las colas usando un marcador comercial. Por ejemplo, represente los números del 1 al 4 combinando puntos y líneas (por ejemplo, un punto para el número 1 y una línea para el número 4). Identifique ratas familiares y desconocidas utilizando diferentes colores.
   NOTA: Maneje a las ratas siguiendo las instrucciones de seguridad proporcionadas por el personal de las instalaciones para animales, y cumpla con las recomendaciones relativas al uso correcto de animales de laboratorio en la institución donde se realizarán los experimentos.
3. Elija al azar qué jaulas caseras albergarán al grupo de ratas conocidas y cuáles albergarán al grupo desconocido. Por ejemplo, supongamos que hay 16 ratas disponibles viviendo en cuatro jaulas domésticas: numerar las jaulas domésticas 1 a 4, luego utilizar R (descargarlo en http://cran.r-project.org/) de la siguiente manera [después de la solicitud (>)]:
   > muestra(4,4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Agrupe a las ratas familiares (o desconocidas) en jaulas domésticas 4 y 3, y agrupe a las ratas desconocidas (o familiares) en las jaulas domésticas 2 y 1. Asegúrese de que el personal de la instalación del animal mantenga la identidad de cada jaula y maneje las ratas de la misma manera que todas las demás ratas en las instalaciones de animales.
   2. Utilice el programa R de nuevo y elija al azar ratas para formar cada par en cada condición experimental. Asegúrese de que las ratas de cada par de ratas familiares se originen en la misma jaula doméstica, y asegúrese de que lo contrario es cierto para los pares en el grupo desconocido. Elija aleatoriamente pares de ratas para cada situación de prueba en cada condición experimental.
4. Realizar dos sesiones de prueba por día con dos de las ocho situaciones de prueba posibles (cuatro para cada ratas familiares y desconocidas) por sesión de prueba (es decir, período de observación de 60 minutos). Realizar las dos sesiones de prueba consecutivamente dentro de 3 h.
   NOTA: Asegúrese de llevar a cabo todas las sesiones de prueba (cuatro pares de ratas por día) ya sea por la mañana o por la tarde para evitar cualquier factor de confunción. Ejecute una réplica completa (ocho situaciones de prueba) del experimento durante dos días consecutivos.
   1. Asegúrese de utilizar las situaciones de prueba en una secuencia aleatoria para cada réplica del experimento. Por ejemplo, utilice los números 1 a 8 para identificar cada situación de prueba y, a continuación, utilice R de la siguiente manera:
      >muestra(8,8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Asigne las situaciones de prueba 8 y 7 para probar la sesión 1, las situaciones de prueba 4 y 6 para probar la sesión 2, y así sucesivamente. A continuación, elija aleatoriamente el lado de la tabla en forma de T invertida donde se colocará cada par de ratas (situación de prueba).
5. Repita el mismo procedimiento (pasos 2.3 a 2.4.2) para una segunda réplica (es decir, bloque) del experimento.
   NOTA: Si el objetivo del estudio es probar los efectos de una condición social (es decir, dos ratas que interactúan) en la frecuencia del bostezo, utilice una rata colocada en una jaula de observación junto a una jaula de observación vacía como control para cada una de las cuatro situaciones de prueba. Realice este experimento 2x para cada situación de prueba para un grupo de control de ocho ratas.
6. Establecer la sesión de prueba mediante la transferencia de las primeras cuatro ratas de la instalación del animal a la sala de observación, donde permanecerán durante 15 minutos para aclimatarse al entorno novedoso. Transportar a las ratas en jaulas individuales y mantenerlas separadas entre sí durante el transporte y en la sala de observación.
   NOTA: Siga las instrucciones de seguridad para el transporte de animales proporcionadas por el personal de la instalación animal y utilice la ropa indicada para trabajar con animales en el laboratorio. Las ratas no tendrán acceso a alimentos y agua mientras estén en la sala de observación.
7. Después de que haya pasado el período de aclimatación, coloque la mesa en forma de T invertida en una mesa rectangular más grande. Asegúrese de que haya una lámpara de techo que encienda suficientemente la habitación al hacer observaciones.
8. Coloque papel de filtro en la parte inferior de cada jaula de observación y coloque las jaulas en pares a cada lado de la mesa en forma de T invertida. Coloque el divisor correspondiente entre cada par de jaulas.
   NOTA: El papel filtrante facilita la limpieza de las jaulas y proporciona una superficie rugosa sobre la que las ratas pueden moverse sin resbalar.
9. Coloque estratégicamente dos videocámaras digitales de manera que cada uno registre el comportamiento bostezo de cada par de ratas. Asegúrese de que las videocámaras estén fijadas de forma segura a los trípodes y correctamente orientadas a las jaulas de observación. Conecte las videocámaras a un ordenador de sobremesa para supervisar simultáneamente el comportamiento de las ratas.
   NOTA: Almacene la información digital en las unidades flash para archivar permanentemente las sesiones experimentales. Utilice unidades flash con una alta capacidad de almacenamiento.
10. Después del período de aclimatación, coloque las ratas en las jaulas de observación de acuerdo con la asignación previamente determinada. Ajuste el enfoque automático de la videocámara e inicie la grabación de vídeo simultáneamente con un cronómetro. Detenga la grabación de vídeo al final del período de observación de 60 minutos.
    NOTA: Si bien los experimentadores pueden estar fuera de la sala durante la sesión de prueba y observar de forma remota, se recomienda que una persona esté en la sala de observación (lo más lejos posible del entorno experimental) mientras supervisa el comportamiento de las ratas asegurarse de que la sesión de prueba continúa sin interrupción.
11. Cuando la observación haya terminado, devuelva a las ratas a sus jaulas en las instalaciones de animales. Pida al personal de la instalación de animales que se asegure de que las ratas tengan acceso a alimentos y agua de nuevo. Limpie a fondo las jaulas de observación utilizando un detergente no tóxico y prepare la configuración experimental para realizar las segundas y últimas sesiones de prueba del día.
    NOTA: Limpie la madera para eliminar los aromas dejados por las ratas cuando se colocan en las jaulas de observación, lo que podría afectar el comportamiento del siguiente par de ratas probadas.
12. Capacitar a uno o dos voluntarios parcialmente ciegos a los tratamientos asignados para identificar y registrar bostezos utilizando un método de muestreo de ocurrencia total. Asegúrese de que los observadores utilizan la definición de bostezo que se describe en la sección de introducción.
13. Reproduzca y proyecte cada vídeo en la pantalla de un ordenador utilizando cualquier sistema de reproducción estándar. Pida al observador que vea cada video y observe y grabe el comportamiento bostezo usando las hojas de datos previamente preparadas, luego permítale revisar los videos a velocidades más lentas para mejorar la capacidad de observar y medir bostezos.
    1. Pida a los observadores que puntúen bostezos usando un sistema de notación similar al siguiente: utilice líneas verticales con el minuto escrito como superíndice para representar la ocurrencia de un bostezo (p.ej., . ^{3o 6} ? ⁹, indicando un bostezo en el minuto 3, dos bostezos en el minuto 6 y un bostezo en el minuto 9). Puntuar bostezo como una secuencia (por ejemplo,1.2, 2.2, 3.2, 5.0, 5.8) para grabarlo con mayor precisión (minutos redondeados a un decimal).
    2. Alternativamente, introduzca directamente datos de los vídeos en un ordenador mediante programas de recopilación de datos estándar. Asegúrese de que el observador esté familiarizado con estos programas.
       NOTA: Si es necesario, permita que el observador vea cada vídeo en más de una sesión. Asegúrese de que un observador ve todos los vídeos correspondientes a un bloque de experimentos. Si dos observadores diferentes vieron estos videos, puede haber un riesgo de que las diferencias en sus habilidades para observar y grabar bostezos confundan los efectos de las situaciones de prueba. Es importante puntuar la fiabilidad intraobservador entre diferentes observadores en el 10%-20% de los videos para asegurarse de que el bostezo se anota de la misma manera.

3. Procesamiento de datos

1. Transcribir la secuencia temporal de bostezos en cada rata de las hojas de datos a una hoja de cálculo. Asegúrese de que haya una columna para cada rata con un encabezado corto (por ejemplo, fr1.l y fr1.r para indicar el primer par de ratas conocidas en los lados izquierdo y derecho, respectivamente). Asegúrese de que todas las columnas tienen la misma longitud rellenando las celdas vacías con 0 o NA (consulte a continuación).
   NOTA: Utilice la guía general proporcionada como documento complementario para comprender completamente los siguientes pasos para procesar los datos, medir bostezos contagiosos y obtener curvas de bostezo contagiosas.
   1. Si se registró bostezo en el minuto más cercano, escriba el número de bostezos en cada minuto relevante y use 0 (sin bostezo) para rellenar las celdas cuando no se haya bostezo en un minuto determinado. Guarde la hoja de cálculo como un archivo de texto (.txt).
   2. Si el bostezo se registró en el decimal más cercano de un minuto, escriba la secuencia de arriba hacia abajo y use "NA" para rellenar los espacios vacíos de columnas (ratas) en los que el número de bostezos (filas) es menor que el de la columna con el número máximo (filas) de bostezos registrados para una r En. Guarde la hoja de cálculo como un archivo de texto (.txt).
      NOTA: Como R tiene la capacidad de trabajar con celdas vacías, la hoja de trabajo se puede guardar con columnas de diferentes longitudes. Utilice las opciones de ayuda proporcionadas por R para gestionar los datos que faltan.
2. Inicie R. Importe los datos del archivo en el que se encontraban anteriormente.
3. Guarde los códigos de programa con la extensión ". R" (proporcionado como material complementario), luego descargue el código de programa específico (ver guía general) dependiendo de si los bostezos se registraron como enteros o números fraccionarios. Ejecute el programa para cada par de ratas y el número deseado de marcos de tiempo.
   1. Ejecute el programa de nuevo, ahora utilizando una distribución aleatoria del número de bostezos de cada rata (ver guía general). Siga los mismos pasos (pasos 3.3 a 3.3.1) para todas las condiciones experimentales (es decir, ratas familiares y desconocidas) y/o todas las situaciones de prueba. Proceda como se indica en la guía general y exporte los resultados a Excel.
      NOTA: En lugar de importar un programa guardado anteriormente, como se sugirió anteriormente utilizando un editor de texto, copie y pegue directamente el programa en el espacio de trabajo de R.
4. Para crear curvas de contagio de bostezo, utilice los datos guardados anteriormente en una hoja de cálculo. Restar las tasas de no contagio de las tasas de contagio para cada par de ratas, ventana de tiempo y situación de prueba. Separe los análisis de los datos observados y los datos artificiales (distribuidos aleatoriamente).
   1. A continuación, calcule los intervalos de confianza (CI) para cada ventana de tiempo y situación de prueba mediante un procedimiento de arranque (consulte la guía general). Separe los análisis de ratas familiares y desconocidas. A continuación, combine los datos artificiales de las cuatro situaciones de prueba para cada condición experimental y calcule el CI para cada ventana de tiempo mediante un procedimiento de arranque.
   2. A continuación, cree trazados para cada situación de prueba y condición experimental (consulte la Figura 2 y la Figura 3). Por último, realice un análisis de regresión múltiple para comparar la intensidad del contagio de bostezos entre situaciones de prueba (ver más abajo).

Representative Results

Las ratas fueron seleccionadas de una sublínea producida previamente de ratas Sprague-Dawley que fueron seleccionadas para bostezar con frecuencia (aproximadamente 22 bostezos por hora^31). Sin embargo, los nueve pares de ratas macho desconocidas y nueve pares de ratas macho familiares (entre 2,5 y 3 meses de edad) utilizados por situación de prueba bostezaron aproximadamente 12 veces por hora, en promedio¹⁸. Por lo tanto, las situaciones de prueba para medir el contagio bostezo inhibió parcialmente el comportamiento bostezo.

El contagio de bostezos se midió en una serie de ventanas de tiempo que variaban de 1 a 10 min. La Figura 2 muestra la diferencia media en las tasas de bostezo entre ratas macho desconocidas en condiciones de contagio y no contagio para cada ventana de tiempo y situación de prueba. Estas curvas de contagio bostezo indican que sólo las ratas OC (en jaulas con un divisor perforado y opaco) mostraron un contagio de bostezo, lo que es evidente a partir de la ventana de tiempo 4 y en adelante, porque el CI de los promedios no se superpone con el CI de los números asignados aleatoriamente de bostezos durante el período de 60 minutos. La banda indicó, como era de esperar, que una asignación aleatoria del número de bostezos en cada rata en el período de observación producía tasas de bostezo que oscilaban aproximadamente a cero, sin mostrar ningún patrón aparente.

El modelo de regresión lineal múltiple ajustado a los datos indicaba que las curvas de las cuatro situaciones de prueba eran significativamente diferentes (F_1,3 a 11,5, p < 0,0001). Específicamente, el contagio de bostezos era más fuerte en ratas de OC que: ratas VC (ratas en jaulas con un divisor claro no perforado; t -3,8, p < 0,001), ratas voc(ratas en jaulas con un divisor perforado y claro; -5,74, p < 0.0001) y ratas NVOC (ratas en jaulas con un divisor opaco no perforado; -2,64, p < 0,01). En todos los casos, los grados de libertad fueron 695, ya que el análisis tuvo en cuenta no sólo las cuatro situaciones de prueba, sino también las 10 ventanas de tiempo. A medida que estas condiciones generaron mediciones autocorrelacionadas, se añadió un término de autocorrelación (ARMA, media móvil autoregresiva) al modelo estadístico. Las tendencias generales en los 10 períodos detiempo también diferían estadísticamente de una pendiente de 0 (F_1,1 a 11,99, p < 0,0001). La Figura 3 muestra el mismo análisis que el de la Figura2, aplicado a ratas macho familiares. En este caso, ninguna de las cuatro situaciones de prueba estimuló el contagio bostezo porque su CI se superponía con la banda CI generada aleatoriamente. No hubo diferencias entre lascuatro situaciones de prueba (F_1,3 a p a 0,14); sin embargo, el aumento general del contagio de bostezos enlas 10 ventanas de tiempo difería de una pendiente de 0 (F_1,1 a 9, p < 0,01).

El papel de la olfacción en la vida social de los mamíferos puede ser la razón por la que sólo las ratas OC mostraron contagio bostezo y bostezaron con más frecuencia que las ratas VC^18. Las señales visuales pueden no haber facilitado el bostezo, porque las ratas albinas no ven tan bien como las ratas no albinas. Sin embargo, las ratas VC bostezaron el doble que el grupo de ratas colocadas individualmente en una jaula de observación junto a una jaula vacía^18. Este hallazgo apoya definitivamente la naturaleza social del bostezo y sugiere que el contagio de bostezos en ratas depende de señales olfativas. Sin embargo, este último sólo apoya el grado de familiaridad entre los pares de ratas como estar involucrado en el contagio bostezo, y las señales auditivas son el canal probable por el cual el contagio de bostezo ocurre¹⁸.

En general, estos son resultados inesperados de acuerdo con la predicción de que las ratas familiares en lugar de desconocidas mostrarán bostezos contagiosos. Aunque los resultados presentados no utilizan un control positivo (no tenemos datos en los que se observe un bostezo contagioso en individuos estrechamente relacionados), se cree que este método es imparcial para bostezar con contagiosas en ratas desconocidas. Varios elementos respaldan tal alegación. En primer lugar, las ratas familiares y desconocidas no diferían en las frecuencias medias del bostezo^18; por lo tanto, las diferencias en el contagio de bostezos detectados aquí no parecían depender de la frecuencia con la que bostezaban. En segundo lugar, el hecho de que el mismo número de bostezos por rata se asignaran aleatoriamente al período de observación y que esto no produjera un contagio de bostezos en ningún grupo hace que el hallazgo de bostezos contagiosos en ratas desconocidas sea más robusto. Por último, un análisis de correlación cruzada (para detectar la coincidencia contemporánea del comportamiento) se aplicó anteriormente¹⁸ al mismo conjunto de datos utilizado aquí, y el resultado coincidió con lo encontrado. Por lo tanto, este método es lo suficientemente sensible como para detectar y medir los cambios en el bostezo contagioso.

Alternativamente, se puede cuestionar si lo que se encontró aquí es bostezo contagioso. Tal preocupación no es exclusiva de este estudio. Hay dos perspectivas desde las cuales el bostezo contagioso y su causalidad han suscitado preocupaciones. En primer lugar, la empatía no parece ser el único factor subyacente a los bostezos contagiosos^18,ya que las especies que no se espera muestren empatía y/o habilidades de atribución del estado mental, como ovejas y ratas, todavía pueden mostrar bostezos contagiosos. En segundo lugar, existe una creciente preocupación de que lo que se llama bostezo contagioso podría no ser como tal. Durante muchas décadas (Thorpe, 1956; citado anteriormente¹⁰), patrones de comportamiento contagiosos y estereotipados y bostezos contagiosos en particular han sido considerados como una expresión de facilitación social. Más recientemente, Kapitány y Nielsen²⁵ sugirieron mediante el uso de datos simulados que lo que es un error de reconocimiento de patrones perceptivos puede llamarse incorrectamente bostezos contagiosos. Por lo tanto, el problema puede no estar en la forma en que se está midiendo el bostezo contagioso, sino más bien en cómo se define.

En resumen, el método propuesto aquí es útil para detectar el contagio bostezo. Además, es útil descartar algunas señales sensoriales, reduciendo así el número de señales sensoriales a sólo una o dos. Se necesitan más experimentos para probar predicciones específicas para distinguir los efectos de un sentido de los demás.

Figura 1 : Esquema de la configuración de observación para medir el bostezo contagioso. Cuatro jaulas individuales estaban dispuestas en pares a cada lado de la mesa en forma de T invertida. En cada par, las jaulas estaban enfrentadas entre sí con divisores acrílicos en el medio. La situación de prueba específica determina si el divisor entre las jaulas tiene agujeros y si es claro u opaco. Las videocámaras fueron colocadas estratégicamente para registrar cualquier caso de comportamiento bostezo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Curvas de contagio de bostezo para nueve pares de ratas macho desconocidas expuestas a (A) señales olfativas, (B) señales visuales, (C) señales olfativas y visuales, y (D) ni señales visuales ni olfativas. Cada círculo representa la diferencia media en la tasa de bostezos con intervalos de confianza del 95% (CI) de una rata que bostezó en el mismo minuto o en el minuto (ventana de tiempo) que precede al bostezo de la otra rata y cuando no bostezó. Los valores de velocidad de bostezo por encima de la línea discontinua indican contagio de bostezo, mientras que los valores por debajo de la línea discontinua indican contagio no bostezo. La línea sólida que une los puntos en cada ventana de tiempo se utiliza para indicar la diferencia media en las tasas de bostezo en cada ventana de tiempo cuando el número de bostezos de cada rata se asignó aleatoriamente al período de observación de 60 minutos. La banda gris oscura indica un IC del 95% obtenido combinando el conjunto de datos aleatorio de las cuatro situaciones de prueba en cada ventana de tiempo (se utiliza un tono continuo para facilitar la interpretación de la figura). Un par de ratas expuestas a señales olfativas fue eliminada del análisis porque ninguna de las ratas bostezó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Curvas de contagio de bostezo para nueve pares de ratas macho familiares expuestas a (A) señales olfativas, (B) señales visuales, (C) señales olfativas y visuales, y (D) ni señales visuales ni olfativas. Cada círculo representa la diferencia media en la tasa de bostezos con intervalos de confianza del 95% (CI) de una rata que bostezó en el mismo minuto o en el minuto (ventana de tiempo) que precede al bostezo de la otra rata y cuando no bostezó. Los valores de velocidad de bostezo por encima de la línea discontinua indican contagio de bostezo, mientras que los valores por debajo de la línea discontinua indican contagio no bostezo. La línea sólida indica la diferencia media en las tasas de bostezo en cada ventana de tiempo cuando el número de bostezos de cada rata se asignó aleatoriamente al período de observación de 60 minutos. La banda gris oscura indica un IC del 95% obtenido combinando el conjunto de datos aleatorio de las cuatro situaciones de prueba en cada ventana de tiempo. Un par de ratas expuestas a señales visuales fue eliminada del análisis porque una de las ratas no bostezó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hay pasos críticos en el método que deben tenerse en cuenta para obtener resultados exitosos. Las ratas familiares deben compartir jaulas caseras durante al menos 1,5 meses después del destete y antes de ejecutar los experimentos. Sin embargo, las ratas desconocidas deben vivir en jaulas domésticas separadas. En ambos casos, los pares de ratas deben provenir de diferentes camadas, pero ser tan similares en edad como sea posible. En cuanto a las jaulas de observación, sus agujeros deben coincidir con los de los divisores, ya que esta es la única manera de garantizar el contacto olfativo entre las ratas. Los divisores, por otro lado, deben ser lo suficientemente claros como para garantizar un contacto visual u lo suficientemente opaco como para garantizar que no haya contacto visual. La partición de madera entre un par de ratas y el otro debe ser suficiente para evitar que las ratas de un lado vean a las del otro lado. Otro aspecto crucial es el diseño adecuado del experimento. Siempre que exista la sospecha de que un proceso puede ser sesgado, se debe implementar un procedimiento aleatorio³⁰.

El método no debe presentar problemas graves a los usuarios. Hacer los agujeros en el vidrio era el principal problema técnico al que se enfrentaba, y debido a eso, se utilizó acrílico en su lugar. No obstante, el vidrio puede utilizarse para fabricar todas las jaulas de observación, siempre que se obtenga asesoramiento profesional. Debe asegurarse de que los bordes de los agujeros se archivan para evitar astillas de vidrio que pueden dañar a las ratas. Sin embargo, no se recomienda modificar el método principal (por ejemplo, hacer que los agujeros sean más grandes). Además, el uso de un grupo combinado de machos y hembras puede dificultar la detección del contagio bostezo.

Los divisores utilizados aquí pueden ser insuficientes para evitar que las ratas utilicen señales auditivas, porque las ratas son capaces de producir y percibir sonidos a frecuencias en las que los materiales de las jaulas de observación y divisores probablemente no bloquearon. Sin embargo, esta situación en sí misma permite inferir que las señales auditivas causaron el contagio de bostezo18 y que las señales olfativas sólo facilitaron el reconocimiento del grado de familiaridad de la pareja. Por lo tanto, el método propuesto aquí todavía proporciona pruebas razonables para identificar los sentidos involucrados en el bostezo contagioso y sus intensidades.

Los métodos anteriores han sido diseñados para estudiar el bostezo contagioso en condiciones de laboratorio principalmente mediante la presentación de videos a los individuos experimentales^12,13, pero estos fueron enfoques cuestionables en términos de validez biológica. El método presentado aquí resuelve esta preocupación mediante el uso de animales que interactúan socialmente en condiciones más similares a lo que ocurre en el mundo real. Además, es posible explorar simultáneamente la participación de varias modalidades sensoriales en una sola configuración experimental. Se reconoce que este método no discrimina absolutamente entre los efectos de las señales auditivas y otras señales sensoriales. Sin embargo, un experimento adicional bien diseñado puede permitir a los investigadores inferir la modalidad sensorial más probable involucrada¹⁸. Una posible solución no invasiva es el uso de ruido blanco para enmascarar sonidos y eliminar señales auditivas. Del mismo modo, los investigadores pueden exponer ratas ingenuas a la ropa de cama de ratas OC para determinar el papel de las señales olfativas, que es un procedimiento probado en los estudios de facilitación social³².

El uso de este método se puede extender para estudiar el contagio bostezo en otras especies. Por ejemplo, esta configuración se puede utilizar después de simples modificaciones con animales como ratones y hámsters para comparar curvas de contagio bostezos. Las comparaciones entre diferentes especies pueden revelar patrones inesperados. El plan experimental básico puede funcionar con animales más grandes como conejillos de indias, gatos y conejos. Del mismo modo, el método se puede utilizar para estudiar otros comportamientos potencialmente contagiosos como el aseo y el rascado. El programa basado en R puede reducir el tiempo dedicado al cálculo del contagio de bostezos durante varias ventanas de tiempo y se puede utilizar para medir el contagio de bostezos en otras especies de vertebrados, siempre que el usuario haya recopilado previamente datos relevantes.

En resumen, las principales ventajas de este método son la consejera de la adquisición de curvas de contagio de bostezos y la discriminación entre las funciones relativas de las modalidades sensoriales involucradas. La adquisición de curvas de contagio de bostezo es, por lo que sabemos, un enfoque novedoso que puede ser útil para medir la fuerza de un contagio y observar cómo esta intensidad varía entre especies. En consecuencia, el método también se puede utilizar con algunas modificaciones en otras especies animales como ovejas^16,lobos^15,perros^33,serpientes³⁴y peces 5. En todas estas especies excepto serpientes, el bostezo ha sido documentado previamente. De hecho, un método similar al presentado aquí se ha utilizado con éxito en budgerigars²⁷. Este método también se puede utilizar para estudiar otros tipos de comportamiento que son contagiosos. Por ejemplo, comportamientos como la reactividad emocional, el acicalamiento y los arañazos en roedores pueden ser contagiosos. De hecho, el método propuesto aquí mostró una reactividad emocional contagiosa en ratas familiares^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.