Um método laboratorial para medir o bocejo contagioso em ratos

Summary

O método descrito aqui tem como objetivo obter curvas de contágio de bocejo em pares de ratos machos familiares ou desconhecidos. As gaiolas com furos separados por divisórias desobstruídas ou opacas com (ou sem) furos são usadas para detectar se Visual, olfactory, ou ambos os tipos de sugestões sensoriais podem estimular o contágio do bocejo.

Abstract

A comunicação é um aspecto essencial da vida social animal. Os animais podem influenciar uns aos outros e se reúnem em escolas, rebanhos e rebanhos. A comunicação também é a forma como os sexos interagem durante o namoro e como os rivais resolver disputas sem lutar. No entanto, existem alguns padrões comportamentais para os quais é difícil testar a existência de uma função comunicativa, pois vários tipos de modalidades sensoriais provavelmente estão envolvidos. Por exemplo, o bocejo contagioso é um ato comunicatório em mamíferos que potencialmente ocorre através da visão, audição, cheiro, ou uma combinação desses sentidos, dependendo se os animais são familiares uns aos outros. Portanto, para testar hipóteses sobre o possível papel comunicatório de tais comportamentos, é necessário um método adequado para identificar as modalidades sensoriais participantes.

O método proposto aqui visa obter curvas de contágio de bocejo para ratos familiares e desconhecidos e avaliar a participação relativa de modalidades sensoriais visuais e olfatórios. O método usa materiais baratos, e com algumas pequenas alterações, ele também pode ser usado com outras espécies de roedores, como camundongos. Globalmente, o método envolve a substituição de divisores claros (com ou sem furos) com divisores opacos (com ou sem furos) que permitem ou impedem a comunicação entre ratos colocados em gaiolas adjacentes com furos em lados adjacentes. Conformemente, quatro circunstâncias podem ser testadas: uma comunicação olfactory, uma comunicação visual, uma comunicação visual e olfactory, e nem uma comunicação visual nem olfactory. Como a interação social ocorre entre os ratos, essas condições de teste simulam o que pode ocorrer em um ambiente natural. A este respeito, o método proposto aqui é mais eficaz do que os métodos tradicionais que dependem de apresentações de vídeo cuja validade biológica pode suscitar preocupações. Não obstante, não discrimina entre o papel potencial da audição e os papéis do cheiro e da visão no contágio do bocejo.

Introduction

Tradicionalmente, o comportamento comunicatório tem sido estudado a partir de duas perspectivas. De uma perspectiva, os etologistas observam e registram o comportamento dos animais em configurações naturais e tentam reconhecer seu valor adaptativo¹. O sentido particular ou os sentidos envolvidos não foram o interesse preliminar destes estudos. De outra perspectiva, os fisiologistas estão mais interessados em desvendar os mecanismos pelos quais os animais se comunicam¹; assim, estudos laboratoriais têm proporcionado métodos para abordar o papel que as modalidades sensoriais desempenham na comunicação^2,3. Essas duas perspectivas são de fato complementares, pois o conhecimento do valor adaptativo e dos mecanismos imediatos é necessário para obter uma compreensão compreensiva dos comportamentos comunicatórios na vida social dos animais.

O comportamento de bocejo é um componente conspícuo do repertório comportamental em várias espécies de vertebrados⁴, variando de peixes a primatas⁵. Pode ser descrita como uma abertura lenta da boca e manutenção de sua posição aberta, seguida por um fechamento mais rápido da boca⁵. A duração de toda a sequência depende da espécie; por exemplo, primatas bocejam para durações mais longas do que as espécies não-primatas⁶. Em muitas espécies, sendo os seres humanos a exceção, os machos tendem a bocejar mais freqüentemente do que as fêmeas⁷. Esta característica pôde sustentam a função comunicatory possível de bocejar, embora os testes padrões regulares do bocejo e de sua freqüência diária possam igualmente sugerir uma função physiological. Em ratos, o bocejo espontâneo segue um ritmo circadiano, com picos de alta freqüência ocorrendo na manhã e tarde^8,9.

Uma característica interessante do comportamento de bocejo é que pode ser um ato contagioso (quando o estímulo liberador de um comportamento passa a ser outro animal se comportando da mesma forma¹⁰) em várias espécies de vertebrados^{11,12, 13,14,15,16}, incluindo pássaros¹⁷ e roedores¹⁸. Além disso, evidências recentes indicaram que o bocejo contagioso pode refletir um papel comunicatório, pois o bocejo de um rato pode afetar o estado fisiológico de outro quando exposto a pistas olfativas¹⁹. No entanto, se o bocejo tem ou não um papel comunicatório ainda está em debate^20,21, e analisando o bocejo contagioso é um primeiro passo essencial para resolver esta questão.

Por outro lado, o bocejo contagioso tem sido ligado à capacidade de um animal de empatia com as perspectivas de outros animais; Portanto, indivíduos estreitamente relacionados são mais propensos a mostrar contágio⁴. Esta hipótese tem sido freqüentemente testada em condições laboratoriais em que os animais são apresentados com estímulos de bocejo no vídeo^12,13; Portanto, o contágio só pode ocorrer através de pistas visuais. Outras investigações avaliaram o contágio de bocejo em condições mais naturais usando grupos de animais^14,15. Um grande problema disso é que os animais socialmente interagindo muitas vezes respondem a pistas e sinais de troca que são transmitidos através de combinações de modalidades sensoriais. Desentangling os sentidos reais envolvidos em um determinado comportamento de seus efeitos combinados nem sempre é uma tarefa fácil. Tipicamente, os pesquisadores dificultam farmacologicamente ou cirurgicamente o uso de um animal de um determinado senso, então inferem o papel desse sentido no comportamento relevante^2,3,18,22. Felizmente, existem outros métodos em que apenas barreiras físicas são usadas para permitir ou impedir a comunicação entre os animais²³,^24,25, obtendo assim maior validade biológica.

O método proposto aqui foi projetado especificamente para estudar o bocejo contagioso em ratos familiares e desconhecidos em um ambiente social. De acordo com a hipótese empática, o primeiro grupo deve ser mais suscetível ao bocejo contagioso. O método não exige que os animais sejam cirurgicamente ou farmacologicamente privados de quaisquer sentidos. Em vez disso, ele funciona colocando os ratos em gaiolas adjacentes com furos e obstruindo fisicamente sua comunicação usando divisores claros ou opacos com ou sem furos. Assim, quatro condições de teste podem ser examinadas: (1) Comunicação olfativa (OC, divisor opaco perfurado), (2) comunicação visual (VC, divisor claro não perfurado), (3) comunicação visual e olfativa (VOC, divisor claro perfurado) e (4) nem comunicação visual e olfatória (NVOC, divisor opaco não perfurado). Conseqüentemente, os investigadores podem comparar as contribuições relativas de olfactory, Visual, e até certo ponto, indicações auditivas no contágio do bocejo. Essa abordagem não é nova, pois métodos semelhantes têm sido utilizados para isolar os sentidos envolvidos em determinados comportamentos comunicatórios em animais como lagartos²³ e camundongos²⁶. Na verdade, Gallup e colegas²⁷ usaram um método semelhante para demonstrar o papel das pistas visuais no bocejo contagioso em budgerigars. As principais características destes métodos são a simulação de um contexto social e o stress mínimo infligido aos animais. Além disso, o uso de animais interagindo aumenta a validade biológica das conclusões.

Existem várias maneiras de medir o bocejo contagioso^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicação pessoal, 2015) nos ajudou a adaptar numericamente um método anteriormente empregado pelos primatólogos^13,14 para uma análise mais precoce dos dados utilizados aqui¹⁸. Apresentado neste protocolo é uma versão melhorada deste método com uma gama mais ampla de aplicações. Consiste na ponderação do número total de bocejos de um rato, dentro e fora de uma janela de tempo dada, pela proporção de tempo de observação correspondente aos bocejos dentro e fora da janela de tempo.

Por exemplo, se se supor que os ratos A e B são observados por 12 min, seu bocejo é gravado ao minuto o mais próximo, e uma janela de tempo de 3 minutos é ajustada para medir bocejo contagioso. Em seguida, as seguintes sequências de bocejos para cada um desses ratos são consideradas: Rat A (0, 0, 0, 1, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 2, 1) e Rat B (0, 1, 1, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 0,0, 3). Deve-se notar que cada número (0-3) corresponde ao número de bocejos marcados em cada minuto. Para o rato A, durante os minutos 1, 10 e 11 (números em negrito), o rato B não bocejo dentro dos 3 min precedentes (a janela de tempo escolhida) ou dentro desse minuto. Naqueles minutos, um rato bocejos um total de 2 vezes. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A sem nenhum estímulo do bocejo (taxa do bocejo do não-borne-bocejo) é 2/3 (isto é, 0,67 yawns/min). Nos 9 min restantes, o rato B boceja pelo menos uma vez no mesmo minuto ou nos 3 minutos precedentes. Rat a bocejos um total de quatro vezes naqueles 9 min. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A em resposta a um estímulo do bocejo (taxa do bocejo do borne-bocejo) é 4/9 (isto é, 0,44 yawns/min). A aplicação do mesmo procedimento para Rat B produz uma taxa de bocejo não pós-bocejo de 2/3 (i.e., 0,66) e taxa de bocejo pós-bocejo de 5/9 (0,55).

Por outro lado, se o bocejo é gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, o contágio de bocejo resultará em um tempo pós-bocejo ajustado. Por exemplo, se os seguintes tempos de bocejo forem gravados durante um período de observação de 12 min para os ratos A e B: rato A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) e Rat B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Para o rato a, os períodos de tempo sobre que o rato B não bocejo dentro da escala passada de 3 minutos de 0 a 1,2 de minuto e de 8,1 a 11,2 minutos (isto é, 3,1 minutos), que rende um total de 4,3 minutos do tempo do não-borne-bocejo. O número de vezes que um rato bocejos durante esses tempos é três (números em negrito), assim que a taxa de bocejo não-post-bocejo é 3/4.3 (ou seja, 0,69), enquanto a taxa de bocejo pós-bocejo é 3/7.7 (ou seja, 0,38; o denominador de 12-4.3 min). Similarmente, para o rato B, os períodos de tempo sobre que rato A não bocejo dentro dos 3 minutos passados variam de 0 a 2,3 minutos e de 8,8 a 10,4 minutos, que rende um total de 3,9 minutos. O número de vezes que o rato B bocejos dentro daqueles períodos é um, assim que a taxa do bocejo do não-borne-bocejo é 1/3.9 (isto é, 0,25). Consequentemente, a taxa do bocejo do borne-bocejo é 6/8.1 (isto é, 0,74).

Enquanto um fósforo próximo-contemporâneo no comportamento é um critério ideal para demonstrar a presença de um contágio, aspectos como as restrições sobre o que um indivíduo atende, tempo de reação a um estímulo, distribuição do comportamento ao longo do tempo (por exemplo, bocejo pode ocorrer em episódios), e tempo para aclimatizar ao cenário experimental todos dão origem a diferenças de espécies, dificultando a utilização de uma janela de tempo única. Esta pode ser a razão pela qual os pesquisadores usaram janelas de tempo que variam de segundos⁵ a vários minutos¹¹, o que cria problemas ao comparar os resultados²⁸. Por causa disso, propõe-se repetir o procedimento descrito acima para uma série de janelas de tempo para obter curvas de contágio de bocejo e comparar as curvas de contágio de bocejo entre as espécies.

As curvas equivalentes do contágio do bocejo podem ser comparadas distribuindo aleatòria o número de bocejos observados para cada rato sobre o período de observação. Assim, o método proposto para medir o contágio do bocejo oferece dois tipos de controles: a (1) taxa de bocejo ocorrendo fora da janela de tempo (tempo não pós-bocejo) e (2) curva de contágio de bocejo artificial obtida a partir da distribuição aleatória do número de bocejos. Portanto, essa abordagem para analisar o contágio do bocejo é um passo em frente de outros procedimentos, como aqueles que comparam a porcentagem ou frequência de bocejo dentro de uma única janela de tempo àquela que ocorre fora desta janela²⁵, sem ter em conta o quadros de tempos reais. O método é complementado por um programa baseado em R²⁹ para calcular convenientemente e objetivamente a probabilidade de bocejar contagioso para uma ou mais janelas de tempo.

Para ilustrar a utilidade deste método e das vantagens do programa baseado em R, é utilizado um conjunto de dados de um estudo publicado anteriormente¹⁸ . A condição experimental consistiu em 144 ratos machos alocados a uma condição familiar ou desconhecida. Os ratos em cada condição experimental foram subdivididos em quatro subgrupos de nove pares e expostos a qualquer uma das quatro situações de teste descritas acima. Os comportamentos de bocejo dos ratos em cada condição experimental e a situação do teste foram gravados então durante um período de 60 minutos.

Protocol

Os protocolos experimentais e a criação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais.

1. materiais

1. Encontre uma lista completa dos materiais usados para implementar o método na tabela de materiais. Use a Figura 1 e procure aconselhamento especializado para construir uma tabela em forma de T invertida, gaiolas de observação e divisores de gaiola. Siga as indicações de segurança para o uso de ferramentas afiadas e materiais potencialmente perigosos.
2. Faça uma tabela em forma de T invertida, colando duas barras de madeira como trilho (45 cm de comprimento, separadas 0,6 cm uns dos outros) na parte superior e no meio de um pedaço de madeira (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). Então, coloc uma segunda parte de madeira (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) verticalmente entre as barras Rail-like. Assegure-se de que este segundo pedaço de madeira impeça o par de ratos de um lado de ver o outro par no lado oposto (Figura 1).
3. Use vidro e acrílico para criar oito gaiolas de observação. Assegure-se de que cada gaiola (19 cm de largura, 19 cm de comprimento, 10 cm de altura, 3 mm de espessura) tenha 24 furos equidistantes (5 mm de diâmetro) dispostos em três fileiras no meio de um dos seus lados. Faça este lado do acrílico (3 milímetros de espessura) e encurte a altura do lado oposto por 0,7 cm para permitir que o rato respire.
   1. Certifique-se de cada gaiola de observação tem uma tampa deslizante feita de acrílico para evitar que o rato de criação e distraindo-se durante o período de observação de 60 min.
4. Fazer quatro divisores de acrílico (19 cm de largura, 30 cm de altura, 3 mm de espessura). Perfure 24 furos (diâmetro de 5 milímetros) que combinam aqueles nas gaiolas da observação, cada um em um divisor desobstruído e em um divisor opaco.
5. Prepare as folhas de dados com antecedência para registrar a ocorrência de bocejos. Incluir, no título de cada folha de dados, o nome do observador, condição experimental (ou seja, ratos familiares ou desconhecidos), situação de teste relevante (OC, VC, VOC, NVOC), a data, e os tempos iniciais e finais da observação. Divida o resto da folha de dados em duas colunas, cada uma com o número do rato escrito na parte superior, para gravar o comportamento de bocejo dos ratos.

2. procedimento

1. Casa 144 ratos machos em grupos de quatro em gaiolas de plástico (gaiolas de casa) de desmame até chegar a 2,5 meses de idade. Não use ratos fêmeas, porque tendem a mostrar uma maior variação no comportamento devido aos ciclos hormonais, que podem ser confundidos com os efeitos da situação do teste. Certifique-se de que os ratos em cada gaiola não são irmãos.
   Nota: pode ser difícil obter todos os ratos juntos. Nesse caso, crie blocos de pelo menos 8 ratos familiares e 8 ratos desconhecidos para que cada situação de teste seja representada uma vez em cada condição experimental³⁰.
2. Para identificar os ratos, marcá-los com números simbólicos nas caudas usando um marcador comercial. Por exemplo, represente os números de 1 a 4 combinando pontos e linhas (por exemplo, um ponto para o número 1 e uma linha para o número 4). Identifique ratos familiares e desconhecidos usando cores diferentes.
   Nota: Manuseie os ratos seguindo as instruções de segurança fornecidas pelo pessoal da instalação animal e cumpra as recomendações relativas à utilização correcta de animais de laboratório na instituição onde serão realizados experimentos.
3. Escolha aleatoriamente quais gaiolas casa vai abrigar o grupo de ratos familiares e que irá abrigar o grupo desconhecido. Por exemplo, suponha que existam 16 ratos disponíveis vivendo em quatro gaiolas domésticas: número de gaiolas de casa 1 a 4, em seguida, use R (baixá-lo em http://cran.r-project.org/) da seguinte maneira [após o prompt (>)]:
   > amostra (4, 4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Agrupe os ratos familiares (ou desconhecidos) em gaiolas domésticas 4 e 3, e agrupe os ratos desconhecidos (ou familiares) em gaiolas domésticas 2 e 1. Certifique-se de que o pessoal da instalação animal mantém a identidade de cada gaiola e manuseia os ratos da mesma forma que todos os outros ratos na instalação animal.
   2. Use o programa R novamente e escolha aleatoriamente ratos para formar cada par em cada condição experimental. Assegure-se de que os ratos em cada par de ratos familiares originam da mesma gaiola Home, e assegure-se de que o oposto seja verdadeiro para os pares no grupo desconhecido. Escolha aleatoriamente pares de ratos para cada situação de teste em cada condição experimental.
4. Realize duas sessões de teste por dia com duas das oito situações de teste possíveis (quatro para cada ratos familiares e desconhecidos) por sessão de teste (i.e., período de observação de 60 min). Realize as duas sessões de teste consecutivamente dentro de 3 h.
   Nota: Certifique-se de realizar todas as sessões de teste (quatro pares de ratos por dia), tanto de manhã ou à tarde para evitar quaisquer fatores de confusão. Execute uma réplica completa (oito situações de teste) do experimento em dois dias consecutivos.
   1. Certifique-se de usar as situações de teste em uma seqüência aleatória para cada repetição do experimento. Por exemplo, use os números 1 a 8 para identificar cada situação de teste e, em seguida, use R da seguinte maneira:
      > amostra (8, 8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Alocar situações de teste 8 e 7 para testar a sessão 1, testar situações 4 e 6 para testar a sessão 2 e assim por diante. Em seguida, escolha aleatoriamente o lado da tabela em forma de T invertida, onde cada par de ratos (situação de teste) será colocado.
5. Repita o mesmo procedimento (etapas 2,3 a 2.4.2) para uma segunda repetição (ou seja, bloco) do experimento.
   Nota: se o objetivo do estudo é testar os efeitos de uma condição social (ou seja, dois ratos interagindo) na frequência de bocejo, use um rato colocado em uma gaiola de observação ao lado de uma gaiola de observação vazia como um controle para cada uma das quatro situações de teste. Realize este experimento 2x para cada situação de teste para um grupo de controle de oito ratos.
6. Configurar a sessão de teste, transferindo os primeiros quatro ratos da instalação animal para a sala de observação, onde permanecerá por 15 min para aclimatar ao ambiente novo. Transportar os ratos em gaiolas individuais e mantê-los separados uns dos outros durante o transporte e na sala de observação.
   Nota: siga as instruções de segurança para transportar animais fornecidos pelo pessoal da instalação animal e utilize as roupas indicadas para trabalhar com animais em laboratório. Os ratos não terão acesso a alimentos e água enquanto estão na sala de observação.
7. Após o período de aclimatização ter passado, coloque a tabela em forma de T invertida em uma mesa retangular maior. Certifique-se que há uma lâmpada do teto que ilumina suficientemente o quarto ao fazer observações.
8. Coloque o papel de filtro na parte inferior de cada gaiola de observação e coloque as gaiolas em pares em cada lado da tabela em forma de T invertida. Posicione o divisor correspondente entre cada par de gaiolas.
   Nota: o papel de filtro facilita a limpeza das gaiolas e proporciona uma superfície áspera na qual os ratos podem mover-se sem escorregar.
9. Coloc estrategicamente duas câmaras de vídeo digitais tais que cada um registra o comportamento de bocejo de cada par de ratos. Certifique-se que as câmaras de vídeo são fixadas com segurança aos tripés e orientadas corretamente às gaiolas da observação. Conecte as câmaras de vídeo a um computador desktop para monitorar simultaneamente o comportamento dos ratos.
   Nota: armazene as informações digitais em drives flash para arquivar permanentemente as sessões experimentais. Use Flash drives com uma alta capacidade de armazenamento.
10. Após o período de aclimatização, coloque os ratos nas gaiolas de observação de acordo com a alocação previamente determinada. Defina o foco automático da filmadora e inicie a gravação de vídeo simultaneamente com um cronômetro. Pare a gravação de vídeo no final do período de observação de 60 min.
    Nota: enquanto os experimentadores podem estar fora da sala durante a sessão de teste e observando remotamente, recomenda-se que uma pessoa está na sala de observação (o mais longe possível do ambiente experimental), enquanto monitorando o comportamento dos ratos para Certifique-se de que a sessão de teste prossegue sem interrupção.
11. Quando a observação terminar, devolva os ratos para suas gaiolas domésticas na instalação animal. Peça ao pessoal da instalação animal para garantir que os ratos tenham acesso a alimentos e água novamente. Limpe cuidadosamente as gaiolas de observação usando um detergente não tóxico e prepare a preparação experimental para realizar as segundas e finais sessões de teste do dia.
    Nota: Limpe a madeira para remover quaisquer aromas deixados pelos ratos quando colocados nas gaiolas de observação, o que pode afetar o comportamento do próximo par de ratos testados.
12. Treinar um a dois voluntários parcialmente cegos para os tratamentos atribuídos para identificar e gravar bocejar usando um método de amostragem de todas as ocorrências. Certifique-se de que os observadores usem a definição de bocejo descrita na seção de introdução.
13. Reproduzir e projetar cada vídeo em uma tela de computador usando qualquer sistema de reprodução padrão. Peça ao observador para ver cada vídeo e observar e gravar o comportamento de bocejo usando as folhas de dados previamente preparadas, em seguida, permitir-lhe rever os vídeos em velocidades mais lentas para aumentar a capacidade de observar e medir bocejar.
    1. Peça aos observadores para marcar bocejar usando um sistema de notação semelhante ao seguinte: Use linhas verticais com o minuto escrito como um sobrescrito para representar a ocorrência de um bocejo (por exemplo, | ³ | | ⁶ . º | ⁹, indicando um bocejo no minuto 3, dois bocejos no minuto 6, e um bocejo no minuto 9). Pontuação bocejando como uma seqüência (por exemplo, 1,2, 2,2, 3,2, 5,0, 5,8) para gravá-lo com maior precisão (minutos arredondados para uma casa decimal).
    2. Alternativamente, insira diretamente os dados dos vídeos em um computador usando programas de coleta de dados padrão. Certifique-se de que o observador está familiarizado com esses programas.
       Observação: se necessário, permita que o observador exiba cada vídeo em mais de uma sessão. Assegure-se de que um observador vista todos os vídeos correspondentes a um bloco de experimentos. Se dois observadores diferentes viram esses vídeos, pode haver um risco de que as diferenças em suas habilidades para observar e gravar bocejo irá confundir os efeitos das situações de teste. É importante marcar a confiabilidade intraobservador entre diferentes observadores em 10%-20% dos vídeos para garantir que o bocejo seja anotado da mesma forma.

3. processamento de dados

1. Transsequenciar a sequência temporal de bocejos em cada rato das folhas de dados para uma folha de cálculo. Assegure-se de que há uma coluna para cada rato com um título curto (por exemplo, FR1. l e FR1. r para indicar o primeiro par de ratos familiares nos lados esquerdo e direito, respectivamente). Certifique-se de que todas as colunas têm o mesmo comprimento preenchendo as células vazias com 0 ou NA (veja abaixo).
   Nota: Use o guia Geral fornecido como um documento complementar para compreender plenamente as seguintes etapas para processar os dados, medir bocejo contagioso e obter curvas de bocejo contagiosas.
   1. Se o bocejo foi gravado para o minuto mais próximo, digite o número de bocejos em cada minuto relevante e use 0 (sem bocejo) para preencher as células quando nenhum bocejo ocorreu em um determinado minuto. Guarde a folha de cálculo como um ficheiro de texto (. txt).
   2. Se o bocejo foi gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, digite a seqüência de cima para baixo e use "NA" para preencher os espaços vazios de colunas (ratos) em que os números de bocejos (linhas) é menor do que a da coluna com o número máximo (linhas) de bocejos gravados para um r Em. Guarde a folha de cálculo como um ficheiro de texto (. txt).
      Nota: como R tem a capacidade de trabalhar com células vazias, a folha de cálculo pode ser guardada com colunas de comprimentos diferentes. Use as opções de ajuda fornecidas pelo R para manipular dados ausentes.
2. Iniciar R. importe os dados do arquivo no qual eles foram localizados anteriormente.
3. Guarde os códigos de programa com a extensão ". R "(fornecido como material complementar), em seguida, baixar o código do programa específico (Ver guia geral), dependendo se bocejos foram gravados como números inteiros ou fracionários. Execute o programa para cada par de ratos e o número desejado de prazos.
   1. Execute o programa novamente, agora usando uma distribuição aleatória do número de bocejos de cada rato (Ver guia geral). Siga as mesmas etapas (etapas 3,3 a 3.3.1) para todas as condições experimentais (ou seja, ratos familiares e desconhecidos) e/ou todas as situações de teste. Proceda como indicado no guia geral e exporte os resultados para o Excel.
      Observação: em vez de importar um programa salvo anteriormente, como sugerido acima usando um editor de texto, copie e cole diretamente o programa no espaço de trabalho do R.
4. Para criar curvas de contágio de bocejo, use os dados salvos anteriormente em uma planilha. Subtrair as taxas de não-contágio das taxas de contágio para cada par de ratos, janela de tempo e situação de teste. Separe as análises dos dados observados e dos dados artificiais (distribuídos aleatoriamente).
   1. Em seguida, calcule intervalos de confiança (CI) para cada janela de tempo e situação de teste usando um procedimento de bootstrap (consulte o guia geral). Separe as análises para ratos familiares e desconhecidos. Em seguida, combine os dados artificiais das quatro situações de teste para cada condição experimental e calcule o CI para cada janela de tempo usando um procedimento de bootstrap.
   2. Em seguida, crie plotagens para cada situação de teste e condição experimental (consulte a Figura 2 e a Figura 3). Finalmente, realize uma análise de regressão múltipla para comparar a intensidade do contágio de bocejo entre situações de teste (veja abaixo).

Representative Results

Os ratos foram selecionados de uma sublinha previamente produzida de ratos Sprague-Dawley que foram selecionados para o bocejo frequente (aproximadamente 22 bocejos por hora³¹). No entanto, os nove pares de desconhecidos e nove pares de ratos machos familiares (entre 2,5 e 3 meses de idade) utilizados por situação de teste bocejou aproximadamente 12 vezes por hora, em média¹⁸. Portanto, as situações de teste para medir o contágio do bocejo inibiu parcialmente o comportamento de bocejo.

O contágio de bocejo foi medido ao longo de uma série de janelas de tempo que variaram de 1 a 10 min. a Figura 2 mostra a diferença média nas taxas de bocejo entre ratos machos desconhecidos em condições de contágio e não-contágio para cada janela de tempo e situação de teste. Estas curvas do contágio do bocejo indicam que somente os ratos de OC (nas gaiolas com um divisor perfurado, opaco) mostraram o contágio do bocejo, que é evidente da janela de tempo 4 e avante, porque o CI das médias não se sobrepõem com o CI dos números aleatòria alocados de bocejos durante o período de 60 min. A banda indicou, como esperado, que uma alocação aleatória do número de bocejos em cada rato no período de observação produziu taxas de bocejo que oscilavam em aproximadamente zero, sem mostrar qualquer padrão aparente.

O modelo de regressão linear múltipla ajustado aos dados indicou que as curvas das quatro situações de teste foram significativamente diferentes (F_{1, 3} = 11,5, p < 0, 1). Especificamente, o contágio de bocejo foi mais forte em ratos OC do que: ratos VC (ratos em gaiolas com um divisor não perfurado e claro; t =-3,8, p < 0, 1), ratos COV (ratos em gaiolas com um divisor perfurado e claro; t =-5,74, p < 0, 1) e ratos nVoc (ratos em gaiolas com um divisor não perfurado e opaco; t =-2,64, p < 0, 1). Em todos os casos, os graus de liberdade foram 695, uma vez que a análise levou em conta não apenas as quatro situações de teste, mas também as 10 janelas de tempo. Como essas condições geraram medidas autocorrelacionadas, foi adicionado um termo de autocorrelação (ARMA, média móvel autoregressiva) ao modelo estatístico. As tendências globais sobre as 10 janelas de tempo também diferiram estatisticamente de uma inclinação 0 (F_{1, 1} = 11,99, p < 0, 1). A Figura 3 mostra a mesma análise que na Figura 2, aplicada a ratos machos familiares. Neste caso, nenhuma das quatro situações de teste estimulou o contágio do bocejo, pois seu IC sobrepôs-se à banda de IC gerada aleatoriamente. Não houve diferença entre as quatro situações de teste (F_{1, 3} = p = 0,14); embora, o aumento total no contágio do bocejo sobre as 10 janelas do tempo diferiu de uma inclinação 0 (F_{1, 1} = 9, p < 0, 1).

O papel do olfato na vida social dos mamíferos pode ser a razão pela qual somente os ratos do OC mostraram o contágio do bocejo e bocejou mais freqüentemente do que os ratos do vc¹⁸. As indicações visuais não podem ter facilitado bocejo, porque os ratos do albino não vêem assim como ratos do não-albino. No entanto, os ratos VC bocejaram duas vezes tanto quanto o grupo de ratos individualmente colocados em uma gaiola de observação ao lado de uma gaiola vazia¹⁸. Este achado suporta definitivamente a natureza social do bocejo e sugere que o contágio do bocejo em ratos é dependente de pistas olfativas. No entanto, este último só suporta o grau de familiaridade entre pares de ratos como estando envolvido no contágio do bocejo, e as pistas auditivas são o provável canal pelo qual o contágio bocejo ocorre¹⁸.

Globalmente, estes são resultados inesperados de acordo com a previsão de que os ratos familiares, em vez de desconhecidos, mostrarão o bocejo contagioso. Embora os resultados apresentados não usem um controle positivo (não temos dados em que o bocejo contagioso é observado em indivíduos estreitamente relacionados), acredita-se que este método é imparcial para o bocejo contagioso em ratos desconhecidos. Diversos elementos apoiam tal reivindicação. Em primeiro lugar, ratos familiares e desconhecidos não diferiram nas frequências médias de bocejo¹⁸; assim, as diferenças no contágio do bocejo detectado aqui não pareceram depender de como freqüentemente bocejaram. Em segundo lugar, o fato de que os mesmos números de bocejos por rato foram alocados aleatoriamente para o período de observação e que isso não produziu contágio bocejo em qualquer grupo torna a constatação de bocejo contagioso em ratos desconhecidos mais robusto. Finalmente, uma análise de correlação cruzada (para detectar a correspondência contemporânea do comportamento) foi aplicada anteriormente¹⁸ para o mesmo conjunto de dados utilizado aqui, e o resultado coincidiu com o que foi encontrado. Portanto, esse método é sensível o suficiente para detectar e medir as alterações no bocejo contagioso.

Alternativamente, pode-se questionar se o que foi encontrado aqui é o bocejo contagioso. Tal preocupação não é exclusiva deste estudo. Há duas perspectivas de que o bocejo contagioso e sua causalidade despertou preocupações. Em primeiro lugar, a empatia não parece ser o único fator subjacente ao bocejo contagioso¹⁸, como espécies não esperadas para mostrar empatia e/ou habilidades de atribuição de estado mental, como ovelhas e ratos ainda podem mostrar bocejo contagioso. Em segundo lugar, há uma preocupação crescente de que o que é chamado de bocejo contagioso pode não ser como tal. Por muitas décadas (Thorpe, 1956; citado anteriormente¹⁰), os padrões de comportamento contagioso, estereotipado e bocejo contagioso, em particular, têm sido considerados como uma expressão de facilitação social. Mais recentemente, Kapitány e Nielsen²⁵ sugerido através do uso de dados simulados que o que é um erro de reconhecimento de padrão perceptivo pode ser incorretamente chamado de bocejo contagioso. Conseqüentemente, o problema não pode estar na maneira que o bocejo contagioso está sendo medido mas rather em como é definido.

Em resumo, o método proposto aqui é útil para detectar o contágio do bocejo. Além disso, é útil descartar algumas dicas sensoriais, reduzindo assim o número de sinais sensoriais para apenas um ou dois. Outras experiências para testar previsões específicas são necessárias para distinguir os efeitos de um sentido dos outros.

Figura 1 : Esquema do set-up de observação para medir o bocejo contagioso. Quatro gaiolas individuais foram arranjadas em pares em cada lado da tabela T-shaped invertida. Em cada par, as gaiolas estavam enfrentando-se com os divisores acrílicos no meio. A situação específica do teste determina se o divisor entre as gaiolas tem furos e se é desobstruído ou opaco. As câmaras de vídeo foram estrategicamente colocadas para gravar qualquer instância de comportamento de bocejo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Curvas do contágio do yawn para nove pares de ratos masculinos desconhecidos expostos a (a) indicações olfactory, (B) indicações visuais, (C) indicações olfactory e visuais, e (D) nem sinais visuais nem olfactory. Cada círculo representa a diferença média na taxa de bocejo com intervalos de confiança de 95% (CI) de um rato que bocejou no mesmo minuto ou no minuto (janela de tempo) que precede o bocejo do outro rato e quando não bocejou. Os valores da taxa do bocejo acima da linha tracejada indicam o contágio do bocejo, visto que os valores abaixo da linha tracejada indicam o contágio do não-bocejo. A linha sólida que se juntar aos pontos em cada janela de tempo é usada para indicar a diferença média nas taxas de bocejo em cada janela de tempo quando o número de bocejos de cada rato foi alocado aleatoriamente para o período de observação de 60 min. A faixa cinza escura indica um IC de 95% obtido combinando o conjunto de dados aleatório das quatro situações de teste em cada janela de tempo (uma tonalidade contínua é usada para facilitar a interpretação da figura). Um par de ratos expostos a pistas olfativas foi retirado da análise porque nenhum dos ratos bocejou. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Curvas do contágio do yawn para nove pares de ratos masculinos familiares expor a (a) indicações olfactory, (B) indicações visuais, (C) indicações olfactory e visuais, e (D) nem sinais visuais nem olfactory. Cada círculo representa a diferença média na taxa de bocejo com intervalos de confiança de 95% (CI) de um rato que bocejou no mesmo minuto ou no minuto (janela de tempo) que precede o bocejo do outro rato e quando não bocejou. Os valores da taxa do bocejo acima da linha tracejada indicam o contágio do bocejo, visto que os valores abaixo da linha tracejada indicam o contágio do não-bocejo. A linha sólida indica a diferença média nas taxas de bocejo em cada janela de tempo quando o número de bocejos de cada rato foi alocado aleatoriamente para o período de observação de 60 min. A faixa cinza escura indica um IC de 95% obtido combinando o conjunto de dados aleatório das quatro situações de teste em cada janela de tempo. Um par de ratos expostos a pistas visuais foi retirado da análise porque um dos ratos não bocejou. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Há etapas críticas no método que devem ser levados em conta para obter resultados bem-sucedidos. Ratos familiares devem compartilhar gaiolas domésticas por pelo menos 1,5 meses após o desmame e antes de executar os experimentos. Entretanto, os ratos desconhecidos devem viver em gaiolas Home separadas. Em ambos os casos, os pares de ratos devem vir de diferentes ninhadas, mas ser tão semelhantes na idade possível. Em relação às gaiolas de observação, seus furos devem corresponder àqueles nos divisores, porque esta é a única maneira de garantir o contato olfativo entre os ratos. Os divisores, por outro lado, deve ser clara o suficiente para garantir o contato visual ou opaco o suficiente para garantir nenhum contato visual. A divisória de madeira entre um par de ratos e a outra deve ser suficiente para impedir que os ratos de um lado vejam aqueles no outro lado. Outro aspecto crucial é o design adequado do experimento. Sempre que houver uma suspeita de que um processo pode ser tendencioso, um procedimento aleatório deve ser implementado³⁰.

O método não deve apresentar problemas sérios aos usuários. Fazer os furos no vidro era o problema técnico principal enfrentado, e por causa disso, o acrílico foi usado preferivelmente. No entanto, o vidro pode ser usado para fazer as gaiolas de observação inteiras, desde que o aconselhamento profissional seja obtido. Deve ser assegurado que as bordas dos furos estão arquivadas para evitar lascas de vidro que podem ferir os ratos. No entanto, não é recomendável modificar o método principal (por exemplo, fazer os furos maiores). Adicionalmente, o uso de um grupo combinado de machos e fêmeas pode dificultar a detecção de contágio de bocejo.

Os divisores aqui utilizados podem ser insuficientes para evitar que os ratos possam utilizar sinais auditivos, pois os ratos são capazes de produzir e perceber sons em frequências em que os materiais das gaiolas de observação e divisores provavelmente não bloqueavam. Entretanto, esta situação torna possível inferir que as indicações auditivas causaram o contágio¹⁸ do bocejo e que as indicações olfactory facilitaram somente o reconhecimento do grau de familiaridade do sócio. Portanto, o método proposto aqui ainda fornece evidências razoáveis para identificar os sentidos envolvidos no bocejo contagioso e suas intensidades.

Métodos anteriores foram projetados para estudar o bocejo contagioso em condições laboratoriais, principalmente através da apresentação de vídeos para os indivíduos experimentais^12,13, mas estas foram abordagens questionáveis em termos de validade biológica. O método aqui apresentado resolve essa preocupação usando animais socialmente interagindo em condições mais similares ao que ocorre no mundo real. Além disso, é possível explorar simultaneamente a participação de diversas modalidades sensoriais em um único set-up experimental. Reconhece-se que este método não discrimina absolutamente entre os efeitos de sinais auditivos e outras indicações sensoriais. No entanto, um experimento mais bem desenhado pode permitir que os pesquisadores inferam a modalidade sensorial mais provável envolvida¹⁸. Uma possível solução não invasiva é o uso de ruído branco para mascarar sons e eliminar sinais auditivos. Da mesma forma, os pesquisadores podem expor ratos ingênuos à cama de ratos OC para determinar o papel das pistas olfativas, que é um procedimento comprovado em estudos de facilitação social³².

O uso deste método pode ser estendido para estudar o contágio de bocejo em outras espécies. Por exemplo, esta set-up pode ser usada após modificações simples com animais como camundongos e hamsters para comparar curvas de contágio de bocejo. Comparações entre diferentes espécies podem revelar padrões inesperados. O plano experimental básico pode trabalhar com animais maiores, como cobaias, gatos e coelhos. Da mesma forma, o método pode ser usado para estudar outros comportamentos potencialmente contagiosos, como grooming e arranhões. O programa baseado em R pode reduzir o tempo gasto calculando o contágio de bocejo por várias janelas de tempo e pode ser usado para medir o contágio de bocejo em outras espécies de vertebrados, desde que o usuário tenha coletado previamente dados relevantes.

Em síntese, as principais vantagens deste método são a obtenção de curvas de contágio de bocejo e auxiliando na discriminação entre os papéis relativos das modalidades sensoriais envolvidas. A aquisição de curvas de contágio de bocejo é, tanto quanto sabemos, uma nova abordagem que pode ser útil para medir a força de um contágio e observar como essa intensidade varia entre as espécies. Assim, o método também pode ser usado com algumas modificações em outras espécies animais, como ovinos¹⁶, lobos¹⁵, cães³³, serpentes³⁴e peixes⁵. Em todas estas espécies excepto serpentes, bocejo foi documentado previamente. Na verdade, um método semelhante ao apresentado aqui tem sido usado com sucesso em periquitos²⁷. Esse método também pode ser usado para estudar outros tipos de comportamento que são contagiosos. Por exemplo, comportamentos como reatividade emocional, grooming e arranhões em roedores podem ser contagiosos. De fato, o método proposto aqui apresentou reatividade emocional contagiosa em ratos familiares¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.