Здесь мы представляем метод для проверки инъекции Вену хвост у крыс, используя ближней ИК-области спектра флуоресценции визуализации данных из красителей включены агенты или биологических пробах. Хвост образы до и после инъекции, количественно флуоресцентного сигнала, и проведена оценка качества инъекции.
Внутривенном (IV) агентов в Вену хвост крысы может быть трудным и непоследовательными. Оптимизация инъекции Вену хвост является ключевой частью многих экспериментальных процедур, где реагенты должны вводиться непосредственно в кровоток. Невольно инъекции может быть подкожной, возможно, изменяя научных результатов. Используя nanoemulsion на основе биологических зонд с встроенный инфракрасный Люминесцентную краску (NIRF), этот метод предоставляет возможность обработки изображений в естественных условиях инъекции успешным хвост-Вену. С использованием NIRF тепловизор изображения взяты до и после инъекции агента. Инъекция IV приемлемым затем качественно или количественно определяется на основе интенсивности сигнала NIRF в месте инъекции.
Маршрут администрации агентов в мелких животных служит критической точкой многих экспериментов. Он определяет, где агент должен быть доставлен и, впоследствии, что произойдет после этого агенту. Хотя другие маршруты могут использоваться для агента администрирования1, внутривенного маршрут доставки является предпочтительным маршрутом для некоторых агентов. IV инъекции позволяет агентам вводиться непосредственно в кровоток, минуя эффекты первого прохода ткани и потребность посторонние вещества absorption1. Это также позволяет для ориентации клетки в кровь2,3 и прямые поставки во все ткани внутри кровеносной системы. Грызунов можно считать несколько вен, включая яремной, подкожной и хвост Вены.
В этом методе, NIRF краски, содержащие биологические зонд — в данном случае,5,3,4,nanoemulsion (рис. 1A)6— вводят в Вену боковой хвост крысы. Это особое NIRF-содержащих nanoemulsion ранее использовались изображения и отслеживать neuroinflammation in vivo и ex vivo7,8 в модель крыса9 невропатической боли2,3,4, 5,10,11. Визуализация проводится до и после инъекции с доклиническими тепловизор флуоресценции NIR (см. Таблицу материалы). Это служит инструментом для проверки качества агента администрирования. Визуализации до хвост вен инъекций служит основой для получения базового образа.
Все чаще в исследованиях на животных, внутривенно управляемых nanoemulsions используются как биологических пробах и нацеливания агентов12,13,14,15. Это доказано вызов для администрирования агента через хвост вен16,17— будь то наркотики, вирусный вектор или другой зонд — и обеспечить что все содержимое инъекций успешно вступила в кровь и не окружающих тканей17. Таким образом метод визуализации и оценки качества успешного внедрения выгодно.
Как правило тепла лампы или теплой водой используется тепло хвост, который вызывает расширение вен, позволяя ее визуализации до инъекции. Хотя это обеспечивает облегчает ввод в Вену, существует не количественный способ различать вошел ли соединение кровоток в его объеме18,19,,2021. Это становится еще труднее штаммов животных, где Вены контрастирует слегка с кожей, такие как черный мышей. Как правило следователь может измерить неудачных инъекций, испытывают сопротивление во время инъекции и, в некоторых случаях, Визуализация выпуклость на хвост, указывающее подкожной утечки агента22,23.
В этом исследовании, NIRF томография nanoemulsion вводят в Вену боковой хвост живой крысы осуществляется на небольших животных NIRF изображений системы (см. Таблицу материалы). Крыс кормили очищается специальной диете (см. Таблицу материалы) для уменьшения неспецифических кишки флуоресценции. Приобретение одновременное изображение белого света и 800 Нм флуоресценции фиксируются с помощью NIRF тепловизор и соответствующее программное обеспечение. Относительный флуоресценции интенсивность измеряется на хвосте на Предварительный впрыск и впрыск государств. Интенсивность флуоресценции для региона интерес (ROI) в месте инъекции записывается и разделенная на площадь ROI. Качественные оценки могут быть сделаны на которых инъекции являются приемлемыми. При необходимости дальнейшего количественного анализа может осуществляться настройка порогов для приемлемой инъекции и назначение ROI измерения на группы, в какой момент может быть рассчитана статистической значимости.
Используя эту стратегию проверки после инъекции Вену хвост, стандарт исследование улучшает за повышение согласованности агента администрирования. Этот метод оценки качества инъекции Вену хвост можно легко настроить для различных инъекционные агентов включить инфра красных флуоресцентных зондов коммерчески представленная несколькими компаниями.
Научно-исследовательские лаборатории несут значительные расходы в результате нарушения агентов тестирования. Хвост вен инъекции являются сложной технике освоить для достижения последовательного успеха, с наиболее опытных технологов, часто неся ошибки нарушения. Существует нет надежного способа подтверждения успешного инъекции. Этот протокол предлагает решение этой проблемы, давая исследователям качественный и количественный метод для проверки успеха инъекции Вену мышиных хвост. Здесь,8,7,nanoemulsion, NIRF, меченного25 включает агент по выбору (в данном случае, наркотиков) и образы на месте инъекции в тепловизор малых животных NIRF. Существует также возможность разработки на основе nanoemulsion агент и использовать тот же принцип NIRF изображений путем включения коммерчески доступных инфра красной краски. Кроме того готовые к использованию изображений агентов с большим количеством приложений, таких как опухоль изображений, метаболические изображений, мобильный людьми, и apoptosis также коммерчески доступны. Инъекция производится с помощью стерильной иглой или, альтернативно, катетер IV; Это зависит от предпочтений исследователя. Кроме того автоматизированных хвост вен инжекторы26 были использованы для оказания помощи в этом процессе и совместимы с этой методологии. Однако эта технология еще не стать коммерчески доступными.
Есть важные шаги в методе инъекции Вену хвост, которые обеспечивают более высокий показатель правильного агента администрирования. Во-первых хвост должны быть очищены с этанол, чтобы удалить грязь и мусор, что позволяет исследователям получить более наглядное представление связи. Расширяя Вены, погрузив хвост в теплой воде является также очень важным шагом в методе, поскольку она позволяет больше площадь поверхности для инъекций. Инъекций в более дистальной точке на хвост ключе позволяет для некоторых ошибок, в том случае, если множественные попытки необходимы. Инъекции, должно выполняться в более проксимальном позиции в хвост как хвост вен увеличивается в размерах, как подошел хвостовой аспект тела животного. Кроме того контралатеральной хвост вен может использоваться, если иглы не более трех-пяти узлов на ипсилатеральной хвост вен.
Успешного управления агента тестирования приводит к практически нет сигнала NIRF точке впрыска. Если сопротивления не ощущается во время администрации инъекции и мало что не флуоресцирования на хвост, затем инъекции могут быть записаны как успешный. Если почувствуете сопротивление во время инъекции и там тропа NIRF сигнал вдоль некоторых длина хвоста, то инъекций регистрируется как неудачной и вероятно частично подкожной. Флуоресценции изображения взяты предварительная и впрыск, а качество инъекции оценивается путем наблюдения за качественно или количественно анализируя сигнал флуоресценции в месте инъекции. Программное обеспечение, сопровождающих тепловизор флуоресценции NIR часто способен выполнять этот анализ.
Этот метод может быть адаптирована несколькими способами. Это применимо к хвост инъекции Вену мышей и крыс. Большинство малых животных NIR флуоресценции тепловизоры будет способный разместить мышиных грызунов. Уровень анестезии должны быть скорректированы в зависимости от веса животного, в соответствии с протоколом IACUC научно-исследовательской лаборатории. Еще одна возможная модификация является подготовка на основе nanoemulsion зонд либо путем включения инфракрасного красителя в исследователь сформулировал агента покупки готовых к использованию изображений агент, с учетом конкретных биологических приложений.
Если крыса является относительно большим, он часто может быть трудно расположить его в малых животное томографа. Таким образом, рекомендуется, что тестовый образ взят с животным в ящик перед инъекцией, и поле зрения установлено, где виден хвост. Это полезно для ленты, хвост, чтобы ящик томографа, чтобы убедиться, что он не двигаться во время визуализации.
Альтернативные методы, пытаясь оценить качество хвост вен, что инъекции в мелких животных ограничены для использования маркировки реагенты, которые не мешают параллельных экспериментальных процедур и требуют эвтаназии животных postinjection 12,13. Некоторые реагенты могут повлиять исходы исследования и терапевтических оценки животных участвующих, поэтому рекомендуется уход в экспериментальный дизайн.
Этот метод может в будущем, уточняться с достижениями в технологии визуализации малых животных, а также улучшения в инфракрасной флуоресцентных зондов. Биологические датчики с включены инфракрасный краситель, предназначенные для ряда различных приложений, может использоваться на этапе агента администрирования дизайна исследования для проверки качества инъекции, как описано в этом метод2,3 ,27,28,,2930,,3132.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P. и J.M.J. совместно разработали экспериментальный подход для оценки Nanoemulsions в мышиной модели хронической травмы сужения для воздействия на нейропатической боли. J.M.J. задуман и разработан подход доставки наркотиков в целом Макрофаг целевой с nanoemulsions, nanoemulsion композиции и процессов для изготовления. J.M.J. производства nanoemulsion, который был далее сфабрикованы л.л. под руководством J.M.J. Стабильность nanoemulsion был оценен J.M.J., л.л. и с.п. животных уход, хирургии, поведение, инъекции Вену хвост, и NIRF томографии были проведены совместно м.с. и A.M.S. под руководством J.A.P. Манускрипт был написан и подготовленный м.с., и протокол был написан A.M.S.
В небольших изображений системы животных в Университете Duquesne (поддерживается грантом Питтсбург ткани инженерных инициативе семян) была выполнена НИР оптических изображений. J.M.J. выражает поддержку от DOD премии номер FA8650-17-2-6836, Нида премии номер 1R21DA039621-01, NIBIB премии номер R21EB023104-02 и награда AFMSA номер FA8650-17-2-6836. J.A.P. и J.M.J отметить поддержку от Грант Seed Питтсбург ткани инженерных инициативе. J.A.P. также признает Hunkele ужасной болезни премии, Самуэль и Эмма зимы фонда, Чарльз Генри Лич II фонд и Содружества универсальный исследований повышения премии. J.A.P. и J.M.J. отметить поддержку Благочинный первого Университета Duquesne междисциплинарных исследовательских консорциумов Грант, который поддерживает хронической боли исследовательский консорциум.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |