Här presenterar vi en metod för att validera svans ven injektioner hos råttor genom att utnyttja infrarött fluorescens imaging data från färgämnen införlivas med agenter eller biologiska sonder. Svansen är avbildade före och efter injektionen, fluorescerande signalen kvantifieras, och görs en bedömning av injektion kvalitet.
Intravenös (IV) administrering av agenter i svansen ven av råttor kan vara både svårt och inkonsekvent. Optimera svans ven injektioner är en viktig del av många experimentella rutiner där reagenser måste införas direkt i blodomloppet. Injektionen kan omedvetet, subkutan, möjligen förändra de vetenskapliga resultat. Denna metod använder en nanoemulsion-baserade biologiska sond med en införlivad infrarött fluorescerande (NIRF) färgämne, och erbjuder förmåga imaging en framgångsrik svans ven injektion i vivo. Med användning av en NIRF imager, är bilder tagna före och efter injektion av agenten. En godtagbar IV injektion sedan bestäms kvalitativt eller kvantitativt sett baserat på intensiteten i NIRF signalen på injektionsstället.
Administreringsvägen av agenter till små djur fungerar som en kritisk punkt för många experiment. Det bestämmer där agenten är att levereras och, därefter, vad kommer att hända med agenten därefter. Även om andra vägar kan användas för agent administration1, är intravenös administreringsväg leverans en Rekommenderad rutt för vissa agenter. IV injektion tillåter agenter att injiceras direkt in i blodomloppet, förbi första-passage vävnad effekter och behovet av ovidkommande koncentrationsgradient absorption1. Detta möjliggör också inriktning celler i blodomloppet2,3 och direktleverans till alla vävnader inom cirkulationssystemet. Hos gnagare, kan flera vener övervägas, inklusive jugular, den ytlig och svans venen.
Den här metoden färga en NIRF som innehåller en biologiskt sond — i detta fall, en nanoemulsion (figur 1A)3,4,5,6— injiceras i laterala svans ven hos råttor. Denna särskilda NIRF-innehållande nanoemulsion har använts tidigare bild och spåra neuroinflammation in vivo och ex vivo7,8 i en råtta modell9 av neuropatisk smärta2,3,4, 5,10,11. Imaging utförs före och efter injektion med en preklinisk NIR fluorescens imager (se Tabell för material). Detta fungerar som ett verktyg för att verifiera kvaliteten på agent administrationen. Imaging före svans ven injektion tjänar som grund för att erhålla en baseline-bild.
I djurstudier är alltmer intravenöst administrerade nanoemulsions utnyttjades som biologiska sonder och inriktning agenter12,13,14,15. Det är en beprövad utmaning att administrera en agent via svans ven16,17— vare sig det är en drog, en viral vektor eller en annan sond — och se till att hela innehållet i injektionen framgångsrikt har angett blodomloppet och inte den omgivande vävnader17. En metod för visualisering och utvärdera kvaliteten på en framgångsrik injektion är därför fördelaktigt.
Vanligtvis används en värmelampa eller varmt vatten att värma svansen, vilket orsakar dilatation av venen, som tillåter dess visualisering före injektion. Medan detta säkerställer lättare inträde i venen, finns det inte ett kvantitativa sätt att urskilja huruvida föreningen har angett blodomloppet i dess helhet18,19,20,21. Detta blir svårare fortfarande i stammar av djur där kontraster venen svagt med huden, såsom i svart möss. Vanligtvis kan utredaren gauge en misslyckad injektion genom att uppleva motstånd under injektionen och, i vissa fall kan visualisera en utbuktning på svansen, vilket indikerar en subkutan läckage av agent22,23.
I denna studie NIRF avbildning av den nanoemulsion injiceras i laterala svans ven av levande råttor utförs på en liten-djur NIRF imaging system (se Tabell för material). Råttor är matade en speciell renat kost (se Tabell för material) för att minska ospecifik gut fluorescens. Samtidiga bild förvärv av vitt ljus och 800 nm fluorescens fångas med hjälp av NIRF imager och tillhörande programvara. Relativa fluorescensintensiteten mäts på svansen på staterna i före injektion och efter injektion. Fluorescensintensiteten för regionen av intresse (ROI) på injektionsstället registreras och dividerat med området av ROI. Kvalitativa bedömningar kan göras som injektioner är acceptabla. Eventuellt kan ytterligare kvantitativ analys utföras genom att bestämma gränsvärden för acceptabelt injektioner och tilldela ROI mätningar i grupper, varvid statistisk signifikans kan beräknas.
Genom att utnyttja denna validering strategi efter svans ven injektioner, förbättrar standarden på en forskningsstudie på grund av ökad konsekvens i agent administration. Denna metod för att bedöma kvaliteten på svansen ven injektion kan enkelt anpassas för olika injicerbara agenter att inkludera infra-röd fluorescerande sonder som tillhandahålls kommersiellt av flera företag.
Forskningslaboratorier ådrar sig betydande kostnader till följd av misskötsel av testning agenter. Svans ven injektioner är en svår teknik att bemästra att uppnå konsekvent framgång, med de mest erfarna av teknologer som ofta drabbas av förvaltningsinformation fel. Det finns inget tillförlitligt sätt att bekräfta en framgångsrik injektion. Detta protokoll erbjuder en lösning på detta problem genom att ge forskare en kvalitativ och kvantitativ metod för att validera framgången av en murin svans ven injektion. Här, en NIRF-märkt nanoemulsion7,8,25 innehåller agent för val (i detta fall en drog) och är avbildad på injektionsstället i en NIRF liten-djur imager. Det finns också möjlighet att utveckla en icke-nanoemulsion-baserade agent och använda samma princip om NIRF avbildning genom att införliva kommersiellt tillgängliga infraröd färgämnen. Dessutom ready-to-use imaging agenter med en mängd olika applikationer, såsom tumör imaging, metabola imaging, cell människohandel, och apoptos är också kommersiellt tillgängliga. En injektion utförs antingen med hjälp av en steril nål eller, alternativt, en IV-kateter; Detta beror på önskemål av forskaren. Dessutom automatiserade svans ven spridare26 har använts för att bistå i denna process och är kompatibla med denna metod. Denna teknik har dock inte ännu blivit kommersiellt tillgängliga.
Det finns viktiga steg i metoden svans ven injektion som säkerställer en högre frekvens av rätt agent administration. Svansen ska först rengöras med etanol att ta bort smuts eller skräp, så att forskare att bättre visualisera venen. Dilating venen genom att dränka svansen i varmt vatten är också ett mycket viktigt steg i metoden, eftersom det tillåter en större yta för injektion. Injicera en mer distala punkt på svansen venen tillåter några fel, i händelse av att flera försök krävs. Injektionen bör utföras på ett mer proximala position i svansen som svans venen ökar i storlek när den caudal aspekten av djurets kropp är närmade sig. Kontralaterala svans ven kan dessutom användas om nålen placering misslyckas i mer än tre till fem platser på ipsilaterala svans venen.
En framgångsrik förvaltning av en test-agent resulterar i lite att ingen NIRF signal vid tidpunkten för injektion. Om inget motstånd känns under administreringen av injektionen och det finns lite att ingen fluorescens på svansen, kan sedan injektionen registreras som lyckad. Om motstånd känns under injektionen och det finns ett spår av NIRF signal längs vissa längden på svansen, sedan injektionen bokförs som misslyckade och sannolikt delvis subkutan. Fluorescens är tagna före och efter injektion, och kvaliteten på injektionen bedöms av observation kvalitativt eller kvantitativt analysera fluorescens signalen på injektionsstället. Programmet som medföljer NIR fluorescens kameran är ofta kan utföra denna analys.
Metoden kan anpassas på flera sätt. Den är tillämplig till svans ven injektion hos både möss och råttor. De flesta små-djur NIR fluorescens imagers kommer att kunna ta emot murina gnagare. Nivåer av anestesi måste justeras beroende på vikten av djur, i enlighet med laboratoriets forskning IACUC protokoll. En annan möjlig ändring är utarbetandet av en icke-nanoemulsion-baserade sond antingen genom att införliva en infraröd färgämne i forskarens formulerade agent eller genom att köpa en ready-to-use avbildning agent, anpassade till ett visst biologiskt program.
Om en råtta är relativt stor, kan det ofta vara svårt att placera det i små-djur kameran. Det rekommenderas således att en testbild är tagen med djuret i lådan innan du injicerar, och ett synfält konstaterat där svansen är synlig. Det är bra att tejp svansen för att lådan av kameran, så att den inte rör sig under imaging.
Alternativa metoder syftar till att bedöma kvaliteten på svansen ven injektioner i små djur begränsas till användningen av märkning reagens som inte störa samtidiga experimentella rutiner och kräver avlivning av djur postinjection 12,13. Vissa reagenser kan påverka studieresultat och terapeutiska bedömningen av djur som är inblandade, så vård i experimentell design rekommenderas.
Denna metod kan i framtiden vara raffinerade med framsteg i små djur bildteknik, liksom förbättringar i infraröd fluorescerande sonder. Biologiska sonder med en inbyggd infraröd färgämne, avsedd för en mängd olika applikationer, kan användas i skede administration agent av en studiedesign för att validera kvaliteten på en injektion, som beskrivs i denna metod2,3 ,27,28,29,30,31,32.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P. och J.M.J. utformade gemensamt den experimentella metoden för att utvärdera Nanoemulsions i kronisk förträngning skada råtta modellen för effekter på neuropatisk smärta. J.M.J. utformade och konstruerade den övergripande makrofag-targeted drug postförskott synsätt med nanoemulsions, nanoemulsion sammansättning och processer för tillverkning. J.M.J. produceras av nanoemulsion, som var ytterligare tillverkade av L.L. under ledning av J.M.J. Stabiliteten i nanoemulsion bedömdes genom J.M.J., L.L. och S.P. djur vård, kirurgi, beteende, svans ven injektioner och NIRF imaging genomfördes gemensamt av M.S. och A.M.S. under ledning av J.A.P. Manuskriptet skrevs och utarbetats av M.S. och protokollet skrevs av A.M.S.
NIR optisk imaging utfördes på små djur Imaging System på Duquesne universitetar (stöds av Pittsburgh Tissue Engineering initiativ utsäde bidraget). J.M.J. erkänner stöd från DOD award nummer FA8650-17-2-6836, NIDA award nummer 1R21DA039621-01, NIBIB award nummer R21EB023104-02 och AFMSA Award nummer FA8650-17-2-6836. J.A.P. och J.M.J erkänner stöd från Pittsburgh Tissue Engineering initiativ utsäde bidraget. J.A.P. erkänner också utmärkelsen Hunkele fruktade sjukdom, Samuel och Emma vintrar Foundation, Charles Henry Leach II fonden och the Commonwealth Universal forskning Enhancement Award. J.A.P. och J.M.J. erkänner stöd från Duquesne universitetar konstituerande Profossens tvärvetenskaplig forskning konsortier Grant, som stöder kronisk smärta forskningskonsortiet.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |