Hier präsentieren wir eine Methode zur Validierung Schweif Vene Injektionen bei Ratten durch die Verwendung von Nah-Infrarot-Fluoreszenz Bilddaten von Farbstoffen in Agenten oder biologische Sonden eingearbeitet. Die Rute wird abgebildet, bevor nach der Injektion wird das Fluoreszenzsignal quantifiziert und eine Beurteilung der Qualität Injektion erfolgt.
Intravenöse (IV) Verabreichung von Wirkstoffen in die Rute Vene von Ratten kann schwierig und widersprüchlich sein. Tail Vene Injektionen zu optimieren ist ein wichtiger Teil der vielen experimentellen Verfahren wo Reagenzien müssen direkt in den Blutstrom eingeführt werden. Unbewusst, kann die Injektion subkutan, vielleicht ändern die wissenschaftlichen Ergebnisse. Mit Hilfe einer Nanoemulsion-basierten biologischen Sonde mit einer eingearbeiteten Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff (NIRF), bietet diese Methode die Möglichkeit von imaging-eine erfolgreiche Schweif Vene Injektion in-vivo. Mit dem Einsatz einer NIRF Imager sind Bilder vor und nach der Injektion des mittels getroffen. Eine akzeptable IV-Injektion wird dann qualitativ oder quantitativ ermittelt anhand der Intensität des NIRF Signals an der Injektionsstelle.
Die Art der Verabreichung von Agenten in Kleintiere dient als ein kritischer Punkt von vielen Experimenten. Es legt fest, wo der Agent soll geliefert werden und anschließend an den Agenten danach geschehen wird. Obwohl andere Routen für Agent-Verwaltung-1verwendet werden können, ist die intravenöse Route der Lieferung eine bevorzugte Route für bestimmte Wirkstoffe. IV-Injektion kann Agenten direkt in die Blutbahn, Umgehung First-Pass-Gewebe Auswirkungen und die Notwendigkeit für überflüssige gelösten absorption1 injiziert werden. Dies ermöglicht auch gezielt Zellen in die Blutbahn2,3 und direkte Lieferung an allen Geweben innerhalb des Herz-Kreislauf-Systems. Bei Nagetieren können mehrere Adern betrachtet werden, einschließlich die Halsschlagader, die saphena und die Rute Vene.
Bei dieser Methode wird eine NIRF färben mit einer biologischen Sonde – in diesem Fall eine Nanoemulsion (Abbildung 1A)3,4,5,6— in die seitlichen Schweif Vene von Ratten injiziert. Diese besondere NIRF-haltigen Nanoemulsion wurde zuvor verwendet, um Bild und Neuroinflammation in vivo und ex Vivo7,8 in einer Ratte Modell9 von neuropathischen Schmerzen2,3,4zu verfolgen, 5,10,11. Bildgebung ist vor und nach der Injektion mit einer präklinischen NIR-Fluoreszenz-Imager durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien). Dies dient als Werkzeug, um die Qualität der Agent-Verwaltung zu validieren. Bildgebung vor der Rute Vene Injektion dient als Grundlage für den Erhalt ein Baseline-Abbild.
In tierexperimentellen Studien sind immer intravenös verabreichte Nanoemulsionen als biologische Sonden und targeting-Agenten12,13,14,15genutzt. Es ist eine bewährte Herausforderung, einen Agent über die Rute Vene16,17zu verwalten – sei es ein Medikament, viralen Vektoren oder einer anderen Sonde – und um sicherzustellen, dass der gesamte Inhalt der Injektion die Blutbahn erfolgreich eingegeben haben und nicht die umliegenden Gewebe17. Daher ist eine Methode zur Visualisierung und Bewertung der Qualität einer erfolgreichen Einspritzung vorteilhaft.
In der Regel wird eine Wärmelampe oder warmem Wasser zur Rute, wärmen die Dilatation der Vene, erlaubt die Visualisierung vor der Injektion verursacht. Während dadurch einfacher Einstieg in die Vene ist keine quantitative Art und Weise zu erkennen, ob die Verbindung in seiner Gesamtheit18,19,20,21den Blutkreislauf eingetreten ist. Dies wird noch schwieriger in Stämmen von Tieren, wo die Vene schwach mit der Haut, wie z. B. in schwarze Mäuse kontrastiert. In der Regel kann der Prüfer eine fehlerhafte Injektion durch erleben Widerstand während der Injektion und in einigen Fällen, visualisieren eine Ausbuchtung am Heck, Angabe einer subkutanen Lecks der Agent22,23messen.
In dieser Studie NIRF Bildgebung von der Nanoemulsion injiziert in die seitlichen Schweif Vene live Ratten erfolgt auf einem kleinen Tier NIRF imaging-System (siehe Tabelle der Materialien). Ratten sind eine spezielle gereinigt gefüttert Ernährung (siehe Tabelle der Materialien), um unspezifische Darm Fluoreszenz zu reduzieren. Gleichzeitige Bildaufnahme von weißem Licht und 800 nm Fluoreszenz ist mit der NIRF Imager und die dazugehörige Software erfasst. Die relative Fluoreszenzintensität wird auf das Heck auf die Voreinspritzung und nach der Injektion Staaten gemessen. Die Fluoreszenzintensität für die Region of Interest (ROI) an der Injektionsstelle aufgenommen und geteilt durch die Fläche des ROI. Qualitative Bewertungen erfolgen auf die Injektionen akzeptabel sind. Optional können weitere Quantitative Analyse durchgeführt werden, durch die Festlegung von Grenzwerten für akzeptable Injektionen und Zuweisen von ROI-Messungen in Gruppen, an welcher, die Stelle die statistische Signifikanz berechnet werden kann.
Durch die Nutzung dieser Validierungsstrategie nach Heck Vene spritzen, verbessert sich der Standard einer Forschungsstudie durch erhöhte Konsistenz der Agent-Administration. Diese Methode der Beurteilung der Qualität der Schweif Vene Injektion kann für verschiedene injizierbare Mittel zum Infrarot-fluoreszierende Sonden kommerziell von mehreren Unternehmen angeboten gehören leicht angepasst werden.
Forschungslabors entstehen erhebliche Kosten durch die Misswirtschaft der Test-Agents. Tail Vene Injektionen sind eine schwierige Technik zu meistern, konsequente Erfolgsquote, mit den erfahrensten Technologen häufig anfallenden Misswirtschaft Fehler zu erreichen. Es gibt keine zuverlässige Möglichkeit, eine erfolgreiche Injektion zu bestätigen. Dieses Protokoll bietet eine Lösung für dieses Problem geben Forscher eine qualitative und quantitative Methode, um den Erfolg einer murinen Schweif Vene Einspritzung überprüfen. Hier eine NIRF gekennzeichnet Nanoemulsion7,8,25 enthält das Mittel der Wahl (in diesem Fall ein Medikament) und an der Injektionsstelle bei einer NIRF kleine Tier Imager abgebildet ist. Es gibt auch die Möglichkeit, einen nicht-Nanoemulsion-basierte Agent zu entwickeln und verwenden das gleiche Prinzip der NIRF Bildgebung durch den Einbau von handelsüblichen Infrarot-Farbstoffe. Darüber hinaus Ready-to-Use Image Agenten mit einer Vielzahl von Anwendungen, z. B. Tumor imaging, metabolische Bildgebung, Zelle, Menschenhandel und Apoptose sind auch im Handel erhältlich. Eine Injektion erfolgt entweder mit einer sterilen Nadel oder alternativ eine IV-Katheter; Dies hängt von den Vorlieben des Forschers. Darüber hinaus automatisierte Schweif Vene Injektoren26 wurden verwendet, um in diesem Prozess unterstützen und sind kompatibel mit dieser Methodik. Allerdings hat diese Technologie noch nicht kommerziell verfügbar geworden.
Es sind wichtige Schritte in die Rute Vene Injektion Methode, die eine höhere Rate von richtigen Agent Verwaltung sicherstellen. Zunächst sollte die Rute mit Ethanol, Schmutz und Ablagerungen, so dass Forscher besser visualisieren die Vene entfernen gereinigt werden. Dilatation der Vene durch Eintauchen der Schweif in warmem Wasser ist auch ein sehr wichtiger Schritt in der Methode, da es eine grössere Fläche für die Injektion ermöglicht. An einem mehr distalen Punkt auf der Rute Vene injizieren kann für einige Fehler, für den Fall, dass mehrere Versuche erforderlich sind. Injektion sollte versucht werden, an einer mehr proximalen Position im Heck wie die Schweif Ader an Größe zunimmt, wie der kaudalen Aspekt des Körpers des Tieres angesprochen wird. Darüber hinaus kann die kontralateralen Schweif Ader verwendet werden, wenn Nadelplatzierung in mehr als drei bis fünf Seiten auf der ipsilateralen Schweif Ader schlägt fehl.
Eine erfolgreiche Verwaltung eines Test-Agent führt zu wenig bis keine NIRF Signal zum Zeitpunkt der Injektion. Wenn kein Widerstand zu während der Verabreichung der Injektion spüren ist und es wenig bis keine Fluoreszenz am Heck gibt, kann die Injektion so erfolgreich aufgezeichnet werden. Wenn Widerstand zu beim Einspritzen spüren ist und es ein Trail NIRF Signal über einige Länge der Rute, gibt dann die Injektion ist als erfolglos und ist teilweise subkutane. Fluoreszenzbilder werden vor und nach der Injektion und die Qualität der Injektion wird anhand Beobachtung qualitativ oder quantitativ das Fluoreszenzsignal an der Injektionsstelle zu analysieren. Die Software begleitet den NIR-Fluoreszenz-Imager ist oft in der Lage, diese Analyse durchzuführen.
Die Methode kann auf verschiedene Weise angepasst werden. Es gilt zu Endstück Vene Injektion bei Mäusen und Ratten. Die meisten kleinen Tier NIR Fluoreszenz Imager werden kann murinen Nagetiere beherbergen. Ebenen der Anästhesie je nach Gewicht des Tieres, in Übereinstimmung mit dem Forschungslabor IACUC Protokoll angepasst werden müssen. Eine andere mögliche Änderung ist die Vorbereitung einer nicht-Nanoemulsion-basierten Sonde durch die Einbeziehung eines Infrarot-Farbstoff in der Forscher formulierten Agent oder durch den Kauf einer Ready-to-Use imaging-Agents, auf eine bestimmte biologische Anwendung zugeschnitten.
Wenn eine Ratte relativ groß ist, kann es oft schwierig, ihn in das kleine Tier-Imager positionieren sein. Es empfiehlt sich somit wird, ein Testbild vor der Injektion mit dem Tier in der Schublade genommen und eine Sichtfeld festgestellt, wo die Rute sichtbar ist. Es ist hilfreich, Band, die das Heck in die Schublade der Imager, um sicherzustellen, dass während der Aufnahme nicht bewegt.
Alternative Methoden zur Bewertung der Qualität der Schweif Vene, die Injektionen bei Kleintieren beschränken sich auf die Nutzung von Reagenzien, die nicht stören mit gleichzeitigen experimentelle Verfahren und erfordert Euthanasie der Tiere Steroidtherapie Kennzeichnung suchen 12,13. Einige Reagenzien können Ergebnisse der Studie und die therapeutische Beurteilung der Tiere beteiligt sind, auswirken, sodass Sorgfalt bei der Versuchsplanung empfohlen wird.
Diese Methode kann in Zukunft mit den Fortschritten in klein-Tier-imaging-Technologie, sowie Verbesserungen in der Infrarot-fluoreszierende Sonden verfeinert. Biologische Proben mit eine eingebaute Infrarot-Farbstoff, entwickelt für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen, in der Agent-Verwaltung-Bühne ein Studiendesign lässt sich um die Qualität einer Injektion zu validieren gemäß dieser Methode2,3 ,27,28,29,30,31,32.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P J.M.J. gestaltet gemeinsam die experimentellen Ansatz für die Bewertung von hochdosierter in die chronische Schädigung der Verengung Rattenmodell für Auswirkungen auf neuropathische Schmerzen. J.M.J. konzipiert und gestaltet den insgesamt Makrophagen-bezogene Droge Lieferung Ansatz mit hochdosierter, Nanoemulsion Zusammensetzung und Verfahren zur Herstellung. J.M.J. produziert die Nanoemulsion, die weiter von l.l. unter der Leitung des J.M.J. hergestellt wurde Die Stabilität der Nanoemulsion wurde durch J.M.J., l.l. und S.P. Tier Pflege, Chirurgie, Verhalten, Tail Vene spritzen beurteilt und NIRF Bildgebung wurden gemeinsam durchgeführt von M.S und A.M.S. unter der Leitung von J.A.P Das Manuskript wurde geschrieben und von M.S vorbereitet, und das Protokoll wurde geschrieben von A.M.S.
NIR optische Bildgebung wurde auf dem kleinen Tier-Imaging-System an der Duquesne University (unterstützt durch die Pittsburgh Tissue Engineering Initiative Seed Grant) durchgeführt. J.M.J. räumt Unterstützung vom DOD Prämiennummer FA8650-17-2-6836, NIDA Award Nr. 1R21DA039621-01, NIBIB-Prämien-Nummer R21EB023104-02 und AFMSA Award Nr. FA8650-17-2-6836. J.A.P und J.M.J anerkennen, Unterstützung von Pittsburgh Tissue Engineering Initiative Seed Grant. J.A.P erkennt auch Hunkele gefürchtete Krankheit Award, den Samuel und Emma Winter Stiftung, Charles Henry Leach II Fonds und universelle Enhancement-Forschungspreis Commonwealth. J.A.P und J.M.J. anerkennen, Unterstützung durch die Duquesne University Inaugural Provost interdisziplinäre Konsortien Forschungsstipendium, die chronischen Schmerz-Forschungs-Konsortium unterstützt.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |