在这里, 我们提出了一种方法来验证尾巴静脉注射在大鼠利用近红外荧光成像数据从染料纳入剂或生物探针。对注射前后的尾巴进行成像, 对荧光信号进行量化, 并对注射质量进行评估。
静脉 (IV) 给药到大鼠的尾静脉可能是困难的和不一致的。优化尾静脉注射是许多实验过程的关键部分, 在这些实验过程中, 试剂需要直接引入血液。在不知不觉中, 注射可以是皮下注射, 可能会改变科学结果。该方法利用一种基于纳米乳液的生物探针和集成的近红外荧光 (NIRF) 染料, 提供了在体内成功的尾部静脉注射成像能力.通过使用 NIRF 成像仪, 在注入制剂之前和之后拍摄图像。然后根据注入部位 NIRF 信号的强度, 定性或定量地确定可接受的 IV 注入。
将药物管理到小动物中的途径是许多实验的关键点。它确定代理的交付位置, 以及随后代理随后将发生的情况。虽然其他路线可用于代理管理 1, 但静脉注射路线是某些制剂的首选路线。IV 注射允许直接注射到血液中的药物, 绕过一通组织的影响和需要外来溶质吸收1。这也允许针对血液2、3 中的细胞, 并直接传递到循环系统内的所有组织。在啮齿类动物中, 可以考虑几个静脉, 包括颈静脉、隐静脉和尾静脉。
在这种方法中, 一种含有生物探针的 nirf 染料–在这种情况下, 是一种纳米乳液 (图 1a)3、4、5、6–被注射到大鼠的侧尾静脉中。这种特殊的含有 nirf 的纳米乳剂以前曾被用来成像和跟踪体内和体内的神经炎症 7, 8 在一个大鼠模型 9的神经病理性疼痛2,3,4, 5,10,11。在注射前后使用临床前近红外荧光成像仪进行成像 (见材料表)。这可用作验证代理管理质量的工具。在尾巴静脉注射之前进行成像可作为获得基线图像的基础。
在动物研究中, 静脉注射的纳米乳液越来越多地被用作生物探针和靶向剂 12、13、14、15。通过 16,17 的尾静脉给药是一个行之有效的挑战–无论是药物、病毒载体还是其他探针–并确保注射的全部内容已成功进入血液, 而不是周围的组织17。因此, 一种可视化和评估成功注射质量的方法是有益的。
通常情况下, 热灯或温水用于加热尾巴, 这会导致静脉扩张, 允许其在注射前的可视化。虽然这确保了更容易进入静脉, 但没有一个定量的方法来判断化合物是否已全部进入血液18,19, 20,21。这在动物株中变得更加困难, 因为在这些动物中, 静脉与皮肤的对比程度与皮肤有微弱的对比, 例如在黑鼠身上。通常情况下, 调查人员可以通过在注射过程中遇到阻力来测量注射失败, 在某些情况下, 还可以看到尾巴上的隆起, 表明药物 22,23的皮下泄漏。
在本研究中, 在小动物 NIRF 成像系统上对注入活鼠侧向尾静脉的纳米乳状液进行 NIRF 成像 (见材料表)。喂大鼠一种特殊的纯化饮食 (见材料表), 以减少非特异性肠道荧光。利用 NIRF 成像仪和相关软件捕获白光和800纳米荧光的同步图像采集。在注射前和注射后的状态下, 在尾巴上测量相对荧光强度。注射部位感兴趣区域 (ROI) 的荧光强度记录并除以 ROI 的区域。可以对哪些注射是可以接受的进行定性评估。(可选) 通过设置可接受注射的阈值并将 ROI 测量值分配到组来进行进一步的定量分析, 在这一点上可以计算统计意义。
通过利用这种在尾静脉注射后的验证策略, 由于增加了代理管理的一致性, 研究的标准得到了提高。这种评估尾静脉注射质量的方法可以很容易地针对不同的注射剂进行定制, 以包括由几家公司商业提供的红外荧光探针。
由于对检测剂的管理不当, 研究实验室产生了巨大的成本。尾静脉注射是一个很难掌握的技术, 以达到一致的成功率, 与最有经验的技术人员往往会产生误管错误。没有可靠的方法来确认注射成功。该方案通过为研究人员提供了一种定性和定量的方法来验证小鼠尾静脉注射的成功与否, 从而解决了这一问题。在这里, 一个 nirf 标记的纳米乳液 7,8,25纳入了选择的剂 (在这种情况下, 一种药物), 并在注射的地点, 在 nirf 小动物成像仪成像。还可以选择开发一种非纳米乳液基制剂, 并通过采用市售的红外染料, 使用相同的 NIRF 成像原理。此外, 具有多种应用的即用成像剂, 如肿瘤成像、代谢成像、细胞贩运和凋亡, 也可在商业上获得。注射是通过使用无菌针或, 或者, 静脉导管进行;这取决于研究人员的偏好。此外, 自动尾脉注射器26已用于协助这一过程, 并与这一方法兼容。然而, 这项技术尚未在商业上获得。
尾静脉注射方法有重要步骤, 确保了更高的正确剂给药率。首先, 尾巴应该用乙醇清洗, 以清除任何污垢或碎片, 使研究人员能够更好地想象静脉。通过将尾巴浸入温水中扩张静脉也是该方法中非常重要的一步, 因为它允许注射的表面积更大。在需要多次尝试的情况下, 在尾部静脉上更远的点上注射会导致一些错误。注射应尝试在一个更近端的位置, 在尾巴的一个更近的位置, 因为尾巴静脉的大小增加, 因为动物的身体的尾端方面接近。此外, 如果在同侧尾静脉的三到五个部位针头置入失败, 则可使用对侧尾静脉。
测试剂的成功管理在注射点几乎没有 NIRF 信号。如果在注射过程中没有感觉到阻力, 并且尾部几乎没有荧光, 那么注射就可以记录为成功。如果在注射过程中感觉到阻力, 并且沿着尾巴的某些长度有 NIRF 信号的轨迹, 那么注射记录为不成功, 并且可能部分是皮下注射。对注射前和注射后的荧光图像进行了评估, 并通过定性观察或定量分析注射部位的荧光信号来评估注射的质量。NIR 荧光成像仪附带的软件通常能够执行此分析。
该方法可通过多种方式进行调整。适用于小鼠和大鼠的尾静脉注射。大多数小动物近红外荧光成像仪将能够容纳小鼠啮齿类动物。根据研究实验室的 IACUC 协议, 需要根据动物的体重调整麻醉水平。另一种可能的修改是制备一种非纳米乳液探针, 方法是将红外染料纳入研究人员的配方剂, 或购买适合特定生物应用的即用成像剂。
如果老鼠比较大, 往往很难将其定位在小动物成像仪中。因此, 建议在注射前与抽屉中的动物一起拍摄测试图像, 并确定尾巴可见的地方的视野。将尾部贴在成像仪的抽屉中是很有帮助的, 以确保它在成像过程中不会移动。
寻求评估小动物尾静脉注射质量的替代方法仅限于使用不干扰同时进行的实验程序并要求对注射后的动物进行安乐死的标记试剂12,13。有些试剂可能会影响研究结果和相关动物的治疗评估, 因此建议在实验设计中注意。
随着小动物成像技术的进步, 以及红外荧光探针的改进, 该方法在未来可以得到改进。生物探针与集成红外染料, 设计用于各种不同的应用, 可用于研究设计的代理管理阶段, 以验证注射的质量, 如本方法2,3 所述 , 27,28,29,30,31,32。
The authors have nothing to disclose.
J. a. p. 和 j. m. j. 联合设计了评价慢性收缩损伤大鼠模型纳米乳剂对神经病理性疼痛影响的实验方法。J. m. j. 利用纳米乳液、纳米乳液组合物和制备工艺, 构思并设计了针对巨噬细胞的整体药物输送方法。J. m. j. 生产了纳米乳液, 由 l. l. l. 在 j. m. j. 的指导下进一步制备。M. s. 和 a. m. s. 在 j. a. p. 的指导下, 由 j. m. m. s. 和 a. m. s. 联合进行了纳米乳液的稳定性评估, 并由 s. m. m. f. 和 s. s. 联合进行了动物护理、手术、行为、尾静脉注射和 NIRF 成像。手稿是由 m. s. 编写的, 协议是由 a. m. s. 编写的。
在杜克斯内大学的小动物成像系统上进行了近红外光学成像 (由匹兹堡组织工程倡议种子赠款提供支持)。J. m. j. 感谢国防部颁发的奖项编号 FA8650-17-2-6836、NIDA 奖编号1R21DA039621-01、NIBIB 奖编号 R21EB023104-02 和 AFMSA 奖编号 FA8650-17-2-8. 36。J. a. p. 和 j. m. j. 感谢匹兹堡组织工程倡议种子赠款的支持。J. a. p. 还承认亨克莱病奖、塞缪尔和艾玛·温特斯基金会、查尔斯·亨利·利奇 Ii 基金和英联邦普遍研究增强奖。J. a. p. 和 j. m. j. 感谢杜克斯内大学成立校长的跨学科研究联盟格兰杰 (并行称) 的支持, 该联盟为慢性疼痛研究联合会提供了支持。
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |