Qui presentiamo un metodo per convalidare le iniezioni della vena della coda in ratti utilizzando vicino infrarosso fluorescenza dati di imaging da coloranti incorporati in agenti o sonde biologiche. La coda è ripreso prima e dopo l’iniezione, il segnale fluorescente è quantificato, e viene fatta una valutazione della qualità di iniezione.
Somministrazione endovenosa (IV) di agenti nella vena della coda dei ratti può essere difficile e incoerente. Ottimizzazione delle iniezioni della vena della coda è una parte fondamentale di molte procedure sperimentali dove i reagenti devono essere introdotti direttamente nel flusso sanguigno. Involontariamente, l’iniezione può essere sottocutaneo, possibilmente alterando i risultati scientifici. Utilizzando una sonda biologica basati su Nanoemulsione con un colorante fluorescente incorporato (NIRF) all’infrarosso, questo metodo offre la capacità di imaging un’iniezione della vena della coda successo in vivo. Con l’uso di un imager NIRF, le immagini sono prese prima e dopo l’iniezione dell’agente. Un’iniezione IV accettabile è quindi qualitativamente o quantitativamente determinata basato sull’intensità del segnale NIRF al sito di iniezione.
La via di somministrazione di agenti in piccoli animali serve come un punto critico di molti esperimenti. Determina dove l’agente sta per essere consegnato e, successivamente, cosa succederà all’agente da allora in poi. Anche se altre vie possono essere utilizzati per agente amministrazione1, via endovenosa di consegna è un itinerario preferito per alcuni agenti. IV iniezione permette agli agenti di essere iniettato direttamente nel flusso sanguigno, bypassando effetti di primo passaggio del tessuto e la necessità di absorption1 soluto estranei. Ciò consente anche di targeting cellule nella circolazione sanguigna2,3 e consegna diretta a tutti i tessuti all’interno del sistema circolatorio. Nei roditori, parecchie vene possono essere considerate, tra cui la giugulare, la safena e vena caudale.
In questo metodo, un NIRF tingere contenente una sonda biologica — in questo caso, una Nanoemulsione (Figura 1A)3,4,5,6— viene iniettato nella vena caudale laterale dei ratti. Questo particolare Nanoemulsione contenenti NIRF è stato utilizzato in precedenza per immagine e tenere traccia di neuroinflammation in vivo ed ex vivo7,8 in un modello di ratto9 di dolore neuropatico2,3,4, 5,10,11. La formazione immagine è condotta prima e dopo l’iniezione con un imager di fluorescenza NIR preclinico (Vedi Tabella materiali). Questo serve come uno strumento per convalidare la qualità dell’amministrazione agente. Di imaging prima la coda vena iniezione serve come base per l’ottenimento di un’immagine di base.
Sempre più negli studi sugli animali, somministrato per via endovenosa nanoemulsioni sono utilizzati come sonde biologiche e targeting agenti12,13,14,15. È una sfida provata per amministrare un agente tramite la coda vena16,17— sia esso un farmaco, un vettore virale o un’altra sonda — e per garantire che l’intero contenuto dell’iniezione con successo hanno entrato nella circolazione sanguigna e non il tessuti circostanti17. Pertanto, un metodo di visualizzazione e la valutazione della qualità di un’iniezione di successo è benefico.
In genere, una lampada di calore o di acqua calda viene utilizzato per riscaldare la coda, che provoca la dilatazione della vena, permettendo la visualizzazione prima dell’iniezione. Mentre in questo modo facilita l’ingresso nella vena, non esiste un modo quantitativo di discernere se il composto ha entrato nella circolazione sanguigna nella sua interezza18,19,20,21. Questo diventa più difficile ancora in ceppi di animali dove la vena è contrasta debolmente con la pelle, come ad esempio nei topi di neri. In genere, lo sperimentatore può misurare un’iniezione fallito rivivendo la resistenza durante l’iniezione e, in alcuni casi, visualizzando un rigonfiamento sulla coda, che indica una perdita sottocutanea dell’agente22,23.
In questo studio, la formazione immagine NIRF di Nanoemulsione iniettato nella vena caudale laterale di ratti dal vivo è effettuata su un piccoli animali NIRF sistema di imaging (Vedi Tabella materiali). I ratti sono alimentati uno speciale purificato dieta (Vedi Tabella materiali) per ridurre la fluorescenza del budello non specifici. Acquisizione immagine simultanea di luce bianca e 800 nm fluorescenza viene catturato utilizzando il NIRF imager e software associati. L’intensità di fluorescenza relativa è misurata sulla coda presso gli stati pre-iniezione e post-iniezione. L’intensità di fluorescenza per la regione di interesse (ROI) al sito di iniezione è registrata e diviso per l’area del ROI. Valutazioni qualitative possono essere fatta su cui iniezioni sono accettabili. Facoltativamente, ulteriori analisi quantitativa può essere eseguita impostando soglie per iniezioni accettabile e assegnandolo misurazioni di ROI in gruppi, al punto che può essere calcolata la significatività statistica.
Utilizzando questa strategia di convalida dopo le iniezioni di vena di coda, lo standard di uno studio di ricerca migliora a causa di una maggiore coerenza dell’amministrazione agente. Questo metodo di valutazione della qualità dell’iniezione della vena della coda può essere facilmente personalizzato per diversi agenti iniettabili per includere infra-rosso fluorescente sonde fornite commercialmente da diverse società.
Laboratori di ricerca sostengono costi significativi a causa del malgoverno di agenti di test. Iniezioni di vena della coda sono una tecnica difficile da padroneggiare per raggiungere il tasso di successo costante, con il più esperto dei tecnologi spesso incorrere in errori di malgoverno. Non esiste alcun modo affidabile per confermare un’iniezione di successo. Questo protocollo offre una soluzione a questo problema dando ai ricercatori un metodo qualitativo e quantitativo per convalidare il successo di un’iniezione della vena della coda murino. Qui, un NIRF-etichettati Nanoemulsione7,8,25 incorpora l’agente di scelta (in questo caso, un farmaco) ed è ripreso nel sito di iniezione in un imager di piccoli animali NIRF. C’è anche la possibilità di sviluppare un agente non basati su Nanoemulsione e utilizzare lo stesso principio dell’imaging NIRF incorporando commercialmente disponibili infra-rosso coloranti. Inoltre, ready-to-use agenti imaging con una varietà di applicazioni, ad esempio tumore imaging, metabolica di imaging, cella traffico e apoptosi sono anche disponibili in commercio. L’iniezione viene eseguita utilizzando un ago sterile o, in alternativa, un catetere IV; Questo dipende dalla preferenza del ricercatore. Inoltre, coda automatizzato vena iniettori26 sono stati usati per aiutare in questo processo e sono compatibili con questa metodologia. Tuttavia, questa tecnologia non è ancora diventata commercialmente disponibile.
Ci sono passi importanti nel metodo di iniezione della vena della coda che assicurano un più alto tasso di amministrazione agente corretto. In primo luogo, la coda deve essere pulita con etanolo per rimuovere qualsiasi sporco o detriti, consentendo ai ricercatori di visualizzare meglio la vena. Dilatare la vena immergendo la coda in acqua calda è anche un passo molto importante nel metodo, poiché consente una maggiore superficie per l’iniezione. L’iniezione in un punto più distale della vena della coda permette per qualche errore, nel caso in cui i tentativi multipli sono necessari. Iniezione deve essere eseguita in una posizione più prossimale nella coda la vena caudale aumenta di dimensioni, come la funzione caudale del corpo dell’animale è avvicinato. Inoltre, la vena caudale controlaterale può essere utilizzata in caso di posizionamento dell’ago in più di tre a cinque siti su vena caudale ipsilateral.
Una corretta amministrazione di un agente di test risultati in poco o nessun segnale NIRF nel punto di iniezione. Se nessuna resistenza è ritenuta durante la somministrazione dell’iniezione e c’è poco da alcuna fluorescenza alla coda, l’iniezione può essere registrata come successo. Se si avverte resistenza durante l’iniezione e c’è un sentiero di NIRF segnale lungo alcuni lunghezza della coda, poi l’iniezione viene registrata come esito negativo ed è probabile che in parte sottocutaneo. Immagini di fluorescenza sono prese pre- e post-iniezione, e la qualità dell’iniezione è valutata osservando qualitativamente o quantitativamente analizzando il segnale di fluorescenza nel sito di iniezione. Il software che accompagna il dispositivo di imaging di fluorescenza NIR è spesso in grado di eseguire questa analisi.
Il metodo può essere adattato in diversi modi. È applicabile alla coda della vena di iniezione in entrambi i topi e ratti. La maggior parte delle stampanti di fluorescenza NIR piccoli animali sarà in grado di ospitare roditori murini. Livelli di anestesia necessario essere regolato a seconda del peso dell’animale, conformemente al protocollo IACUC di laboratorio di ricerca. Un’altra modifica possibile è la preparazione di una sonda non basati su Nanoemulsione incorporando un colorante a infrarossi in agente formulato del ricercatore o con l’acquisto di un agente di imaging di ready-to-use, su misura per una specifica applicazione biologica.
Se un ratto è relativamente grande, può spesso essere difficile posizionarlo nel dispositivo di imaging di piccoli animali. È pertanto consigliabile che un’immagine di prova è preso con l’animale nel cassetto prima di iniettare, e un campo di vista accertato dove la coda è visibile. È utile su nastro la coda al cassetto del dispositivo di imaging, per assicurarsi che non si muove durante la formazione immagine.
Metodi alternativi che cercano di valutare la qualità della vena caudale iniezioni nei piccoli animali sono limitate all’utilizzo di reagenti che non interferire con le procedure sperimentali simultanee e richiedono l’eutanasia del di postinjection di animali di etichettatura 12,13. Alcuni reagenti possono impatto risultati di uno studio e l’assessment terapeutico degli animali coinvolti, quindi la cura nel disegno sperimentale è suggerita.
Questo metodo può, in futuro, essere raffinato con gli avanzamenti nella tecnologia di imaging di piccoli animali, come pure miglioramenti in sonde fluorescenti a infrarossi. Sonde biologiche con un colorante a infrarossi incorporato, progettato per una varietà di diverse applicazioni, possono essere utilizzati nella fase di amministrazione agente di un disegno di studio per convalidare la qualità di un’iniezione, come indicato in questo metodo2,3 ,27,28,29,30,31,32.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P e G.M.G. progettato insieme l’approccio sperimentale per la valutazione nanoemulsioni nel modello del ratto di lesione da costrizione cronica per gli effetti sul dolore neuropatico. G.M.G. ideato e progettato l’approccio di consegna della droga nel complesso del macrofago-mirati con nanoemulsioni, Nanoemulsione composizione e processi per la fabbricazione. G.M.G. prodotto Nanoemulsione, che fu ulteriormente fabbricata da L.L. sotto la Guida di G.M.G. La stabilità della Nanoemulsione è stata valutata dalla cura G.M.G., L.L. e S.P. animale, comportamento, chirurgia, iniezioni della vena della coda, e la formazione immagine NIRF sono state effettuate congiuntamente da M.S. e A.M.S. sotto la Guida di J.A.P Il manoscritto è stato scritto e preparato da M.S., e il protocollo è stato scritto da A.M.S.
Imaging ottico NIR è stata eseguita il piccolo sistema di Imaging animale presso la Duquesne University (supportato da Grant seme di Pittsburgh Tissue Engineering iniziativa). G.M.G. riconosce sostegno dal numero di premio DOD FA8650-17-2-6836, NIDA premio numero 1R21DA039621-01, NIBIB premio numero R21EB023104-02 e AFMSA premio numero FA8650-17-2-6836. J.A.P e J.M.J riconoscere sostegno da Grant seme di Pittsburgh Tissue Engineering iniziativa. J.A.P riconosce anche il premio di malattia temuta Hunkele, Samuel ed Emma inverni Foundation, il fondo Charles Henry Leach II e il premio di valorizzazione ricerca universale del Commonwealth. J.A.P e G.M.G. riconoscere sostegno da parte del prevosto di Duquesne University inaugurale interdisciplinare ricerca consorzi Grant, che supporta il Consorzio di ricerca di dolore cronico.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |