Rundormer Caenorhabditis elegans er en utmerket modell å dissekere vert-patogen interaksjoner. Beskrevet her, er en protokoll for å infisere ormen med medlemmer av mitis gruppe streptococci og fastsette aktivisering av oksidativt stressrespons mot H2O2 produsert av denne gruppen av organismer.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), et frittlevende nematode, har dukket opp som en attraktiv modell å studere vert-patogen interaksjoner. Presentert protokollen bruker denne modellen til å bestemme virusets forårsaket av mitis gruppe streptococci via produksjon av H2O2. Mitis gruppe streptococci er en trussel som forårsaker mange menneskelige sykdommer som bacteremia, endokarditt og orbital cellulitt. Beskrevet her er en protokoll for å bestemme overlevelse av disse ormene svar til H2O2 produsert av denne gruppen av patogener. Bruker genet skn-1 koding for en oksidativt stress respons transkripsjon faktor, er det vist at denne modellen er viktig for å identifisere vert gener som er viktige mot streptokokk infeksjoner. Videre er det vist at aktivering av oksidativt stressrespons kan overvåkes i nærvær av disse patogener med en transgene reporter ormen belastning, der SKN-1 er smeltet grønne fluorescerende protein (GFP). Disse analyser gir mulighet til å studere oksidativt stressrespons til H2O2 avledet av noen biologiske i motsetning til exogenously lagt reaktive oksygen arter (ROS) kilder.
Mitis gruppe streptococci er menneskelige commensals av orofaryngeal hulrom1. Men kan disse organismene unnslippe denne nisje og forårsaker en rekke invasive sykdommer2. Infeksjoner forårsaket av disse mikroorganismer inkluderer bacteremia, endokarditt og orbital cellulitt,2,,3,,4,,5,,6. Videre de dukker opp som forårsaker agenter av blodbanen infeksjoner i immunsupprimerte, neutropenic og pasienter som har gjennomgått kjemoterapi5,7,8,9 .
Mekanismene underliggende mitis gruppe patogenesen er obskure, fordi noen virulens faktorer har blitt identifisert. Gruppen mitis er kjent for å produsere H2O2, som har vist seg for å spille en viktig rolle i oral mikrobielle samfunn10. Flere studier har nylig merket en rolle for H2O2 som en cytotoxin som induserer epithelial celle død11,12. S. lungebetennelse, som tilhører denne gruppen, har vist seg å produsere høye nivåer av H2O2 som induserer DNA skade og apoptose i alveolar celler13. Bruker en akutt lungebetennelse dyremodell, viste samme forskerne at produksjonen av H2O2 av bakterier gir en virulens fordel. Studier på pneumokokk hjernehinnebetennelse har også vist at patogen-avledet H2O2 fungerer synergi med pneumolysin å utløse neuronal celle død14. Disse observasjonene klart å etablere at H2O2 produsert av denne gruppen av bakterier er viktig for deres virusets.
Interessant, har det også vist at medlemmer av mitis gruppe S. mitis og S. oralis forårsake død Rundormer C. elegans via produksjon av H2O215,16. Denne frittlevende Rundormer har blitt brukt som en enkel, genetisk medgjørlig modell for å studere mange biologiske prosesser. Ormen har nylig dukket opp som en modell å studere vert-patogen interaksjoner17,18. I tillegg har flere studier understreket viktigheten av å studere oksidativt stress bruker denne organismen19,20,21. Den korte livssyklusen, evne til å pusse gener av interesse ved RNAi, og bruk av grønne fluorescerende protein (GFP)-smeltet journalister å overvåke genuttrykk er noen av attributtene som gjør det et attraktivt modellsystem. Enda viktigere, er veier som regulerer oksidativt stress og medfødt immunitet i ormen svært bevart med pattedyr20,22.
I denne protokollen, skal vi se hvordan å bruke C. elegans å belyse virusets skyldes streptokokk-avledet H2O2. En modifisert overlevelse analysen vises, og medlemmer av gruppen mitis er kjøpedyktig drepe ormer raskt via produksjon av H2O2. Ved hjelp av medlemmer av gruppen mitis, en vedvarende biologiske kilde til reaktive oksygen arter er (ROS) gitt, i motsetning til kjemiske kilder som induserer oksidativt stress i ormer. Videre kan bakterier kolonisere ormer, hvilke innrømmer for H2O2 å rettes direkte mot intestinal cellene (i forhold til andre kilder som må krysse flere barrierer). Analysen valideres enten 1) for å bestemme overlevelse skn-1 mutert stamme eller 2) ved å banke ned skn-1 bruker RNAi i ormer i forhold til N2 vill-type og vektor kontroll behandlet ormer. SKN-1 er en viktig transkripsjon faktor som regulerer oksidativt stressrespons i C. elegans23,24,25. I tillegg til overlevelse analyser brukes en orm belastning uttrykke SKN-1B/C::GFP transgene reporter overvåke aktivering av oksidativt stress respons via produksjon av H2O2 av gruppen mitis.
Metodene beskrevet kan brukes for andre patogene bakterier som Enterococcus faecium, som også produserer H2O2 dyrket under anaerob eller gram-negative forhold26. For mest sykdomsfremkallende organismer tar det vanligvis flere dager til uker å fullføre de overlevelse analyser. Men på grunn av robust produksjon av H2O2 av medlemmer av gruppen mitis, kan disse analyser fullføres innen 5-6 timer under forholdene beskrevet. Dette sikrer evnen å…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (University of Texas, School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (Universitetet i Louisville, School of Dentistry) og Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) for å gi laboratorie- og kliniske stammer av mitis gruppe streptococci. Vi takker også Dr. Keith Blackwell (genetikk, Harvard Medical School) for C. elegans stammer. Til slutt, vi takker Dr. Danielle Garsin og hennes lab (University of Texas, McGovern Medical School) for å gi reagenser og ormen stammer å gjennomføre studiet. Noen ormen stammer ble levert av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
Media and chemicals | |||
Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
8.25% Sodium Hypochlorite | |||
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
(−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Consumables | |||
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Software | |||
Prism | Graphpad | ||
Bacterial Strains | |||
S. oralis ATCC 35037 | |||
S. mitis ATCC 49456 | |||
S. gordonii DL1 Challis | |||
E. coli OP50 | |||
E. coli HT115 | |||
Worm Strains | |||
Strain | Genotype | Transgene | Source |
N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |