Summary
ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس نموذج ممتاز تشريح التفاعلات المضيف الممرض. الموصوفة هنا بروتوكول تصيب الدودة مع أعضاء العقديّات المجموعة ميتس وتحديد تنشيط استجابة الأكسدة ضد ح2س2 التي تنتجها هذه المجموعة من الكائنات الحية.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس)، ديدان أسطوانية الشرانق، برز كنموذج جذاب لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. يستخدم البروتوكول قدم هذا النموذج لتحديد الأمراض التي تسببها الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس عبر إنتاج ح2س2. هي العقديّات المجموعة ميتس تهديد الناشئ الذي يسبب الكثير من الأمراض البشرية مثل تجرثم والتهاب الشغاف الخلوي المدارية. الموصوفة هنا هو بروتوكول لتحديد بقاء هذه الديدان في الاستجابة إلى ح2س2 التي تنتجها هذه المجموعة من العوامل الممرضة. استخدام الترميز skn-1 الجينات لعامل نسخ استجابة الأكسدة، ويتضح أن هذا النموذج مهم لتحديد الجينات المضيف الأساسية ضد العدوى العقدية. وعلاوة على ذلك، يتضح أن تنشيط استجابة الأكسدة يمكن رصد حضور هذه العوامل الممرضة باستخدام سلالة دودة مراسل المحورة وراثيا، التي هي تنصهر SKN-1 للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). هذه الاختبارات توفير الفرصة لدراسة رد الأكسدة إلى ح2س2 المستمدة من مصدر بيولوجية كمقابل لمناشئ إضافة مصادر الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية.
Introduction
العقديّات المجموعة ميتس كومينسالس البشرية من تجويف المكنسية1. ومع ذلك، يمكن الهروب هذا مكانة هذه الكائنات وتسبب مجموعة متنوعة من الأمراض الغازية2. وتشمل الإصابات الناجمة عن هذه الكائنات المجهرية تجرثم والتهاب الشغاف الخلوي المدارية2،3،4،،من56. وعلاوة على ذلك، أنها تبرز وكلاء المسببة لالتهابات مجرى الدم في نيوتروبينيك المناعة، ومرضى السرطان التي خضعت للعلاج الكيميائي5،،من78،9 .
الآليات التي تحجب ميتس الكامنة وراء المجموعة المرضية، لأنه قد تم تحديد عدة عوامل الفوعة. مجموعة ميتيس المعروف لإنتاج ح2س2، والتي أظهرت أن تلعب دوراً هاما في المجتمعات الميكروبية الشفوي10. في الآونة الأخيرة، وقد أبرزت عدة دراسات دوراً ح2س2 سيتوتوكسين أن يستحث الخلايا الظهارية وفاة11،12. لقد ثبت س. الالتهاب الرئوي، الذي ينتمي إلى هذه المجموعة، لإنتاج مستويات عالية من ح2س2 أن يدفع ضرر الحمض النووي والمبرمج في الخلايا السنخية13. باستخدام نموذج حيوان للالتهاب رئوي حاد، أظهر الباحثون نفس أن إنتاج ح2س2 بواسطة البكتيريا يمنح ميزة ضراوة. وقد أظهرت الدراسات في التهاب السحايا المكوّرات الرئوية أيضا تلك المستمدة من الممرض ح2س2 أفعال تآزر مع بنيوموليسين تؤدي إلى موت الخلايا العصبية14. بوضوح هذه الملاحظات أن2س ح2 التي تنتجها هذه المجموعة من البكتيريا مهم لتلك القدرة الإمراضية.
من المثير للاهتمام، كما ثبت أن أعضاء ميتيس فريق ميتيس س. وس فموية تسبب وفاة السلكية C. ايليجانس عن طريق إنتاج ح2س215،16. هذا ديدان أسطوانية الشرانق قد استخدمت كنموذج بسيط، تتبعها وراثيا لدراسة العديد من العمليات البيولوجية. في الآونة الأخيرة، برز الدودة كنموذج لدراسة المضيف الممرض التفاعلات17،18. وباﻹضافة إلى ذلك، أبرزت العديد من الدراسات على أهمية دراسة الأكسدة باستخدام هذا الكائن الحي19،،من2021. لها دورة حياة قصيرة، والقدرة على الجينات ضربة قاضية للفائدة من [رني]، واستخدام البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-تنصهر الصحفيين لرصد الجينات هي بعض من السمات التي تجعل من نظام نموذج جذاب. الأهم من ذلك، هي الغاية حفظت المسارات التي تنظم الأكسدة والحصانة الفطرية في الدودة مع الثدييات20،22.
في هذا البروتوكول، فإنه يظهر كيفية استخدام C. ايليجانس لتوضيح الحالة المرضية التي تحدثها الناجم عن العقدية مستمدة ح2س2. يرد مقايسة تعديل البقاء على قيد الحياة، وأعضاء فريق ميتس قادرة على قتل الديدان سرعة عن طريق إنتاج ح2س2. استخدام أعضاء المجموعة ميتس، مصدرا البيولوجي مستدام للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يتم توفيرها، بدلاً من مصادر المواد الكيميائية التي تسبب الأكسدة في الديدان. وعلاوة على ذلك، البكتيريا قادرة على استعمار الديدان سريعاً، مما يسمح لح2س2 مستهدفين مباشرة إلى الخلايا المعوية (بالمقارنة مع مصادر أخرى لعبور حواجز عدة). تم التحقق من صحته المقايسة أما 1) عن طريق تحديد بقاء سلالة متحولة skn-1 أو 2) التي هدمت skn-1 استخدام [رني] في الديدان بالنسبة إلى N2 البرية من نوع وناقلات مراقبة علاج الديدان. SKN-1 عامل نسخ هامة التي تنظم استجابة الأكسدة في C. ايليجانس23،،من2425. بالإضافة إلى فحوصات البقاء على قيد الحياة، يستخدم لمراقبة تفعيل الأكسدة الاستجابة عن طريق إنتاج ح2س2 سلالة دودة معربا عن مراسل المعدلة وراثيا SKN-1B/C::GFP فريق ميتس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد لوحات أجار (الخميرة هيويت تود استخراج) خاصتك
- 1 لتر من وسائط الإعلام، لإضافة 30 غ مسحوق تود-هيويت، ز 2 لاستخراج الخميرة و 20 غراما من أجار إلى قارورة Erlenmeyer ل 2. إضافة مل 970 من المياه إلى محتويات قارورة وتضمين شريط إثارة. اﻷوتوكﻻف وسائل الإعلام في درجة حرارة 121 درجة مئوية وضغط 15 رطل/بوصة2 لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تعيين وسائط الإعلام على طبق من إثارة، والسماح للتبريد مع التحريك لطيف.
- صب وسائل الإعلام في حجم مناسب أطباق بيتري معقمة (100 ملم × 15 ملم للنمو والحفاظ على البكتيريا، 35 مم × 10 مم لقتل فحوصات أطباق أطباق) تحت تدفق الصفحي. السماح لوسائل الإعلام الجاف ح 2 تحت غطاء محرك السيارة الصفحي. وبعد ذلك، يمكن تخزين اللوحات في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
2-إعداد متوسطة النمو السلكية (NGM) وتغذية لوحات (NGM [رني]) [رني]
- باستخدام شريط ضجة، حل 2.5 g من ببتون و3g من كلوريد الصوديوم في 970 مل مياه في قارورة Erlenmeyer ل 2. إضافة 20 غراما أجار إلى وسائل الإعلام. اﻷوتوكﻻف تعيين وسائط الإعلام على طبق من إثارة وسائل الإعلام في درجة حرارة 121 درجة مئوية وضغط 15 رطل/بوصة2 ل 30 دقيقة والسماح للتبريد مع التحريك لطيف.
- إضافة الحلول التالية لوسائل الإعلام لإعداد لوحات NGM: 25 مل من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 1 م (الرقم الهيدروجيني = 6.0)، 1 مل من 1 م MgSO4، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل الكوليسترول (5 ملغ/مل في الإيثانول 95%) ، 1 مل النيستاتين (10% v/w في الإيثانول)، و 1 مل من ستربتوميسين 25 ملغ/مل.
- إضافة الحلول التالية لوسائل الإعلام لإعداد NGM [رني] تغذية لوحات: 25 مل من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 1 م (الرقم الهيدروجيني = 6.0)، 1 مل من 1 م MgSO4، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل الكوليسترول (5 ملغ/مل في الإيثانول 95%) ، 1 مل النيستاتين (10% v/w في الإيثانول)، 1 مل من كاربينيسيلين 50 ملغ/مل، ومل 1 من إيم إيبتج.
- من أجل وسائط الإعلام إلى 60 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة تحت الاندفاق الصفحي. السماح لوسائل الإعلام الجاف ح 2 تحت غطاء محرك السيارة الصفحي. وفي وقت لاحق، يمكن تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
3-صيانة C. ايليجانس
- تزرع بذور لوحات NGM باكتشاف ميليلتر 50 من بين عشية وضحاها OP50 كولاي في وسط اللوحات. ثقافة كولاي أعدت مسبقاً في وسائل الإعلام بيرتاني لوريا (رطل) وتخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أشهر. تغطي اللوحات والسماح لهم الجافة ح 24 تحت غطاء الصفحي وبعد ذلك تخزين اللوحات في حاوية البوليستيرين.
- تحت مجهر تشريح، تلتقط 10 12 الكبار جرابيد استخدام اختيار دودة عقيمة ونقل الديدان إلى كولاي OP50 المصنف لوحة NGM. احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، إزالة الكبار استخدام اختيار دودة عقيمة والسماح للأجنة لتطوير لليرقات L4 عند 20 درجة مئوية (يوم ~2.5).
4-إعداد السكان العمر متزامن من الديدان
-
أغسل جرابيد الكبار من اثنين إلى أربعة ألواح NGM باستخدام M9W وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- لإعداد M9W: الجمع بين الجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم وز 6 غ2هبو4ز 3 خ2ص4 وتذوب بحجم نهائي في 1 لتر مياه. اﻷوتوكﻻف الحل وإضافة 1 مل من 1 م MgSO4.
- تدور الأنبوب في 450 x ز لمدة 1 دقيقة، ثم صب المادة طافية مع ضمان أن بيليه دودة تبقى كما هي.
- إضافة 400 ميليلتر من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 8.25% (التبييض المنزلي) و 100 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 5 إعداد حل تحلل دودة. إضافة حل تحلل إلى بيليه دودة وخلط المحتويات خلال يسددها الأنبوب حتى يتم تفكيك 70% الديدان الكبار. دورية مراقبة محتويات الأنبوبة تحت مجهر تشريح لضمان وجود لا أوفيربليتشينج من البيض.
- تمييع هذا المزيج التبييض بإضافة 10 مل M9W إلى محتويات الأنبوبة المخروطية.
- تدور الأنبوب في 450 x ز للمادة 1 دقيقة صب طافية، ثم أضف 10 مل M9W.
- كرر الخطوة 4، 5 مرتين أخريين.
- ريسوسبيند بيليه البيض الناتج في 3-5 مل M9W. وضع الأنبوب على دوار أنبوب. تسمح هذه الأنابيب لتدوير بسرعة في الدقيقة 18 في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي تدور الأنبوب في 450 x ز لمدة 1 دقيقة بيليه اليرقات L1. إزالة أكثر من M9W بتطلع، تاركين وراءهم ~ 250 ميليلتر للسائل في الأنبوب. ريسوسبيند اليرقات L1 وميليلتر مكان 5 ثلاث قطرات من تعليق دودة على غطاء صحن بيتري، ثم تقدير عدد الديدان كل ميليلتر استخدام مجهر تشريح.
5-تحريض [رني] في الديدان
- استخدام عقيمة حلقة أو انتقاء، متواصلة من سلالات المرجوة من المحتوية على [رني] كولاي من الأرصدة المجمدة (مكتبات أهرينجير وفيدال) على 100 ملم × 15 ملم رطل أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 15 ميكروغرام/مل من التتراسيكلين. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 24.
- بيك وتطعيم مستعمرة معزولة من السلالة [رني] المطلوب في أنابيب معقمة 15 مل مخروطية تحتوي على 2 مل رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية ح 16 في شاكر مداري 150 لفة في الدقيقة.
- وفي اليوم التالي نشر 150 ميليلتر من الثقافة نمت بين عشية وضحاها على لوحات التغذية NGM [رني] 65 مم × 15 مم الناشرة عقيمة باستخدام. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 24.
- السماح لوحات لتبريد ل RT بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية. قم بإضافة وحدة تخزين مناسبة من M9W التي تحتوي على يرقات L1 ~ 200 (التي تم الحصول عليها من السكان سن متزامن للخطوات الديدان) إلى كولاي المصنف NGM [رني] تغذية لوحات. احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية حتى تصل اليرقات إلى مرحلة L4 (يوم ~2.5).
6-إعداد العقديّات المجموعة ميتس للإصابة
- متتالية من السلالات المرغوبة من العقديّات في 100 ملم × 15 ملم خاصتك أجار (إذا تم تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية، قبل الحارة لوحات إلى 37 درجة مئوية قبل streaking سلالات كل منهما)، ثم احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح ~ 18) في جرة شمعة توفير en ميكروايروفيليك فيرونمينت لنمو العقديّات (لوحات ستريكيد يمكن تخزينها لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية).
- نشر يعزل السريرية من العقديّات، استخدم الصويا تريبتيك أجار الدم. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في جرة شمعة بين عشية وضحاها (ح ~ 18).
- في اليوم التالي، إزالة اللوحات من جرة شمعة واختيار المستعمرات المعزولة باستخدام حلقة عقيمة. تلقيح الأنابيب المخروطية العقيمة 15 مل يحتوي على 2 مل مرق خاصتك. لنشر يعزل السريرية من العقديّات، الملحق الخطوط الجوية التركية مرق مع 5% v/v الدم الأغنام. إغلاق قبعات ضيقة واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة.
7-بقاء فحوصات
ملاحظة: ويرد في الشكل 1الخطوات التي تنطوي عليها هذه المقايسة. لإثبات أن2س ح2 المستمدة من ميتيس المجموعة مسؤولة عن قتل الدودة واستكمال وسائل الإعلام مع الكاتالاز، أو Δ سلالة متحولةسبكسب ويمكن تكملة سلالة Δسبكسب؛ سبكسب + من جوردو س. يمكن استخدام. ترميز سبكسب أوكسيديز بيروفات، المسؤولة عن إنتاج ح2س2 في المجموعة ميتيس.
- قبل الحارة 35 مم × 10 مم خاصتك لوحات إلى 37 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 80 من ثقافات نمت بين عشية وضحاها من السلالات المرغوبة من العقديّات وتنتشر البكتيريا تماما أجار السطح باستخدام الناشرة عقيمة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في جرة شمعة بين عشية وضحاها (ح ~ 18). كعنصر تحكم، لوحات NGM اثنين 35 × 10 مم البذور مع 80 ميليلتر من ثقافات نمت بين عشية وضحاها من OP50 كولاي . احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- لتأكيد أن2س ح2 التي تنتجها مجموعة ميتس مسؤولة عن قتل الديدان، إضافة 50 ميليلتر المحتوية على 1000 وحدة من كاتالاز (ج) على الخطوط الجوية التركية لوحة. ينتشر كاتالاز الحل باستخدام الناشرة عقيمة والسماح بلوحات لتجف في التدفق الصفحي للحد الأدنى 30 البذور لوحات بعد ذلك مع سلالات العقدية كل منها كما هو موضح في الخطوة 7، 1.
- إزالة اللوحات من جرة شمعة في اليوم التالي، والسماح باختيار لوحات لتبريد ل RT عن 10-15 دقيقة باستخدام دودة عقيمة، ونقل اليرقات L4 30 من NGM أو NGM [رني] تغذية لوحات بالعقدية تبذر خاصتك لوحات. استخدام اثنين المصنف خاصتك لوحات مع ما مجموعة 60 الديدان كل سلالة بكتيريا. احتضان لوحات عند 25 درجة مئوية.
- استخدام مجهر تشريح، عد اليرقات L4 الحية والميتة في كل لوحة في تيميبوينتس عدة. وفي البداية، نقاط الديدان كالميت أو يعيش كل 30 دقيقة. وبعد ذلك، عندما تبدأ الديدان سريعاً ليموت، نقاط لهم عند فواصل زمنية 15 دقيقة. استخدم بيك دودة العقيمة همز الديدان بلطف وتحديد ما إذا كانت حيا أو ميتا. ويعتبر دودة الميت إذا لم يكن هناك أي تحرك في استجابة للحث.
- سوف تتخذ المقايسة ح 5-6 لإكمال. تكرار التجربة مرتين أخريين. بعد انتهاء الفحص، تجمع البيانات من لوحات اثنين. إدخال البيانات الخاصة بكل مجموعة ومقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة، وإجراء تحليل بقاء كابلان-ماير باستخدام البرمجيات الإحصائية.
8-إعداد منصات [اغروس] للفحص المجهري
- حل 2% w/v من [اغروس] في المياه من خلال تدفئة الحل في فرن ميكروويف. حجم 5 مل من محلول كاف لإعداد الشرائح 20.
- عصا الشريط مختبر طولاً على طول شريحتين من الزجاج. هذا وسوف يحدد سمك منصات [اغروس]. ضع شريحة زجاجية نظيفة بين شريحتين مسجلة.
- المكان 100 ميليلتر من [اغروس] المنصهر في وسط الشريحة النظيفة. فورا بوضع زجاج نظيفة آخر على رأس [اغروس] المنصهر واضغط برفق لجعل وسادة. يسمح [اغروس] إلى ترسيخ وبعد ذلك إزالة الشريحة الأعلى. اللوحة [اغروس] جاهز للاستخدام.
9-مراقبة التعريب SKN-1 استجابة للعدوى العقدية
ملاحظة: ويرد في الشكل 2الخطوات التي تنطوي عليها هذه المقايسة. تعريب SKN-1 تقرر استخدام سلالة دودة المعدلة وراثيا SKN-1B/C::GFP. وقد استخدمت تثبت التعريب SKN-1 بسبب إنتاج ح2س2 من فريق ميتيس البرية من نوع (WT)، Δسبكسب، وتكمل سلالة ΔspxB؛ سبكسب + من س. جوردو . وعلاوة على ذلك، استخدمت سلالة محوره وراثيا مراسل SKN-1B/C::GFP وتقنيات التدخل [رني] لإثبات أن مكونات المسار p38 MAPK تنظيم توطين SKN-1.
- قبل الحارة 35 مم × 10 مم خاصتك لوحات إلى 37 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 80 من ثقافات نمت بين عشية وضحاها من السلالات المرغوبة من بكتيريا وتنتشر البكتيريا تماما أجار السطح باستخدام الناشرة عقيمة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في جرة شمعة بين عشية وضحاها (ح ~ 18). كعنصر تحكم، لوحات NGM ثلاثة 35 × 10 مم البذور مع 80 ميليلتر من ثقافات نمت بين عشية وضحاها من OP50 كولاي . احتضان هذه اللوحات في 37 درجة مئوية ح ~ 18.
- إزالة لوحات من جرة شمعة في اليوم التالي، والسماح للوحات لتبريد على RT لليرقات L4 الغسيل 10-15 دقيقة باستخدام M9W من NGM ولوحات التغذية NGM [رني]. جمع الديدان في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
- وتدور هذه الأنابيب في 450 x ز 1 دقيقة صب المادة طافية إضافة 10 مل M9W.
- كرر الخطوة 9.3 ثلاث مرات أكثر.
- ريسوسبيند الديدان في ~ 250 ميليلتر من M9W ومكان ميليلتر 5 ثلاث قطرات من تعليق دودة على طبق بيتري نظيفة غطاء وتقدير عدد الديدان كل ميليلتر استخدام مجهر تشريح.
- إضافة يرقات L4 ~ 100 لكل المصنف خاصتك العقدية ولوحات NGM كولاي المصنف. استخدام لوحات ثلاثة كل سلالة بكتيريا. احتضان لوحات لح 2 إلى 3 عند 25 درجة مئوية.
- بعد ذلك، إزالة اللوحات من الحاضنة وغسلها مع M9W، وجمع الديدان في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
- أغسل الديدان 3 x كما هو موضح في الخطوات 9.3.
- إزالة أكثر من M9W بالطموح وإضافة 500 ميليلتر من M9W التي تحتوي على 2 مم الصوديوم أزيد أو 2 مم تيتراميسولي هيدروكلوريد بيليه دودة. وهذا سوف تخدير الديدان، ضمان أن أي حركة تحدث عند تصويرها تحت المجهر.
تنبيه: استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) عند التعامل مع أزيد الصوديوم. إعداد الحل أزيد تحت غطاء كيميائية. - احتضان الكريات دودة في RT لمدة 15 دقيقة. ثم، بقعة ميليلتر 15 تعليق دودة على منصة استعداد [اغروس]. بلطف ضع ساترة 1.5 رقم فوق اللوحة [اغروس] الذي يحتوي على الديدان أنيسثيتيزيد.
- استخدام مجهر فلوري، تصور التعريب SKN-1 استخدام مرشحات فيتك و DAPI. صورة الديدان في 10 x و 20 x تكبير.
- نقاط الديدان استناداً إلى مستوى التعريب SKN-1. وتصنف لا النووية التعريب والتعريب SKN-1B/C::GFP الأمامي أو الخلفي من الدودة النووية تعريب SKN-1B/C::GFP في كافة الخلايا المعوية أنها منخفضة، متوسطة، ومستويات عالية من التعريب، على التوالي.
- بعد تسجيله ميكروجرافس نيون، تحديد الاختلافات الإحصائية التي تشي-التربيعية والاختبارات فيشر الدقيق باستخدام البرمجيات الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أعضاء ميتيس فريق ميتيس س.، فموية س، وس. جوردو سرعة قتل الديدان، مقابل mutans س. س. ساليفاريوس، وغير ممرضة كولاي OP50 (الشكل 3أ). وكان متوسط بقاء ميتيس س، س. فموية، و جوردو س. 300 دقيقة و 300 دقيقة و 345 دقيقة، على التوالي. لتحديد إذا كان القتل وساطة من ح2س2، استكمل كاتالاز إلى أجار خاصتك. قتل الديدان ألغى حضور كاتالاز (الشكل 3ب). وقد تم تحليل إلى مزيد تأكيد سواء العقدية المشتقة ح2س2 بوساطة قتل الديدان، والبقاء على قيد الحياة على Δسبكسب سلالة متحولة وسلالة WT، وتكملة سلالة Δسبكسب؛ سبكسب + من س. جوردو . لم يلاحظ موت الديدان في سلالة متحولةسبكسب Δ مقارنة البرية من النوع وتكمل سلالات (الشكل 3ج). تشير هذه البيانات إلى أن2س ح2 التي تنتجها مجموعة ميتس يتوسط قتل الديدان. كما لاحظنا حركية قتل مماثلة عندما تتعرض الديدان يعزل السريرية من العقديّات المجموعة ميتس تم الحصول عليها من الدم لمرضى السرطان (الشكل 3د). استناداً إلى البيانات، تم تقييم الحالة المرضية التي تحدثها الناجمة عن ح2س2 التي تنتجها العقديّات المجموعة ميتس.
تحديد الجينات المضيف الأساسية ضد الالتهابات العقدية، skn-1 كان ترسيتها، الذي يشفر لعامل النسخ استجابة الأكسدة في C. ايليجانس. ثم تمت مقارنة البقاء على قيد الحياة مقارنة بالديدان تحكم التعامل مع المتجهات. وقد لوحظ انخفاضا كبيرا في بقاء الديدان ضربة قاضية skn-1 مقارنة بالديدان تحكم التعامل مع المتجهات (الشكل 4أ). كذلك التحقق من صحة هذه البيانات باستخدام سلالة متحولة skn-1 ، وقدرته على البقاء وكان مقارنة بالديدان البرية من نوع N2. لقد احتفلنا النمط الظاهري قتل مماثلة كالمسخ skn-1 ، كما رأينا مع ضربة قاضية skn-1 ، مما يدل على أن تأثر SKN-1 بقاء الديدان في المجموعة ميتس (الشكل 4ب).
المقبل، فقد تقرر ما إذا كانت2س ح2 يصدرها الفريق ميتس بسبب التعريب SKN-1B/C::GFP في الديدان. ولوحظ التعريب SKN-1B/C::GFP في الديدان معرضة للبرية من نوع والبقع مكملاً وليس ردا علىسبكسب Δ سلالة متحولة من س. جوردو (الشكل 5أ) (ب). وعلاوة على ذلك، لتحديد التنشيط SKN-1، مكونات المسار p38 MAPK تم ترسيتها. وقد لوحظ انخفاض توطين SKN-1B/C::GFP في الديدان ضربة قاضية نسي-1، 1 كرونة سويدية، pmk-1، و skn-1 مقارنة بالديدان تحكم التعامل مع المتجهات. ويتضح من البيانات p38 MAPK مطلوب لتفعيل SKN-1 ردا على ح2س2 التي تنتجها مجموعة ميتس (الشكل 5ج، د).
الشكل 1 : مخطط انسيابي تصور الخطوات المتبعة في إعداد فحوصات البقاء على قيد الحياة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مخطط انسيابي تصور الخطوات التي تنطوي عليها التعريب SKN-1 خلال العدوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ح2س2-توسط قتل C. ايليجانس ميتس مجموعة العقديّات. منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير يرقات L4 يتعرضون ل (A) س. جوردوو فموية س.، ميتس س.، س. ساليفاريوس، S. mutans، و OP50 كولاي . (ب) جوردو س.، فموية س.، ميتس س.، س. ساليفاريوس، S. mutans، و OP50 كولاي على ألواح خاصتك حضور 1,000 يو من كتالاز. (ج) س. جوردو WT والمسخسبكسب Δ و Δسبكسب؛ سبكسب + تكملة ضغوطا على يرقات N2 L4. (د) فموية س. (VGS #3) و فموية س. (VGS #4)، س. ميتس (VGS #10)، س. ميتس (VGS #13) و OP50 كولاي . البيانات هي الممثل لتجارب متكررة اثنين أو أكثر من مرة، مع n = الديدان 60 لكل حالة. واستخدمت لمقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة، وحساب متوسط بقاء كابلان-ماير سجل تحليل رتبة. قيم P اعتبرت < 0.05 يعتد به إحصائيا. وقد تم تعديل هذا الرقم وتكييفها مع إذن15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : SKN 1 مطلوب من أجل البقاء على قيد الحياة الديدان في جوردو س.. (أ) بقاء ناقلات تعامل والديدان skn-1 ضربة قاضية يتعرض إلى س. جوردو. بقاء N2 (ب) والديدان متحولة skn-1(zu67) بنك الاحتياطي الفيدرالي على جوردو س. البيانات هي الممثل لتجارب متكررة اثنين أو أكثر من مرة، مع n = الديدان 60 لكل حالة. واستخدمت لمقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة، وحساب متوسط بقاء كابلان-ماير سجل تحليل رتبة. قيم P اعتبرت < 0.05 يعتد به إحصائيا. وقد تم تعديل هذا الرقم وتكييفها مع إذن15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : "العقدية ح"2س2 بوساطة تفعيل SKN-1 تعتمد على المسار p38 MAPK- (أ) الصور التمثيلية لتوطين SKN-1B/C::GFP في الديدان معرضة لوزن والمسخسبكسب Δ Δسبكسب؛ سبكسب + تكملة سلالات جوردو س.. وترد المقربة في الزوايا العلوية اليمنى لكل صورة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) درجة النووية تعريب SKN-1B/C::GFP والنسبة المئوية للديدان في كل فئة يغذيها WT والمسخسبكسب Δ Δسبكسب؛ سبكسب + تكملة سلالات جوردو س. إلى حد كبير لوحظت مستويات منخفضة من توطين SKN-1B/C::GFP النووية في المسخسبكسب Δ (ف < 0.0001) مقارنة وزن و Δسبكسب؛ سبكسب + تكملة سلالات جوردو س.. (ج) الصور التمثيلية لتوطين SKN-1B/C::GFP نسي-1, 1 كرونة سويدية، pmk-1، skn-1 ضربة قاضية، ومكافحة ناقلات الأمراض علاج الديدان في جوردو س.. وترد المقربة في الزوايا العلوية اليمنى لكل صورة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) درجة التعريب SKN-1B/C::GFP النووية والنسبة المئوية للديدان في كل فئة من فئات يغذيها نسي-1، 1 كرونة سويدية، pmk-1، skn-1 ضربة قاضية، ومكافحة ناقلات الأمراض تعامل الديدان في جوردو س. كبيرة لوحظت مستويات منخفضة من توطين SKN-1B/C::GFP النووية في نسي-1 (ف < 0.01)، 1 كرونة سويدية (ف < 0.001)، pmk-1 (ف < 0.0001)،و skn 1 ضربة قاضية (ف < 0.0001) مقارنة بناقل مراقبة علاج الديدان في جوردو س.. أكبر من 100 الديدان معرضة لكل سلالة تم تصويرها، وتكررت التجربة ثلاث مرات. وقد تم تعديل هذا الرقم وتكييفها مع إذن15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام الأساليب الموصوفة للبكتيريا المسببة للأمراض الأخرى مثل فايسيوم البرازية، التي تنتج أيضا ح2س2 نمت تحت اللاهوائية أو شروط ميكروايروفيليك26. عادة، للكائنات المسببة للأمراض الأكثر، يستغرق عدة أيام إلى أسابيع لإتمام فحوصات البقاء على قيد الحياة. ومع ذلك، بسبب إنتاج قوية ح2س2 من قبل أعضاء الفريق ميتس، يمكن إنجاز هذه الاختبارات ضمن ح 5-6 حسب الشروط الموضحة. وهذا ما يضمن القدرة على الشاشة عدة مرشحين الجينات المعنية بالحصانة المضيف ورد الأكسدة على مدى فترة زمنية قصيرة.
في هذا البروتوكول، وح2س2 التي تنتجها البكتيريا في اتصال مباشر مع الخلايا المعوية الدودة، بدلاً من مصادر خارجية أخرى لروس يجب عبر عدة حواجز. وهذا ما يضمن أن يتم تسليم2س ح2 في الخلايا المعوية؛ ومن ثم، يلاحظ ردا قويا أكثر من قتل الدودة. استخدام البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي، فقد تقرر أن الديدان يجب أن يكون معرضا للعوامل الممرضة لمدة 30 دقيقة للاستعمار الكامل ل الأمعاء15. ينصح باستخدام أقل من 1 أسبوع من العمر لوحات متتالية من سلالات العقدية لضمان البقاء والقدرة على إنتاج ح2س2. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تزرع سلالات العقدية تحت ظروف ميكروايروفيليك للإنتاج الأمثل من ح2س2- يمكن استخدام اليرقات L4 أو البالغين 1 يوم من العمر لهذا التحليل. من الأهمية بمكان أن جميع الديدان المستخدمة في تجربة هي بنفس العمر والجنس. الديدان الأصغر سنا يميلون إلى يموت المنحرفين ببطء أكبر مقارنة بكبار السن. الحيوانات L4 بتمييزها بسهولة أكثر لأن بها الفرج النامي مرئياً في منتصف الجسم كتصحيح واضح أنه يتناقض مع بقية الجسم. من المهم أيضا أن لا OP50 كولاي يتم تحويلها إلى لوحات العقدية المصنف. يمكن أن يسبب التلوث بقتل لوحات مع كولاي تخفيف أو إلغاء لقتل الديدان. لتجنب التلوث، من الضروري اختيار الديدان بعيداً عن العشب كولاي . عندما سجل فحوصات البقاء على قيد الحياة، وينصح بمراقبة بلعومية الضخ، تستخدم علفاً لسلوك الرأس، وحركة الجسم. لضمان أن الدودة ميت، يوصي بلطف همز الآنف، الجانب من الجسم أو الذيل ومراقبة أي حركة.
واقترن [رني] التغذية وبقاء الديدان في المجموعة ميتس لتحديد المرشحين التي تشارك في الدفاع ضد ح2س2. استخدام الجينات skn-1 الذي يشفر للأكسدة استجابة نسخ عاملاً، بشرط للبقاء على قيد الحياة للدودة ردا على ح2س2 أثبت هنا. ومن ثم فهذا التحليل يمكن تكييفها للشاشة للعديد من الجينات وتحديد المرشحين المحتملين المطلوبة للاستجابة للأكسدة والحصانة. [رني] تغذية الديدان يتحقق عن طريق إضافة سن مزامنة اليرقات L1 إلى [رني] الإعراب عن المروج كولاي . خلال بروتوكول المزامنة دودة، من الضروري رصد تحلل البشرة دودة حضور التبييض وهيدروكسيد الصوديوم. استمرار سيحل بشرة الكبار واليرقات، بينما يحمي الأجنة جزئيا قشر البيض سميكة. ومع ذلك، قد يسبب حضانة طويلة حضور هذا المزيج هيدروكسيد الصوديوم بلاد الأجنة للموت. ولذلك، من المهم أن نلاحظ الأنبوب الذي يحتوي على الديدان تحت مجهر تشريح دورياً أثناء تبيض. خطوة أخرى للنظر في بروتوكول المزامنة هو الحفاظ على المقبوض عليهم L1 اليرقات. يمكن الحفاظ على اليرقات القبض على محور دوار أنبوب لمدة 5 أيام في درجة حرارة الغرفة. من المستحسن استخدام اليرقات لتغذية [رني] في غضون أيام 1 إلى 2 بعد الفقس. يمكن أن يؤدي تشكيل المرحلة داوير صيانة مطولة في M9W.
أخيرا، كان تستخدم دودة المعدلة وراثيا معربا عن SKN-1 حشو للتجارة والنقل لرصد تنشيط استجابة الأكسدة حضور فريق ميتيس. ويتضح من [رني] أن مكونات p38 MAPK مطلوبة من أجل توطين SKN-1B/C::GFP إلى نويات الخلايا المعوية. من المهم استخدام مراحل هذه السلالة L3 أو L4 لمراقبة توطين SKN-1B/C::GFP، أن التعريب SKN-1 يميل إلى تقليص في مرحلة الكبار. لمراقبة أفضل توطين SKN-1B/C::GFP، فإنه ينصح تتداخل الصور التي تم الحصول عليها باستخدام إعدادات التصفية فيتك و DAPI. أوتوفلوريسسينسي التي تم إنشاؤها بواسطة ليبوفوسسينس المساعدة في توفير التباين للمراقبة للتعريب SKN-1 في الدودة. ومع ذلك، ثبت أيضا أن إشارة ضعيفة أعرب بروتينات فلورية خضراء الصحفيين هو يخفيها أوتوفلوريسسينسي المنبعثة من مصادر مختلفة في القناة الهضمية للدودة. أوتوفلوريسسينسي أظهرت أن تزيد مع التقدم في العمر، وهو أعلى في الأمعاء والرحم من ايليجانس جيم-27. للتغلب على هذه المشكلة، استخدم دراسة أجريت مؤخرا إعداد عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء عصابة ثلاثية لرصد توطين SKN-1B/C::GFP في ايليجانس جيم-28. يفصل هذا الإعداد إشارة بروتينات فلورية خضراء من أوتوفلوريسينسي، عرض في التجارة والنقل وأوتوفلوريسينسي في قنوات الأخضر والأصفر، على التوالي.
C. ايليجانس يستخدم في هذا البروتوكول لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض والتأكد من كيفية ح2س2 التي تنتجها مجموعة ميتس الأسباب الإمراضية. الأهم من ذلك، باستخدام هذا النموذج، يمكن دراسة آثار ح2س2 على الإجهاد شبكي اندوبلاسميك والضرر المتقدرية، ميتوفاجي، أوتوفاجي، والأكسدة. وعلاوة على ذلك، يمكن التعرف على الآليات التي ح2س2 يعمل كعامل فوعة للحصول على الاستجابات المناعية بتعطيل العمليات الأساسية للخلية. ومن ثم فالمسلم هذه الدودة كنظام نموذجي قوية لاكتشاف رؤى جديدة في التفاعلات الممرض المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور يان بينغ وانغ، الدكتورة جينا الجزيء (جامعة تكساس، مدرسة طب الأسنان)، الدكتور ريتشارد لامونت (جامعة لويزفيل، مدرسة طب الأسنان)، والدكتور صموئيل بيتي (مركز السرطان MD أندرسون) لتوفير المختبرات وسلالات السريرية العقديّات المجموعة ميتس. ونشكر أيضا الدكتور كيث بلاكويل (قسم علم الوراثة، مدرسة هارفارد الطبية) لسلالات C. ايليجانس . أخيرا، نحن نشكر الدكتور دانييل جارسين ولها مختبر (جامعة تكساس، كلية الطب ماكجفرن) لتوفير الكواشف وسلالات الفيروس المتنقل لإجراء الدراسة. وقدمت بعض سلالات دودة كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
