Summary
Нематоды Caenorhabditis elegans является прекрасной моделью для рассечения хост возбудитель взаимодействий. Описанные здесь — это протокол для заразить червь с членами mitis стрептококки группы и определения активации окислительного стресса ответ против H2O2 подготовленные этой группой организмов.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), Свободноживущие нематоды, стала привлекательной модель для изучения взаимодействия хост патогена. Представленные протокол использует эту модель для определения патогенности, вызванных стрептококки группы mitis через производство H2O2. Стрептококки группы mitis являются возникающие угрозы, что причиной многих заболеваний человека как бактериемия, эндокардите и орбитального целлюлита. Описанные здесь протокол для определения выживание этих червей в ответ H2O2 производится по этой группе патогенов. В кодировке гена skn-1 для окислительного стресса ответ транскрипционный фактор, показано, что эта модель имеет важное значение для идентификации узла генов, которые необходимы против стрептококковой инфекции. Кроме того показано, что активации реакции окислительного стресса могут контролироваться в присутствии этих патогенов с помощью штамм червь трансгенных репортер, в котором SKN-1 сливается с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Эти анализы обеспечивают добавлена возможность для изучения оксидативного стресса ответ H2O2 экзогенно получаемых биологический источник в отличие от реактивнооксигенных видов (ров) источников.
Introduction
Стрептококки группы Mitis являются человеческие Комменсалами орофарингеальной области полости1. Однако эти организмы могут избежать этой ниши и вызывают различные заболевания инвазивным2. Инфекции, вызванные эти микроорганизмы включают бактериемии, эндокардите и орбитального целлюлита2,3,4,5,6. Кроме того, они появляются как возбудителей инфекций кровотока в нейтропенических с ослабленным иммунитетом и больных раком, которые прошли химиотерапию5,,78,9 .
Механизмы, основные группы патогенеза mitis скрывать, потому что было выявлено несколько факторов вирулентности. Известно, что группа mitis производят H2O2, который показал, чтобы играть важную роль в устной микробных сообществ10. Совсем недавно несколько исследований показали роль H2O2 как cytotoxin, которая вызывает эпителиальных клеток смерть11,12. Было показано, что S. пневмонии, которая принадлежит к этой группе, производят высокий уровень H2O2 , которая вызывает повреждение ДНК и апоптоз в альвеолярных клеток13. Использование животной модели острой пневмонии, же исследователи показали, что производство H2O2 бактериями дает преимущества вирулентности. Исследования по пневмококковой инфекции менингит также показали, что возбудитель производные H2O2 действует синергически с pneumolysin для запуска нейрональных клеток смерть14. Эти наблюдения четко установить, что подготовленные этой группой бактерий H2O2 имеет важное значение для их патогенности.
Интересно, что он также было показано что члены mitis группы S. mitis и S. oralis вызывают смерть нематоды C. elegans через производство H2O215,16. Это Свободноживущие нематоды использовался как простой, генетически шансов справиться с возникающими модель для изучения многих биологических процессов. Совсем недавно червь стала моделью для изучения хост возбудитель взаимодействия17,18. Кроме того некоторые исследования показали важность изучения оксидативного стресса, используя этот организм19,,2021. Его короткий жизненный цикл, способность после нокдауна генов интерес к RNAi и использование зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-плавленый репортеров для мониторинга экспрессии генов являются одними из атрибутов, которые делают его привлекательным модели системы. Что еще более важно пути, которые регулируют оксидативного стресса и врожденный иммунитет в червь высоко консервируют с млекопитающих20,22.
В этом протоколе показано, как использовать C. elegans для выяснения патогенности, вызванных стрептококками производные H2O2. Показано изменение выживания пробирного, и члены группы mitis способны убить черви быстро через производство H2O2. С помощью членов группы mitis, устойчивый биологический источник реактивнооксигенных видов (ROS) при условии, в отличие от химических источников, которые вызывают Оксидативный стресс в глистах. Кроме того бактерии способны колонизировать черви быстро, что позволяет для H2O2 быть непосредственно направлены на кишечные клетки (по сравнению с другими источниками, которые должны пересечь несколько барьеров). Assay проверяется либо 1) путем определения выживания мутантный штамм skn-1 или 2), стучать вниз skn-1 с помощью РНК-интерференции в червей по отношению к N2 одичал тип и вектор управления лечение глистов. SKN-1 является важным транскрипционный фактор, который регулирует оксидативного стресса ответ в C. elegans23,24,25. Помимо выживания анализов червь штамм, выражая трансгенных репортер SKN-1B/C::GFP используется для отслеживания активации окислительного стресса ответ через производство H2O2 mitis группой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка твоего плиты агара (Todd Хьюитт дрожжевой экстракт)
- На 1 Л СМИ добавьте 30 г порошка Тодд-Хьюитт, 2 г экстракта дрожжей и 20 г агар колбу Эрленмейера 2 Л. Добавить содержимое колбы 970 мл деионизированной воды и включают в себя бар stir. Автоклав СМИ при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов/дюйм2 за 30 минут. После этого установите средства массовой информации на тарелку, перемешать и позволяют для охлаждения с мягким перемешиванием.
- Налейте размера стерильные Петри блюда (100 мм х 15 мм для роста и поддержания бактерий, 35 мм x 10 мм блюда за убийство анализов) СМИ под ламинарного потока. Разрешить СМИ сохнуть в течение 2 ч при ламинарных капюшоном. После этого пластины может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
2. Подготовка нематоды роста среднего (НГМ) и интерференции кормления пластины (НГМ RNAi)
- С помощью панели перемешать, Растворите 2.5 g Пептон и 3 г NaCl в 970 мл обессоленной воды в колбу Эрленмейера 2 Л. Добавьте 20 г агара для средств массовой информации. Автоклав СМИ при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов/дюйм2 на 30 мин набор средств массовой информации на тарелку, перемешать и позволяют для охлаждения с мягким перемешиванием.
- Добавьте следующие решения для средств массовой информации для подготовки NGM плит: 25 мл 1 М калия фосфат буфера (рН = 6.0), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл (5 мг/мл в 95% спирте) холестерина , 1 мл (10% v/w в этиловом спирте) нистатин и 1 мл 25 мг/мл стрептомицина.
- Добавьте следующие решения для средств массовой информации для подготовки NGM RNAi кормления пластины: 25 мл 1 М калия фосфат буфера (рН = 6.0), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл (5 мг/мл в 95% спирте) холестерина , 1 мл (10% v/w в этиловом спирте) нистатин, 1 мл carbenicillin 50 мг/мл и 1 мл IM IPTG.
- Залейте СМИ в 60 x 15 мм стерильные чашки Петри под ламинарного потока. Разрешить СМИ сохнуть в течение 2 ч при ламинарных капюшоном. Впоследствии пластины может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
3. поддержание C. elegans
- Семя NGM пластины, кровянистые выделения 50 мкл ночь выросли E. coli ОР50 в центре пластины. E. coli культуры подготовлен ранее в СМИ Бертани Лурия (LB) и хранить при 4 ° C на несколько месяцев. Накладки и позволить им высохнуть в течение 24 ч при ламинарных капюшоном и затем хранить пластин полистирола контейнеров.
- Под микроскопом рассечения, забрать 10-12 взрослых беременных, с использованием стерильных червь забрать и передачи червей в E. coli ОР50 семенами NGM пластины. Инкубируйте пластины при 20 ° C на ночь.
- На следующий день, удалите взрослых с помощью стерильных червь кирку и позволить эмбрионов развивать L4 личинки при 20 ° C (~2.5 дней).
4. Подготовка синхронных населения возраста червей
-
Вымойте беременных взрослых от двух до четырех NGM пластины с помощью M9W и собрать их в 15 мл Конические трубки.
- Подготовить M9W: объединить 3 g NaCl, 6 g Na2HPO4и 3 g KH2PO4 и растворяются в окончательном объеме 1 Л деионизированной воды. Автоклав решения и добавьте 1 mL 1 М MgSO4.
- Спин трубы на 450 x g за 1 мин, а затем декантируют супернатант обеспечивая, что червь Пелле остается неизменным.
- Добавьте 400 мкл гипохлорита натрия 8,25% (бытовые отбеливающие средства) и 100 мкл 5 N NaOH подготовить решение лизис червя. Добавить решение лизиса в Пелле червя и смешать содержимое, стряхивая трубку до тех пор, пока лизированы 70% взрослых червей. Периодически наблюдать за содержимое тюбика под микроскопом рассечения, чтобы убедиться, что существует не overbleaching яйца.
- Разбавленных отбеливатель микс, добавив 10 мл M9W к содержанию Конические трубки.
- Спина трубки на 450 x g за 1 мин Decant супернатанта, затем добавляют 10 мл M9W.
- Повторите шаг 4.5 еще два раза.
- Ресуспензируйте результирующий Пелле яйцо в 3-5 мл M9W. Поместите трубку на вращателе трубки. Разрешить трубы вращаться со скоростью 18 об/мин при комнатной температуре (RT) на ночь.
- Следующий день, спина трубки на 450 x g за 1 мин до Пелле L1 личинки. Удалите большую часть M9W, аспирации, оставив позади ~ 250 мкл жидкости в трубе. Ресуспензируйте L1 личинок и место три 5 мкл капли червь подвески на Петри блюдо крышкой, а затем оценки числа червей за мкл рассечения микроскопе.
5. индукция RNAi в Worms
- С помощью стерильных цикла или выбрать, полоска из желаемых штаммов интерферирующих РНК содержащих E. coli из замороженных запасов (библиотеки Ahringer и Видал) на 100 мм x 15 мм LB плиты агара, содержащие 50 мкг/мл carbenicillin и 15 мкг/мл тетрациклина. Инкубируйте пластины при 37 ° C в течение 24 ч.
- Выбрать и прививать изолированной колонии от желаемого штамма RNAi в стерильных 15 мл конические пробирки, содержащие 2 мл фунтов с 50 мкг/мл carbenicillin. Инкубируйте трубы при 37 ° C для 16 h в орбитальный шейкер на 150 об/мин.
- На следующий день, распространение 150 мкл ночь выращивать культуры на 65 мм x 15 мм кормления пластин NGM интерференции с использованием стерильных разбрасывателя. Инкубируйте пластины при 37 ° C в течение 24 ч.
- Разрешить пластины остыть до RT после инкубации при температуре 37 ° C. Добавьте соответствующий объем M9W содержащий ~ 200 личинок L1 (полученные от синхронного возраста червей шагов) для е. coli посеян NGM RNAi кормления пластины. Инкубируйте пластины при 20 ° C до тех пор, пока личинки достигают стадии L4 (~2.5 дней).
6. Подготовка группы Mitis стрептококки инфекции
- Полоса из желаемых штаммы стрептококков на 100 мм x 15 мм твоих агар (если пластины были сохранены при температуре 4 ° C, предварительно теплой пластин для 37 ° C перед мелирование соответствующих штаммов), затем инкубировать пластин при 37 ° C ночь (~ 18 h) в кувшин свечи предоставление микроаэрофильных en условия для роста стрептококки (прожилками пластины может храниться в неделю на 4 ° C).
- Чтобы распространить клинических изолятов стрептококки, используйте tryptic соевый агар крови. Инкубируйте пластины при 37 ° C в кувшин свечи на ночь (~ 18 h).
- На следующий день, удалить пластины из jar свечи и выбрать отдельные колонии с помощью стерильных цикла. Прививать 15 мл стерильного конические пробирки, содержащие 2 мл твое бульон. Чтобы распространить клинических изолятов стрептококки, дополнить твое бульон с 5% v/v крови овец. Закройте крышки плотно и инкубировать трубы при 37 ° C в статических условиях.
7. выживание анализов
Примечание: Шаги в этом assay изображены на рисунке 1. Чтобы продемонстрировать, что H2O2 получаемых mitis группа несет ответственность за убийство червь, дополнить СМИ с каталазой, или мутантный штамм ΔspxB и дополнением штамм ΔspxB; spxB + S. гордони можно использоваться. SpxB кодирует пируват оксидазы, который отвечает за производство H2O2 в группе КАРПАТЫ.
- Предварительно теплой 35 мм x 10 мм твоих пластин для 37 ° C. 80 мкл ночь выращиваемых культур желаемого штаммы стрептококков и распространение бактерий полностью по всей поверхности агара с помощью стерильных разбрасывателя. Инкубируйте пластины при 37 ° C в кувшин свечи на ночь (~ 18 h). Как элемент управления, семян двух 35 мм x 10 мм NGM пластины с 80 мкл ночь выращиваемых культур E. coli ОР50. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
- Чтобы подтвердить, что H2O2 mitis группа несет ответственность за убийство червей, 50 мкл содержащие 1000 единиц каталазы c на твое пластины. Распространения каталазы решения с помощью стерильных разбрасыватель и позволяют пластины для просушки в ламинарного потока для 30 min. семян пластины впоследствии с соответствующими стрептококк штаммов, как описано в шаге 7.1.
- На следующий день, удалить пластины из jar свечи и позволяют выбрать пластины остыть до RT на 10-15 мин, с использованием стерильных червя, передачи 30 L4 личинок от NGM или NGM RNAi кормления пластины на стрептококк посеян твоих пластины. Использование двух посеян твоих пластины с в общей сложности 60 червей за штамм стрептококка. Инкубировать пластины при 25 ° C.
- Под микроскопом рассечения, подсчитать количество живых и мертвых L4 личинок на каждой табличке на нескольких timepoints. Первоначально Оценка червей как мертвый или живой каждые 30 мин. Впоследствии когда черви быстро начинают умирать, оценка их каждые 15 мин. Используйте стерильные червь забрать мягко подтолкнуть червей и определить, если они являются живым или мертвым. Червь считается мертвым, если нет никакого движения в ответ на подталкивание.
- Assay займет 5-6 ч для завершения. Повторите эксперимент еще два раза. После завершения анализа объединить данные из двух пластин. Ввод данных каждой группы, сравнение кривых выживания и выполнять анализ выживаемости Каплана-Мейера, с использованием статистического программного обеспечения.
8. Подготовка агарозы колодки для микроскопии
- Растворяют 2% w/v агарозы в деионизированной воде путем нагревать решение в микроволновую печь. Объём 5 мл раствора достаточно для подготовки 20 слайдов.
- Палка лаборатории ленту вдоль пополам вдоль двух стеклянных скольжениях. Это позволит определить толщину прокладки агарозы. Место чистой стеклянное скольжение между двумя слайдами тесьмой.
- Место 100 мкл расплавленного агарозы в центре чистый слайд. Сразу же место другой чистый стакан поверх расплавленного агарозы и аккуратно нажмите вниз, чтобы сделать площадку. Разрешить агарозы затвердеть и впоследствии удалить верхний слайд. Pad агарозы готова к использованию.
9. наблюдение за СКН-1 локализации в ответ на инфекцию стрептококка
Примечание: Шаги в этом assay изображены на рисунке 2. Локализация СКН-1 был определен с помощью штамм трансгенных червей SKN-1B/C::GFP. Чтобы продемонстрировать локализации СКН-1 за счет производства H2O2 mitis группой, одичал тип (WT), ΔspxB и дополнение штамм ΔspxB; spxB + S. gordonii были использованы. Кроме того продемонстрировать, что компоненты p38 MAPK путь регулировать локализации СКН-1 использовались трансгенных репортер штамм SKN-1B/C::GFP и RNAi вмешательства техники.
- Предварительно теплой 35 мм x 10 мм твоих пластин для 37 ° C. 80 мкл ночь выращиваемых культур желаемого штаммы стрептококка и распространение бактерий полностью по всей поверхности агара с помощью стерильных разбрасывателя. Инкубируйте пластины при 37 ° C в кувшин свечи на ночь (~ 18 h). Как элемент управления, семя три 35 мм x 10 мм NGM пластины с 80 мкл ночь выращиваемых культур E. coli ОР50. Инкубируйте эти пластины при 37 ° C для ~ 18 h.
- На следующий день, удалите пластины из jar свечи и позволяют пластины для охлаждения для RT для личинок мыть L4 10-15 минут, с помощью M9W от НГМ и NGM RNAi кормления пластин. Соберите червей в 15 мл конические трубы.
- Спин трубы на 450 x g за 1 мин Decant супернатант и добавляют 10 мл M9W.
- Повторите шаг 9.3 еще три раза.
- Ресуспензируйте червей в ~ 250 мкл M9W и место капель три 5 мкл червь подвески на крышку чистой Петри и оценить количество червей за мкл рассечения микроскопе.
- Добавьте личинки L4 ~ 100 каждый твой стрептококк семенами и NGM E. coli посеян пластин. Используйте три пластины на штамм бактерий. Инкубировать пластины для 2-3 ч при 25 ° C.
- После этого удалите пластины из инкубатора, вымыть их с M9W и собрать червей в 15 мл конические трубы.
- Моют червей 3 x, как описано в разделе шаги 9.3.
- Удалить большую часть M9W стремлением и 500 мкл M9W содержащий 2 мм натрия азид или 2 мм Тэтрамизол гидрохлорид червь Пелле. Это будет анестезировать червей, обеспечивая, что не движение происходит когда imaged под микроскопом.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Использование средств индивидуальной защиты (СИЗ), при обработке азид натрия. Приготовляют раствор азид под химические вытяжки. - Инкубируйте червь окатышей в РТ за 15 мин. Затем место 15 мкл червь подвески на площадку подготовленных агарозы. Осторожно поместите № 1,5 coverslip агарозы pad, содержащие наркотизированных червей.
- С помощью флуоресцентного микроскопа, визуализируйте локализации СКН-1 используя FITC и DAPI фильтры. Глисты изображения на 10 x и 20 x увеличениях.
- Оценка червей, основанный на уровень локализации СКН-1. Нет ядерной локализации, локализация SKN-1B/C::GFP в передней или задней червя и ядерной локализации SKN-1B/C::GFP во всех клетках кишечника классифицируются как низкий, средний и высокий уровень локализации, соответственно.
- После забив флуоресцентной микроскопии, определите статистические различия Чи-квадрат и Фишер точные тесты с использованием статистического программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Члены mitis группы S. mitis, S. oralis и S. gordonii быстро убили червей, в отличие от Streptococcus mutans, S. salivarius и непатогенные E. coli ОР50 (рисA). Медиана выживаемости для S. mitis, S. oralis и S. gordonii составила 300 мин, 300 мин и 345 мин, соответственно. Чтобы определить, если убийство было опосредовано H2O2, каталаза был дополнен для твоего агар. Убийство червей был упразднен присутствии каталазы (рис. 3B). Для дальнейшего подтверждения ли стрептококков производных H2O2 опосредованных убийство червей, выживание на ΔspxB мутантный штамм, штамм WT и дополнения штамм ΔspxB; spxB + S. gordonii было проанализировано. Смерть черви не наблюдалось на мутантный штамм ΔspxB , по сравнению с одичал тип и дополнять штаммов (рис. 3C). Эти данные позволяют предположить, что H2O2 , подготовленный группой mitis опосредует убийства червей. Мы также наблюдали аналогичные убийства кинетики, когда черви подвергаются клинических изолятов стрептококки группы mitis, полученные из крови больных раком (рис. 3D). Основываясь на данных, вызванные H2O2 производимые mitis стрептококки группы патогенности оценивали.
Определить хост генов, которые необходимы в отношении стрептококковых инфекций, СКН-1 был сбит, который Кодирует транскрипционный фактор оксидативного стресса ответ в C. elegans. Затем сравнивали выживания относительно вектор управления лечение глистов. Значительное уменьшение выживания нокдаун червей skn-1 было отмечено, по сравнению с вектор управления лечение глистов (рис. 4A). Эти данные была дополнительно подтверждена с помощью мутантный штамм skn-1 , и ее выживание был по сравнению с червей одичал тип N2. Мы наблюдали аналогичные убийства фенотипом мутанта skn-1 , как видно с СКН-1 нокдаун, демонстрируя, что SKN-1 влияние на выживание червей на группе mitis (Рисунок 4B).
Далее было определено ли H2O2 производится группой mitis, вызвало локализации SKN-1B/C::GFP в глистах. Локализация SKN-1B/C::GFP наблюдалось в черви подвергаются одичал типа и дополнения пятен и не в ответ на ΔspxB мутант штамма S. гордони (рис. 5A, B). Кроме того для определения активации СКН-1, компоненты p38 MAPK путь сбили. Было отмечено снижение локализации SKN-1B/C::GFP в нокдаун черви nsy-1, sek-1, ПМК-1 и СКН-1 относительно вектор управления лечение глистов. Данные предлагает p38 MAPK требуется для активации СКН-1 в ответ на H2O2 подготовленного группой mitis (рис. 5C, D).
Рисунок 1 : Блок с изображением шаги, участвующих в подготовке анализов выживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Блок с изображением шаги, необходимые для локализации СКН-1 во время инфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : H2O2-опосредовано стрептококки группы mitis убийство C. elegans . Каплана-Мейера кривых выживания личинок L4, подвержены S. гордони(A), S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans и E. coli ОР50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans и E. coli ОР50 на твой пластины присутствии 1000 U каталазы. (C) S. gordonii WT, мутантspxB Δ и ΔspxB; spxB + дополняют штаммов на N2 L4 личинки. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) и E. coli ОР50. Данные являются представитель экспериментов повторяется два или более раз, с n = 60 червей для каждого условия. Ранг анализ Каплана-Мейера журнала был использован для сравнения кривых выживания и рассчитать медиана выживаемости. P значений < 0,05 считались статистически значимой. Этот рисунок был изменен и адаптированы с разрешением15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : SKN-1 требуется для выживания червей на S. gordonii. (A) выживания переносчиками лечить и СКН-1 нокдаун подвергается S. gordoniiчервей. (B) выживания N2 и мутантов червей skn-1(zu67) кормили на S. gordonii. Данные являются представитель экспериментов повторяется два или более раз, с n = 60 червей для каждого условия. Ранг анализ Каплана-Мейера журнала был использован для сравнения кривых выживания и рассчитать медиана выживаемости. P значений < 0,05 считались статистически значимой. Этот рисунок был изменен и адаптированы с разрешением15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : P38 MAPK путь зависит от стрептококков H2O2 опосредованной активации СКН-1. (A) представитель образы локализации SKN-1B/C::GFP в глистах, подвержены WT, мутантspxB Δ и ΔspxB; spxB + дополнение штаммов S. gordonii. Крупным планом отображаются в верхнем правом углах каждого изображения. Шкалы бар = 100 µm. (B) степень ядерной локализации SKN-1B/C::GFP и процент червей в каждой категории, кормили на WT, мутантspxB Δ и ΔspxB; spxB + дополнение штаммов S. gordonii. Значительно в ΔspxB мутанта (p < 0.0001) по сравнению с WT и ΔspxB; spxB + дополнение штаммов S. gordoniiнаблюдались низкий уровень ядерной локализации SKN-1B/C::GFP. (C) представитель изображения локализации SKN-1B/C::GFP в nsy-1, sek-1, ПМК-1, СКН-1 сногсшибательно и переносчиками лечение червей на S. gordonii. Крупным планом отображаются в верхнем правом углах каждого изображения. Шкалы бар = 100 µm. (D) степень SKN-1B/C::GFP ядерной локализации и процент червей в каждой категории питались nsy-1, sek-1, ПМК-1, СКН-1 сногсшибательно и переносчиками лечение червей на S. gordonii. Значительно в nsy-1 (p < 0.01), sek-1 (p < 0,001), ПМК-1 (p < 0.0001)и СКН-1 нокдаун (p < 0.0001) по сравнению с вектором наблюдались низкие уровни ядерной локализации SKN-1B/C::GFP Управление лечение червей на S. gordonii. Больше чем 100 червей, подвергается каждый штамм были образы, и этот эксперимент был повторен в три раза. Этот рисунок был изменен и адаптированы с разрешением15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные методы могут использоваться для других патогенных бактерий, таких как Enterococcus faecium, который также производит H2O2 выращиваемой в анаэробных или микроаэрофильных условиях26. Как правило для самых патогенных организмов, она занимает несколько дней, недель для завершения выживания анализов. Однако благодаря надежной производства H2O2 членами группы mitis, эти анализы могут быть завершены в течение 5-6 ч при условиях, описанных. Это обеспечивает возможность экран несколько генов кандидатов, участвующих в принимающей иммунитет и окислительного стресса ответ в течение короткого времени.
В этом протоколе H2O2 производится бактериями находится в прямом контакте с клетками кишечника червя, в отличие от других внешних источников ROS, которые должны пересечь несколько барьеров. Это гарантирует, что H2O2 доставляется на кишечные ячейки; Следовательно в червь наблюдается более надежной убийство ответа. С помощью дневно обозначенные бактерий, было установлено, что черви должны подвергаться воздействию патогенов для 30 минут для полного колонизации кишечного тракта15. Рекомендуется использовать меньше чем 1 неделя старый полосу плиты стрептококков штаммов для обеспечения их жизнеспособности и способность производить H2O2. Кроме того, штаммы стрептококков должны быть выращены в микроаэрофильных условиях для оптимального производства H2O2. L4 личинок или 1 день старых взрослых может использоваться для этот assay. Важно, что все черви, используемых в качестве эксперимента являются же возраста и пола. Маленьких червей, как правило, умирают более медленно по сравнению с старше гермафродитки. L4 животные являются более легко отличить, потому что их развивающихся вульвы является видимым в середине тела как ясно патч, который контрастирует с остальной частью тела. Важно также, что не E. coli ОР50 передаются стрептококк посеян пластины. Загрязнение убийстве пластины с E. coli могут вызвать ослабление или отмену убийством червей. Чтобы избежать заражения, необходимо выбрать червей от газона E. coli . Когда забил выживания анализов, рекомендуется соблюдать Фарингальные накачки, нагула поведение головы, и движения тела. Чтобы гарантировать, что червь мертв, рекомендуется аккуратно подталкивать нос, части тела, или хвост и наблюдать за любое движение.
RNAi питания и выживания червей на группе mitis была объединена для выявления кандидатов, которые участвуют в защите против H2O2. С помощью гена skn-1 , который кодирует для ее требование оксидативного стресса ответ транскрипционный фактор для выживания червя в ответ H2O2 продемонстрировали здесь. Следовательно этот assay может быть адаптированы к экрану для нескольких генов и выявления потенциальных кандидатов, необходимых для реакции окислительного стресса и иммунитет. RNAi питание червей достигается путем добавления синхронизированную возраста личинок L1 к интерференции, выражая E. coli газонов. Во время червь протокол синхронизации важно контролировать lysis червь смазывают присутствии отбеливатель и гидроксида натрия. Кутикула личинки и взрослые постоянно растворится, в то время как эмбрионы, частично защищены толстым яичной скорлупы. Однако длительный инкубационный присутствии гидроксида натрия смесь blead может вызвать эмбрионов умереть. Таким образом важно соблюдать трубка, содержащая червей под микроскопом рассечения периодически во время отбеливания. Еще один шаг для рассмотрения в протоколе синхронизации является поддержание арестованных L1 личинок. Арестованных личинки могут обслуживаться на вращателе трубки на 5 дней при комнатной температуре. Рекомендуется использовать для RNAi кормления в течение 1-2 дней после вылупления личинки. Длительное содержание в M9W может привести к образованию срок стадии.
Наконец трансгенных червей, выражая SKN-1 сливается с GFP был использован для мониторинга активации окислительного стресса ответ присутствии mitis группы. RNAi показано, что для локализации SKN-1B/C::GFP в ядрах клеток кишечника требуются компоненты p38 MAPK. Важно использовать L3 и L4 этапы этого штамма соблюдать локализации SKN-1B/C::GFP, как локализация СКН-1, как правило, уменьшить на взрослой стадии. Лучше соблюдать локализации SKN-1B/C::GFP, рекомендуется перекрывать полученных изображений, используя FITC и DAPI настройки фильтра. Аутофлюоресценция порожденных lipofuscins обеспечивают контраст для наблюдения СКН-1 локализации в червь. Однако также было показано, что сигнал со слабовыраженными GFP Репортеры замаскированы аутофлюоресценция, испускаемых различных источников в кишечнике червя. Аутофлюоресценция было показано, что увеличивается с возрастом и является самым высоким в кишечнике и матки в C. elegans27. Для преодоления этой проблемы, недавние исследования используются GFP три диапазона установки фильтра для мониторинга локализации SKN-1B/C::GFP в C. elegans28. Эта установка отделяет GFP сигнал от autofluoresence, отображая GFP и autofluoresence в зеленый и желтый каналы, соответственно.
C. elegans используется в этом протоколе для изучения взаимодействия хост возбудителя и выяснить, как H2O2 подготовленный группой mitis вызывает патогенности. Что еще более важно с помощью этой модели, можно изучить влияние H2O2 на эндоплазматического ретикулярной стресс, повреждение митохондрий, mitophagy, autophagy и окислительного стресса. Кроме того можно определить механизмы, в которых H2O2 действует как фактор вирулентности вызывают иммунный ответ, нарушая основные процессы ячейки. Следовательно этот червь признается в качестве мощной модели системы для обнаружения новое понимание взаимодействия хост патогена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Бинг-Ян Ванг, доктор гена Трибл (Техасский университет, Школа стоматологии), д-р Ричард Ламонт (Луисвиллский университет, Школа стоматологии) и д-р Самуил Shelburne (MD Anderson Cancer Center) для предоставления лабораторных и клинических штаммов mitis стрептококки группы. Мы также благодарим д-р Кит Blackwell (Кафедра генетики, Гарвардской медицинской школы) для штаммов C. elegans . Наконец мы благодарим д-р Даниэль Garsin и ее лаборатории (университета Техаса, Макговерн медицинская школа) за предоставление реагентов и червь штаммов для проведения исследования. Некоторые штаммы червя были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
