Summary
このプロトコルは、ex vivo照射後のマウス乳酸パッドの脱細胞化およびその後のヒドロゲル形成のための方法を提示する。
Abstract
放射線は、トリプルネガティブ乳癌患者のための療法です。健康な乳房組織の細胞外マトリックス(ECM)に対する放射線の影響と原発性腫瘍部位における局所再発におけるその役割は不明である。ここでは、マウスママリー脂肪パッドに由来するECMヒドロゲルの脱細胞化、凍結乾燥、および製造の方法を提示する。脱細胞化プロセスの有効性に関する結果が発表され、評価された。ヒドロゲルに封入されたGFP-およびルシフェラーゼ標識乳癌細胞は、照射ヒドロゲルにおける増殖の増加を示した。最後に、封入腫瘍細胞の細胞骨格組織を可視化するためにファロイジンコンジュゲート染色を用いた。我々の目標は、腫瘍細胞の挙動を研究するために、生体内乳房組織環境と放射線に対する応答を模倣するインビトロ研究のためのヒドロゲルを製造する方法を提示することである。
Introduction
癌は、アポトーシスを回避し、また遠方部位1に転移することができる細胞の過剰増殖によって特徴付げられる。乳癌は米国の女性の間で最も一般的な形態の1つであり、2018年には推定266,000人の新しい症例と40,000人の死亡が2018年2月に推定される。サブタイプを治療するのが特に積極的で困難なのは、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびヒト表皮成長因子(HER2)を欠いているトリプルネガティブ乳癌(TNBC)である。放射線療法は、腫瘍切除術後の残留腫瘍細胞を排除するために乳癌で一般的に使用されるが、TNBC患者の13%以上はまだ原発性腫瘍部位3で再発を経験する。
放射線療法は、腫瘍切除と放射線の組み合わせが乳房切除術と同じ長期生存をもたらすため、転移および再発を緩和するのに有効であることが知られている4。しかし、最近、放射線治療は、免疫不全の設定5、6における原発性腫瘍部位への局所再発と関連することが示されている。また、線維化7を誘導することにより、放射線が正常組織の細胞外マトリックス(ECM)を変化させるのもよく知られている。したがって、腫瘍細胞行動を指示する場合の放射線誘発ECM変化の役割を理解することが重要である。
脱細胞組織は、疾患8、9を研究するためにインビトロモデルとして使用されている。これらの脱細胞組織は、ECM組成物を保持し、生体内ECM中の複合体を再要約する。この脱細胞組織ECMは、細胞増殖および機能10、11の研究に使用することができる再構成されたECMヒドロゲルを形成するためにさらに処理および消化することができる。例えば、脱細胞化ヒト脂肪吸引および心筋組織由来の注射用ヒドロゲルは、組織工学の非侵襲的な方法として役立ち、ブタ肺組織に由来するヒドロゲルをインビトロ試験方法として利用した。間葉系幹細胞の付着および生存率12,13,14.しかし、ECM特性に対する正常組織放射線損傷の影響は調査されていない。
ECMに由来するヒドロゲルは、インビボ現象のインビトロ研究の最大の可能性を秘めています。コラーゲン、フィブリン、マトリゲルを含むいくつかの他の材料が研究されているが、ECM13の組成を総合的に要約することは困難である。ECM由来ヒドロゲルを使用する利点は、ECMが特定の組織14、15に必要なタンパク質および成長因子を含むことです。腫瘍切除の間に正常組織の照射はECMに重大な変化を引き起こし、ECM由来のヒドロゲルはインビトロでこの効果を研究するために使用することができる。この方法は、疾患のインビトロモデルにおいてより複雑で正確になる可能性がある。
本研究では、マウス乳腺脂肪パッド(MMF)を放射線ex vivoに供した。MMFを脱細胞化し、プレゲル溶液にした。ヒドロゲルは、埋め込まれた4T1細胞、マウスTNBC細胞株で形成された。ヒドロゲル材料の再生特性を調べ、ヒドロゲル内で腫瘍細胞ダイナミクスを評価した。照射されたMMFから製造されたヒドロゲルは腫瘍細胞増殖を増強した。今後の研究では、治療後の癌再発の文脈で細胞細胞相互作用を研究するために他の細胞型を組み込む予定です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物研究は、ヴァンダービルト大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された機関ガイドラインとプロトコルに従って行われました。
1. MMFの調製と生体内照射
- CO2窒息を用いてアチミクスNu/Nuマウス(8~10週間)を犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。
- 70%のエタノールを使用して皮膚をきれいにします。
- 完全なRPMI培地を含む15mLの円錐管(RPMIは1%ペニシリン連鎖筋ミンと10%の胎児ウシ血清を補充した)を含む15 mL円錐管で殺菌されたはさみと鉗子を使用して犠牲マウスから乳腺脂肪パッド(MMF)を収集する(材料の表を参照)).
- セシウム源を用いて20Gyにサンプルを照射する。
- 照射された複合機を持ち込み、RPMIメディアをバイオセーフティキャビネットに取り込みます。培養媒体は、最終ヒドロゲルで増殖する細胞株に依存する。6 cm または 10 cm の皿を、MfP を水没させるのに十分なメディアを充填します。6 cm の料理の場合は、8 mL のメディアを使用し、10 cm の料理には 20 mL のメディアを使用します。
- 37 °C/5% CO2インキュベーターで2日間インキュベートします。インキュベーター内の時間の長さは、調整されてもよい。
- リン酸緩衝生理食液(PBS)中の組織をすすいで、余分な水分を吸い込み、MMFを15mL円錐管に入れ、脱細胞まで-80°Cで貯蔵します。この凍結ステップは脱細胞化ステップを助け、次のステップがそうでなければ準備ができている場合でもサンプルを凍結する必要があります。
2. 脱細胞化(参考文献12、16、17から適合)
注:この手順は、DNAを効率的に除去するためにドデシル硫酸ナトリウムではなくデオキシコール酸ナトリウムイオン性洗剤を含む脂肪脱細胞化に焦点を当てた以前に公開された方法から適応された12,16,17.
- 1日目に、-80°Cから凍結したMMFを取り除き、室温で解凍します。
- 解凍したら、デリケートなタスクワイプでMfPを短時間乾燥させます。分析スケールを使用して複合機の重量を量る。
- はさみまたはメスとの鉗子のペアを使用して、無傷のECMとヒドロゲル産生のための残りの組織の研究のために3 mm x 3 mm x 3 mmのサンプルにティッシュを分割する。
注:サンプルの数は、テスト方法の数に依存し、例えば、パラフィン埋め込み用(ステップ2.5)とクライオスタット埋め込み媒体で凍結するためのもの(必要に応じて)の2つのサンプルのコレクションが説明されます(材料の表を参照)。ステップ 2.6)。 - 組織の重量を量る。セクション化のためにパラフィンに埋め込む場合は、ステップ2.5に進みます。断面化用のクライオスタット埋め込み媒体で凍結する場合は、ステップ2.6に進みます。
- 化学フードで、組織を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で4°Cで24時間浸します(材料の表を参照)。PBSで3回ずつ5分間洗います。4°Cで48時間、30%スクロースで組織を浸します。
- この部分が取り除かれたので、組織の重量を量る。手順 2.6 に進み続けます。
- 化学フードに、クライオスタット埋め込み媒体を準備したラベル付きカセットに複合機を置きます。組織を覆うために、より多くのクライオスタット埋め込み媒体を追加します。
- 液体窒素で予め冷却された2メチルブタン(材料の表を参照)のビーカーにカセットを置きます。ビーカーは底を覆うのに十分な2-メチルブタンを持っている必要がありますが、クライオスタット埋め込み媒体は2-メチルブタンに触れるべきではないため、カセットを沈めるのに十分ではありません。カセットは、クライオスタット埋め込み媒体が凍結し、不透明になるまで、2-メチルブタンに座ってみましょう。
- カセットをホイル、ラベルで包み、切り分けに使用するまで-80°Cのままにしておきます。
注:クライオスタット埋め込み培地に直ちに置かれた組織は5μmで区切られ、スクロースでインキュベートされた組織は脂肪細胞形態を保持するために30μmで区切られた。
- 鉗子を使用して、残りの組織を手動でマッサージします。
注:組織片はまた、24-48時間の10%NBFに置き、PBSですすいで、パラフィンに埋め込むまで70%エタノールに残しておくことができます。埋め込みに続いて、5 μmのセクションはヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色に使用することができる(下のセクション7を参照)。 - 5 mL 0.02% トリプシン/0.05% EDTA 溶液で 6 cm 皿に MfP を置きます。37 °Cで1時間スプレーし、インキュベーターに入れる前に70%エタノールで皿を拭きます。
- 0.7mmストレーナーを使用して、組織の上に水を3回注ぐことで、変形(DI)水でMMFを洗浄します。鉗子を使用して、手動で洗い出しの間に組織をマッサージします。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。適切な大きさの攪拌棒を含むプレオートクレーブビーカーにティッシュを置きます。3%t-octylphenoxypolyeトキセタノールの60 mLで組織をカバーし、組織の1gあたり(材料の表を参照)、室温で1時間かき混ぜます。最低 20 mL を使用してください。
- 組織および内容物をストレーナーに投棄する。ビーカーをDI水ですすいで、ティッシュに注ぎます。もう2回繰り返します。鉗子を使用して、リンスの間に組織を手動でマッサージします。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。ティッシュを置き、同じビーカーにバーをかき混ぜ、組織の1gあたり4%のデオキシコール酸の60 mLで覆います。室温で1時間かき混ぜる。最低 20 mL を使用してください。
- ティッシュおよび内容物をメッシュストレーナーに投棄する。ビーカーをDI水ですすいで、ティッシュに注ぎます。もう2回繰り返します。鉗子を使用して、リンスの間に組織を手動でマッサージします。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。
- 1%ペニシリン連鎖マイシンを補充した新鮮なDI水と同じビーカーに組織を置きます。パラフィンフィルムでしっかりと覆います。4°Cで一晩放置します。
- 翌日使用するストレーナーとビーカーを洗います。
- 2日目に、ビーカーの内容物をストレーナーに排水します。繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。
- 適切なサイズの攪拌バーを使用して、同じビーカーに複合機を配置します。組織1g当たり60mL 4%エタノール/0.1%過酢酸溶液で覆う。最低 20 mL を使用してください。室温で2時間かき混ぜる。
- ティッシュおよび内容物を0.7 mmのストレーナーに投棄する。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。ビーカーに内容物を戻します。1gの組織につき1x PBSの60 mLで覆ってティッシュを洗う。最低 20 mL を使用してください。室温で15分間かき混ぜる。1 回繰り返します。
- ティッシュおよび内容物を0.7 mmのストレーナーに投棄する。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。内容物をビーカーに戻します。1gの組織につき60 mL DI水で覆ってティッシュを洗う。最低 20 mL を使用してください。室温で15分間かき混ぜる。1 回繰り返します。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。組織および内容物をストレーナーに投棄する。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。
- 内容物をビーカーに戻します。組織の1gあたり100%n-プロパノールの60 mLで組織を覆う。最低 20 mL を使用してください。室温で1時間かき混ぜる。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。ティッシュおよび内容物を0.7 mmのストレーナーに投棄する。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。
- 内容物をビーカーに戻します。1gの1gあたり60mLのDI水で覆ってティッシュを洗う。最低 20 mL を使用してください。室温で15分間かき混ぜる。3回繰り返します。
- 組織および内容物をストレーナーに投棄する。手順2.3~2.6を繰り返し、クライオスタット埋め込み培地でスクロースインキュベーションと凍結のための組織の断片を収集します。
- 繊細なタスクワイプと重量を量る上で簡単に乾燥ティッシュ。ラベル付きの 15 mL チューブに入れます。一晩-80°Cで凍結します。
3. 凍結乾燥
- -80 °Cから15mLチューブを取り出し、ドライアイスの上に置きます。凍結乾燥剤の上までサンプルを凍結しておきます。
- キャップを削除します。ゴムバンドを使用して、開口部をカバーするために上部に繊細なタスクワイプを取り付けます。少なくとも2日間凍結乾燥剤にサンプルを置きます。
- 凍結乾燥剤からサンプルを取り出し、チューブをドライアイスに置きます。繊細なタスクワイプを削除すると、各サンプルの重さが分析スケールで行えます。キャップを取り付け、一晩-80°Cに置きます。
4. ミリング
- 浅い容器に液体窒素を充填します。-80 °C冷凍庫からサンプルを取り除きます。各凍結乾燥複合機の重量を量る。
- モルタルにサンプルを1つ入れます。液体窒素中にモルタルを保持するために低温手袋を使用してください。
- ハンドヘルドドリルに取り付けた害虫を使用して、サンプルを粉砕します。進行状況を確認し、液体窒素から手袋をした手を取り除くために1分間隔でミル。ミルは最低5分間。
- すべてのサンプルについても同じ手順を繰り返します。各サンプルの間にエタノールでモルタルと害虫をスプレーし、拭きます。
- 粉末状のサンプルは、使用の準備ができるまで-80 °Cで15 mLチューブに保管してください。
注:サンプルは、直ちに使用することも、一晩保存することもできます。
5. ヒドロゲル形成
- 一晩-80°Cで保存する場合は、室温で取り外して解凍します。解凍中に、各サンプルに必要なペプシン(材料表参照)と塩酸酸(HCl)の必要重量を計算し、0.01 M HClで1%w/vペプシンを含む溶液を形成する。ペプシン-HCl溶液。
- 15 mLチューブにサンプル粉末とペプシン-HCl溶液を追加します。小さな攪拌バーを追加し、48時間かき混ぜます。
- チューブを氷の上に5分間置き、1x PBS濃度の溶液をもたらす各サンプルに必要な10x PBSの必要な体積を計算します。各チューブに10x PBSの適切な体積を追加します。
- pH 7.4 に到達するために、各ソリューションに 10% v/v 0.1 M NaOH を追加します。pH用紙を使用して個別にテストします。
注:ゲル溶液は、1週間4°Cで保存してもよい。
6. ヒドロゲル中の細胞の封入
- GFPおよびルシフェラーゼ標識細胞の使用
- pH 7.4ゲル溶液を用いて、ペレットを再ステージングしたGFP-およびルシフェラーゼ標識4T1細胞を、ゲル溶液の500,000または1,000,000細胞/mLの濃度に再sことです。16ウェルチャンバースライドの各ウェルに16 μLのゲルセル溶液を追加します。37°Cで30分間インキュベートします。
- 各ウェルに 100 μL の完全な RPMI メディアを追加します。37 °Cで48時間インキュベーションを続けます。GFPおよびルシフェラーゼ標識細胞は、ゲル化後0時間、24時間、および48時間で蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。
注:細胞増殖は、(S)-4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシ-2-ベンソチアゾリル)-4-チアゾレカルボン酸カリウム塩(材料の表を参照)を10分間ウェルに加えることによって、ここで使用されるGFPおよびルシフェラーゼ標識4T1細胞について測定することができる。生物発光イメージングシステムを用いて生物発光イメージングを行う(「材料の表」参照)。生物発光イメージングに続いて、細胞骨格を可視化することができる(セクション10参照)。
- ラベルなしセルの使用
- pH 7.4ゲル溶液を用いて、ペレット化されていない4T1細胞を500,000または1,000,000細胞/mLのゲル溶液の濃度に再sことです。16ウェルチャンバースライドと96ウェルプレートの各ウェルに16 μLのゲルセル溶液を加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
- 各ウェルに100 μLのメディアを追加します。37 °Cで48時間インキュベーションを続けます。
注:細胞の生存率を測定することができます(セクション11を参照)。16ウェルチャンバースライドはイメージングに使用でき、96ウェルプレートは定量に使用できます。
7. H&E染色
- ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織の場合、脱パラフィン化のために100%キシレン(5〜10分)で5μmのセクションを含むスライドを水没させます。100%、95%、85%、70%のエタノールを5分間、5分間DI水で水和し、ステップ7.6を続けます。
- 凍結した組織切片の場合は、冷凍庫から直ちに切片を取り出し、10%NBFで10分間浸し、それぞれ5分間1x PBSで3回洗います。水で5分間すすいでください。
- 水道水を流す中で3分間ヘマトキシリンで核を汚す。
- 0.3%酸性アルコール(70%エタノールで0.3%HCl)で1~2倍の浸漬により分化します。水道水を5分間流すいでください。
- 30s.リンスのブルーイング剤を5分間流す水道水に加え、95%エタノールで30sの水没させます。
- 室温で90sのエオシンでインキュベートします。100%エタノールの3つの変化でそれぞれ5分間脱水する。
- 100%キシレンに2回ずつ5分間浸します。ディスチレン可塑性キシレン(DPX0取り付けメディアをスライドに追加し、カバースリップを追加します。イメージングの前に一晩硬化させてください。
8. 1-([4-(キリラゾ)キシリル]アゾ)-2-ナフトール染色
- 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-ナフトール溶液を調製する。
- 1-([4-(キシリラゾ)xylyl]azoの0.5gを100mLプロピレングリコールでビーカーに加えます。少なくとも30分間撹拌しながら95~100°Cに熱し、温度が100°Cを超えないようにします。
- ビーカーを熱から取り除き、少し冷まします。グレード4の定性フィルターペーパーを通して溶液を注ぎ、残留微粒子を除去します。
注:溶液は室温で保存することができ、染色の直前に0.45 μmのシリンジフィルターを通して濾過する必要があります。
- 凍結組織切片を汚す。
- -80 °C 冷凍庫からスライドを取り出し、30 分間空気乾燥します。スライドを室温で10分間固定し、DI水で3回5分間洗います。
- プロピレングリコールに2回5分間浸漬する前に、繊細なタスクワイプを使用して余分な水を除去します。プロピレングリコールからスライドを取り除きます。すすがしないでください。
- シリンジフィルターオイルレッドO染色液にスライドを室温で3時間置きます。
- 85%プロピレングリコールにスライドを5分間PBSで2回、それぞれ5分間ずつ配置して差別化します。
- ヘマトキシリンでサンプルを30s.5分間流す水道水で洗浄し、スライドをDI水中に入れます。
- 水性ベースの取り付け媒体を使用してサンプルを取り付け、イメージングの前にメディアを一晩乾燥させます。
9. レロジー
- ステップ5.4から氷上のレオメーターにプレゲル溶液を持参してください。
- レオメーターに25mmのアームとプレートを取り付けます。レオメーターに接続されているコンピュータでレオロジーソフトウェアを開きます。
- 回転マッピングを実行し、ゼロギャップを決定します。完了したら腕を上げます。
- プレート上のプリゲルのピペット500 μL。プレゲル溶液がプレートとアームの間の隙間を完全に占めるまで、腕を下げます。この点を過ぎて腕を下げると、プレゲル溶液が側面からこぼれるので、控えめにしてください。
- 30分間37°Cのままで推移した後、0.1~100Hzのプレゲル溶液で周波数スイープを行います。
- 完了したらレオメーターアームを上げます。繊細なタスクワイプで液体を拭きます。DI水ですすいで、繊細なタスクワイプで拭きます。追加のサンプルで手順 9.4 ~ 9.6 を繰り返します。
10. ファロイジンコンジュゲート F-アクチンの染色
- 室温にファロイジンコンジュゲート溶液を持参してください。開く前に低速で簡単に遠心分離します。アッセイに十分な溶液をアリコートし、残りを-20°Cに保存します。
- 1mL 1x PBS+ 1% ウシ血清アルブミン(BSA)に1μLストック溶液を添加することにより、1x作動溶液に1000倍ファロイジンコンジュゲートストック溶液を希釈する。これは10の井戸(100 μL/ウェル)のために十分に作る。
注:1x PBSを使用することができますが、1x PBS +BSAは、ファロイジンコンジュゲートがチューブに付着するのを防ぐために好ましいです。アッセイの後にこのソリューションを保存しないでください。1 μLの青色蛍光色素(材料表参照)作業液を核の染色に添加してもよい。作動溶液は、11.3 μL 1x PBSと20mMの青色蛍光色素の1μLを混合することによって作製することができる。 - 井戸からメディアを吸引する(ステップ6.1)。1x PBSで井戸をすすいで下ろします。
- 10% NBF を追加します。室温で20分間10%のNBFで井戸をインキュベートします。上清を取り除く。PBSで3回ずつ5分間洗います。
- PBSに0.1%t-Octylphenoxyポリエトキセタノールを5分間吸引し、PBSで3回5分間洗浄します。
- ステップ10.2から各ウェルに100 μLの作業溶液を追加します。室温で1時間インキュベートする。PBSで3回吸引し、毎回5分間洗います。4 °CでPBSに残します。
- チャンバースライドのガスケットから井戸を吸引し、取り外します。針の鼻ピンセットを使用して、スライドからガスケットを取り除きます。水性ベースの取り付け媒体を使用して、マウントおよびカバースリップサンプル。硬化を許可する(5分)。
- 590/618 nmの励起/発光で蛍光顕微鏡下の細胞を観察します。
11. 生存率アッセイ
- ダルベッコのPBS(DPBS)で細胞をすすいで下します。1 μM カルセイン AM および 2 μM エチジウムホモジマーを含む DPBS を各ウェルに 100 μL を追加します。室温で30分間インキュベートします。
- 蛍光顕微鏡による16ウェルチャンバースライドを画像化する。カルセインアセトキシメチル(カルセインAM)は励起/発光=494/517 nmで観察することができる。エチジウムホモジマーは励起/放出=528/645 nmで観察することができる。
- ステップ11.2で同じ波長を使用して、プレートリーダーの96ウェルプレートを読みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MMFは、図1Aに示す手順を用いて照射後に脱細胞化した。MMFの細胞内化(図1B)および細胞外化後(図1C)を示す。脱細胞化はヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を用いて確認され、1-(4-(Xylylazo)xylyl)-2-ナフトール染色を用いて脂質含有量を評価した(図2)。ECMヒドロゲルの特性も37°C(図3)で評価した。貯蔵係数は、すべての条件の損失係数よりも高く、安定したヒドロゲル形成を実証した。
GFP-およびルシフェラーゼ標識4T1乳癌細胞をヒドロゲルに封入した。細胞増殖は、蛍光顕微鏡、生物発光測定、およびカプセル化後48時間の生存率染色によって調べた(図4)。照射されたヒドロゲルは、腫瘍細胞増殖の増加傾向を示した。ファロイジンコンジュゲートは、封入細胞中のF-アクチンを可視化するために使用された(図5)。この技術は、細胞形態および細胞骨格特性を調べるために使用することができる。
図 1: 実験的なワークフロー。(A) ヒドロゲル形成の概略図。デジタルカメラ画像は、MMFの前(B)および脱細胞後(C)を撮影した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MMFにおける脱細胞化および脂質低下の確認パラフィンに埋め込まれ、5μm(A)で断面した非照射MMFのヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)を、凍結スタット埋め込み培地(5μmセクション)で凍結したMMFと比較した(B)前及び脱細胞化後(C)。クライオスタット埋め込み培地で凍結する前にスクロースでインキュベートし、30μm(D)で断面した。1-(4-(Xylylazo)-2-ナフトール染色は、凍結前(E)前および脱細胞化後(F)および脱細胞後に凍結する前に凍結したMMF中の脂質保持を可視化するために行った。クライオスタット埋め込み媒体と30 μmセクション(G)で断面。スケールバーは50 μmを表します。デセル = 脱細胞化。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒドロゲル形成の確認。Rheologyを用いて、コントロール(A)の貯蔵と損失係数を決定し、37°Cおよび0.5%株で複合機から作られた(B)プレゲル溶液を照射した。誤差バーは標準偏差を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:照射されたECMヒドロゲルにおける腫瘍細胞増殖。接種後4T1細胞増殖48hは、対照(A)および照射(B)MMF.(C)制御および照射ヒドロゲル内に埋め込まれた4T1細胞からの生物発光シグナルを用いて示す。カルセインAM染色生細胞およびエチジウムホモジマー染色死細胞を対照(D)および照射(E)ヒドロゲルで評価し、生死比を定量した(F)。スケール バーは 200 μm を表します。エラー バーには標準エラーが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ECMヒドロゲルにおける細胞骨格特性(A)対照及び(B)照射されたECMヒドロゲル内の細胞は、F-アクチン(赤)と青色蛍光色素を可視化するためにファロイジン共重ゲートで染色され、照射されたMMFで核(青色)を可視化する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 組織重量(g) | コントロール (0 Gy) |
照射 (20 Gy) |
| 初期複合機の重量 | 0.46100 | 0.457 |
| 経口の精検サンプル除去後の複合機重量 | 0.423年 | 0.416 |
| 脱細胞化後の複合機重量 | 0.025 | 0.025 |
| 組織学サンプル除去後の細胞細胞化複合機重量 | 0.015年 | 0.016 |
表1:脱細胞前後の組織重み付け各条件の代表的な組織重量は、MFP脱細胞化の前後に測定した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒドロゲル形成のこの方法は、開始組織の量に大きく依存する。マウスMGPは小さく、脱細胞化プロセスは材料の大幅な減少をもたらす(表1)。プロセスは、最終的な収率を高めるために、より多くの複合機で繰り返すことができます。フライス加工は、材料の損失につながる可能性のあるもう一つの重要なステップです。他の人は低温ミルで成功を示していますが、このプロトコルは、手持ちのモルタルを介したフライス加工と害虫の付属品8、17を備えた電気ドリルに基づいています。これは、資本コストを削減し、材料損失を最小限に抑える利点がありますが、最終製品にばらつきを導入する可能性があります。
脱細胞性および脱脂質の確認に対する課題は、クライオスタット埋め込み培地中の脂肪組織を凍結することである。図2Aは、パラフィンに埋め込まれ、区分された未照化された複合機のH&E染色を示す。異なる核は、他の細胞との接合部の近くに脂肪細胞の端に見え、脂肪細胞形態はよく維持されています。図 2B,C,E,Fは、クライオスタット埋め込み媒体に MMF を埋め込み、凍結し、5 μm スライスを断面することによって調製された MMF を示します。このプロセスは脂肪細胞の形態および形を保持することができなかった。しかし、脱細胞化は、核およびDNAの他の痕跡の喪失(図2C)を通じて確認され、中性脂質含有量染色の喪失と共に脱脂を可視化した(図2F)。脂肪細胞形態は、スクロース内のMMFをインキュベートし、クライオスタット埋め込み媒体に埋め込みおよび凍結し、30 μmのスライスを断面することによって維持された(図2D,G)。 この方法ではH&E染色の可視化は困難であったが(図2D)、1-(4-(Xylylazo)xylyl)-2-ナフトール染色は脂肪細胞形態の保持を確認した(図2G)。
インビトロヒドロゲルモデルを開発し、生体内正常組織微小環境と放射線損傷に対する応答を模倣できる。ECMヒドロゲルは同様の研究で製造されているが、腫瘍細胞行動に対する放射線損傷の影響は評価されていない9、12、16、17、18。MMFの照射がECMの改造や組成を変え、これらの組成変化が今後の研究で特徴づけられることを期待しています。生物発光イメージングと生存率染色の両方を用いて照射されたECMヒドロゲル内の4T1細胞の増殖傾向が見られた(図4)。また、封入腫瘍細胞にF-アクチンフィラメントを染色するためにファロイジンコンジュゲートを使用し、照射されたECMヒドロゲルにおけるアクチンアライメントおよび腫瘍細胞伸長の定性的増加を見出し、接着強度の増加を示唆し、侵略的な容量 (図 5)19,20.今後の実験では、細胞の移動と侵入の評価のための焦点接着ダイナミクスとプロテアーゼ媒介リモデリングの変化を探る予定です。
この方法は、マウスTNBC細胞株を用いて開発されたが、この方法は、他の細胞型の増殖および侵襲性を評価するためのプラットフォームとして使用することができる。将来の研究は、放射線に応答する役割を決定するために免疫細胞を組み込むことだけでなく、組織の損傷の他の形態(例えば、手術)を組み込むかもしれません。本研究では、MMFからECMヒドロゲルを照射してex vivoを照射したが、さらなる研究は、生理的放射線応答およびECM特性に対する免疫細胞の浸潤の影響を評価するために、MMFの生体内放射線で探索する。マウス複合機からECMヒドロゲルを作製する方法を確立し、腫瘍細胞の挙動に対する正常組織放射線の影響を調べ、より関連性の高いヒドロゲルモデルのためにヒト組織に拡張することができる。全体的に、ECMヒドロゲルを介して正常な組織損傷を調べることは、局所再発における放射線療法後のECM変化の役割に関する洞察につながる可能性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、GFPおよびルシフェラーゼ-4T1細胞を提供したローラ・L・ブロンサート博士に感謝し、エドワード・L・ラゴリー博士は1-([4-(ザイラゾ)xylyl]アゾ)-2-ナフトール染色、IVISおよび凍結性細胞使用のためのクレイグ・L・デュバル博士にアドバイスを提供した。使用。この研究は、NIH助成金#R00CA201304によって財政的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
