Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

Published: July 24, 2019 doi: 10.3791/59304
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.

Abstract

קרינה היא טיפול עבור חולים עם סרטן שד שלילי משולשת. ההשפעה של הקרינה על מטריצה החילוץ (ECM) של רקמת השד בריא תפקידה בהישנות המקומי באתר הגידול העיקרי אינם ידועים. כאן אנו מציגים שיטה לdecellularization, ליטוטיזציה ולייצור של הידרוג ECM הנגזרים מרפידות שומן החלב של מורלין. תוצאות מוצגות על האפקטיביות של התהליך decellularization, ופרמטרים rheological העריכו. GFP-ו לוציפראז-התווית תאים סרטן השד כדוריות בהידרוג הפגינו גידול התפשטות של הידרוג הוקרן. לבסוף, phalloidin כתמים המשלים היה מועסק להמחיש את הארגון השלד של תאים סרטניים כימוס. המטרה שלנו היא להציג שיטה עבור בדיית הידרולים עבור מחקר מתורבת המחקים את הסביבה רקמת השד vivo התגובה שלה קרינה על מנת ללמוד התנהגות תא הגידול.

Introduction

סרטן מאופיין התפשטות עודפת של תאים שיכולים להתחמק אפופטוזיס וגם גרורות לאתרים מרוחקים1. סרטן השד היא אחת הצורות הנפוצות ביותר בקרב הנקבות בארה ב, עם מוערך 266,000 מקרים חדשים ו 40,000 מקרי מוות ב 20182. אגרסיבי במיוחד וקשה לטיפול סוג המשנה הוא סרטן שד שלילי משולשת (TNBC), אשר חסר קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), ואת גורם הצמיחה באפידרמיס האנושית (HER2). טיפול בהקרנות משמש בדרך כלל בסרטן השד כדי למנוע תאים סרטניים שיורית בעקבות כריתת גוש, אבל מעל 13% מהחולים TNBC עדיין לחוות הישנות באתר הגידול העיקרי3.

ידוע כי טיפול בהקרנות יעיל ב גרורות והישנות משום שילוב של כריתת הגוש ותוצאות הקרינה באותה הישרדות לטווח ארוך כמו כריתת שד4. עם זאת, הוא הוכח לאחרונה כי הטיפול בקרינה קשורה הישנות מקומית לאתר הגידול העיקרי בהגדרות החיסונית5,6. כמו כן, ידוע כי הקרינה משנה את מטריצה החילוץ (ECM) של רקמות נורמליות על ידי גרימת פיברוזיס7. לכן, חשוב להבין את התפקיד של שינויי קרינה ECM המושרה בכתיב התנהגות תא הגידול.

Decellularized רקמות שימשו מודלים מבחנה ללמוד מחלה8,9. הרקמות הdecellularized האלה שומרות על הלחנה של ECM ומכואיאת הקומפלקס בvivo ECM. זה decellularized רקמת ecm יכול להיות נוסף מעובד מתעכל לטופס מחודשת ידרו ecm הידרוג שיכול לשמש כדי ללמוד צמיחת תאים פונקציה10,11. לדוגמה, הידרוג זריקות המופק decellularized ליפוף האדם ומרקמת שריר הלב שימש שיטות שאינן פולשני של הנדסת רקמות, ו הידרוג'ל נגזר רקמת ריאות חזירי היה מנוצל כשיטת מחוץ גופית של בדיקות תא גזע של mesenchymal המצורף והכדאיות12,13,14. ההשפעה של נזק לקרינה נורמלית רקמות על מאפייני ECM, עם זאת, לא נחקרו.

הידרולים הנגזרים מ-ECM יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר מבחנה בתופעות vivo. כמה חומרים אחרים נחקרו, כולל קולגן, פיברומין, ו מטריצות, אבל קשה לעשות בצורה מלאכותית את הרכב של ECM13. יתרון של שימוש ב-ecm הידרוג נגזר הוא כי ecm מכיל את החלבונים הדרושים וגורמי גדילה עבור רקמה מסוימת14,15. הקרנה של רקמה נורמלית במהלך כריתת הגוש גורמת לשינויים משמעותיים ב-ECM, וניתן להשתמש בהידרוג הנגזר של ECM כדי ללמוד את האפקט הזה באופן מתורבת. שיטה זו יכולה להוביל ליותר מורכב ומדויק יותר במודלים של מחלות חוץ-גופית.

במחקר זה, אנו חשופים שומן החלב מורטין רפידות (MFPs) כדי קרינה ex vivo. MFPs היו decellularized והפכו לפתרון טרום ג'ל. הידרולים הוקמה עם תאים 4T1 מוטבע, קו תא מוראן TNBC. התכונות הרטיאוולוגיות של חומר ההידרוג'ל נבדקו, והדינמיקה של תאי הגידול הוערכו בתוך ההידרוג'לים. הידרולים המציא התפשטות MFPs לקרינה משופרת תא הגידול. מחקרים עתידיים לשלב סוגי תאים אחרים כדי ללמוד אינטראקציות תא תאים בהקשר של הישנות סרטן בעקבות הטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.

1. הכנה והקרנה vivo ex של MFPs

  1. הקריבו עכברים Nu/Nu (8 – 10 שבועות) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  2. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
  3. לאסוף רפידות שומן החלב (MFPs) מפני עכברים הוקרב באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים בצינור 15 מ ל חרוט המכיל מדיה RPMI מלאה (RPMI שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי) (לראות את הטבלה של חומרים ).
  4. הקרינים דגימות ל-20 Gy באמצעות מקור צסיום.
  5. להביא את mfps לקרינה ומדיה מלאה RPMI לתוך הקבינט אבטחה טיחות. התקשורת תהיה תלויה בקו התאים כדי לגדול בהידרוג'ל הסופי. מילוי 6 ס"מ או 10 ס מ מנות עם מספיק מדיה כדי להטביע את MFPs. בעבור 6 ס"מ מנות, להשתמש 8 מ ל של מדיה, ו עבור 10 ס"מ מנות, להשתמש 20 מ ל של מדיה.
  6. דגירה של 37 ° c/5% בחממה2 במשך יומיים. ניתן לכוונן את משך הזמן בחממה.
  7. לשטוף את הרקמות בתמיסת מלח מתכלה (PBS), למחוק לחות עודפים, ומקום MFPs לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט לאחסון ב-80 ° c עד decellularization. שלב קפוא זה מסייע לשלב הdecellularization והמדגם צריך להיות מוקפא גם אם הצעדים הבאים מוכנים אחרת.

2. Decellularization (מותאם להפניות12,16,17)

הערה: הליך זה הותאם משיטות שפורסמו בעבר התמקדו באדיפוז decellularization, שכללה את חומר הניקוי היוני של הנתרן במקום נתרן dodecyl סולפט כדי להסיר דנ א ביעילות12,16 , . שבע עשרה

  1. ביום 1, להסיר mfps קפוא מ-80 ° c ולהפשיר בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר הופכה, היבש MFPs בקצרה על מחיקה משימה עדינה. שוקלים את MFPs באמצעות קנה מידה אנליטי.
  3. באמצעות זוג מלקחיים עם מספריים או אזמל, לחלק רקמות עד 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ דגימות למחקר של ECM שלם ואת הרקמה הנותרת לייצור הידרוג'ל.
    הערה: מספר הדגימות תלוי במספר שיטות הבדיקה, לדוגמה, אוסף של שתי דגימות מתואר להלן: אחד להטבעת פרפין (שלב 2.5) ואחד להקפאה במדיום הטבעה קריוסטט, אם תרצה (ראה את רשימת החומרים וצעד 2.6).
  4. . שוקלים את הרקמות במקרה של הטבעה בפרפין, המשיכו לשלב 2.5. אם הקפאה בהקפאה הטבעה בינונית לצורך שיבוץ, המשך לשלב 2.6.
  5. בכיפה כימית, יש לטבול את הרקמה ב-10% (NBF) (לראות את טבלת החומרים) במשך 24 שעות ב -4 ° c. לרחוץ 3 פעמים ב-PBS עבור 5 דקות כל אחד. השקיעו את הרקמה ב -30% סוכרוז תמורת 48 h ב -4 ° c.
    1. שוקלים את הרקמה עכשיו. שהפיסה הזו הוסרה . המשך לצעוד 2.6
  6. בשכונה כימית, מקום חתיכות MFP בקלטת עם תוויות הכין מדיום הטבעה קריוסטט. הוסף עוד בינוני הטבעה קריוסטט כדי לכסות את הרקמה.
    1. מניחים את הקלטת לתוך גביע של 2-מתילבוטאן (לראות את הטבלה של חומרים) כי הוא מקורר מראש עם חנקן נוזלי. הגביע צריך מספיק 2-מתילבוטאן לכסות את החלק התחתון, אבל לא מספיק כדי להטביע את הקלטת כי מדיום הטבעה קריוסטט לא צריך לגעת 2-מתילבוטאן. תן את הקלטת לשבת 2-מתילבוטאן עד מדיום הטבעה קריוסטט קופא והופך אטום.
    2. עטוף את הקלטות בנייר הכסף, התווית והשאר ב-80 ° צ' עד שהוא משמש לסיכום.
      הערה: הרקמות ממוקמות מיד במדיום הטבעה של קריוסטט היו מנות ב 5 יקרומטר בעוד רקמות מודבטים בסוכרוז היו מנות ב 30 יקרומטר כדי לשמור על מורפולוגיה אדיפוציטוטה.
  7. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה הנותרת.
    הערה: חתיכות רקמה ניתן למקם גם ב 10% NBF עבור 24 – 48 h, שטף ב-PBS, ועזב ב 70% אתנול עד הטבעה פרפין. בעקבות הטבעה, 5 מקטעי יקרומטר ניתן להשתמש עבור המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) כתמים (ראה סעיף 7 להלן).
  8. מניחים את MFPs ב 6 מנות ס מ עם 5 מ"ל 0.02% טריפסין/0.05% הפתרון EDTA. מריסת ב37 מעלות צלזיוס עבור 1 h רסס ונגב את הכלים עם 70% אתנול לפני הצבת בחממה.
  9. השתמש 0.7 מ"מ משתמשים כדי לשטוף את MFPs עם מים מוכי (די) על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין שוטף.
  10. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים רקמות בגביע שלפני-אוטוקלאוד המכיל בר מהומה בגודל כראוי. לכסות את הרקמות עם 60 mL של 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 גרם של רקמה ומערבבים עבור 1 h בטמפרטורת החדר. השתמש במינימום של 20 מ ל.
  11. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת לשטוף את הגביע עם די מים ולשפוך על רקמות. . אני חוזר עוד פעמיים השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין rinses.
  12. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים רקמות ומערבבים בחזרה באותם כוסות, ומכסים עם 60 mL של 4% חומצה deoxycholic לכל 1 גרם של רקמה. מערבבים 1 h בטמפרטורת החדר. השתמש במינימום של 20 מ ל.
  13. השלכת רקמות ותוכן לתוך מסננת שינוי. לשטוף את הגביע עם מים DI ולשפוך על רקמות. . אני חוזר עוד פעמיים השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין rinses.
  14. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל.
  15. מניחים רקמות בגביע אותו עם מים טריים שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מכסים בחוזקה את סרט הפרפין. השאירו את הלילה ב -4 ° c.
  16. שטוף מכוניות וספלים לשימוש למחרת.
  17. ביום השני, לנקז את התוכן במבחנה לתוך מסננת. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל.
  18. מקום MFPs בגביע זהה עם בר המהומה בגודל כראוי. כיסוי עם 60 mL 4% אתנול/0.1% מהחומצה peracetic פתרון לכל 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  19. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה. . הציבו את התוכן בחזרה לגביע לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 mL של 1x PBS עבור 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור על זה פעם אחת
  20. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 mL DI מים עבור 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור על זה פעם אחת
  21. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה.
  22. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לכסות את הרקמות עם 60 mL של 100% n-propanol per 1 g של רקמות. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים 1 h בטמפרטורת החדר.
  23. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה.
  24. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 mL של מים DI 1 g של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור שלוש פעמים
  25. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת חזור על שלבים 2.3 – 2.6 כדי לאסוף פיסות של רקמה עבור סוכות הדגירה והקפאת בינונית הטבעה קריוסטט.
  26. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים בשפופרת בעלת תווית של 15 מ ל. להקפיא ב-80 ° c בלילה.

3. ליזוזציה

  1. הסירו את 15 הצינורות מ-80 ° c ומניחים על קרח יבש. שמרו דגימות קפואות על קרח יבש עד לליאופליזר.
  2. הסר כובעים. השתמש בגומייה כדי לחבר משימה עדינה למחוק למעלה כדי לכסות את הפתח. שימו דגימות על הליאופליזר. לפחות יומיים
  3. הסירו דגימות מהליאופליזר והניחו צינורות על קרח יבש. להסיר מגבונים משימה עדינים שוקל כל דוגמה בקנה מידה אנליטי. הצמד כמוסות ומקום בשעה-80 ° c בלילה.

4. כרסום

  1. ממלאים מיכל רדוד עם חנקן נוזלי. להסיר דגימות ממקפיא-80 ° c. שוקלים כל היתר.
  2. מניחים דגימה אחת בחומר המליטה. השתמש בכפפות קריוגניים. כדי להחזיק את חומר המליטה בחנקן הנוזלי
  3. השתמש בסחוס המחובר למקדח ידני כדי לטחנת את המדגם. מיל ב 1 דקות מרווחי לבדוק את ההתקדמות ולהסיר יד כדורית מחנקן נוזלי. מיל למינימום של 5 דקות.
  4. חזור על כל הדגימות. רסס ונגב את חומרי המליטה והזיפים באתנול בין כל דוגמא.
  5. לאחסן דגימות אבקה בתוך 15 שפופרות mL ב-80 ° c עד מוכן לשימוש.
    הערה: ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי או מאוחסן בין לילה.

5. מערך הידרוג'ל

  1. אם מאוחסן ב-80 ° c בלילה, להסיר ולהפשיר בטמפרטורת החדר. בעוד הפשרה, לחשב את המשקל הדרוש של פפסין (לראות את הטבלה של חומרים) ואת נפח של חומצה הידרוכלורית (HCl) הדרושים עבור כל מדגם שתוצאתו פתרון עם 1% w/v לדוגמה אבקה ו 0.1% w/v פפסין ב 0.01 מ ' hcl. מוסיפים את הפנסין ל-hcl כדי ליצור פתרון של הפנסין-HCl.
  2. הוסף אבקת דגימה ופתרון pepsin-HCl לשפופרת של 15 מ ל. הוסף בר מהומה קטן, ומערבבים עבור 48 h.
  3. מניחים את הצינורות על הקרח 5 דקות. לחשב את הנפח הדרוש של 10x PBS הדרושים עבור כל מדגם שתוצאתו פתרון עם ריכוז 1x PBS. הוסף את הנפח המתאים של 10x PBS לכל צינור.
  4. הוסף 10% v/v 0.1 M NaOH לכל פתרון כדי להגיע ל-pH 7.4. השתמש בנייר pH כדי לבדוק בנפרד.
    הערה: ניתן לאחסן פתרון ג'ל ב-4 ° צ' לשבוע אחד.

6. תאים Encapsulating בהידרוג'לים

  1. שימוש בתאים המסומנים ב-GFP ולוציפראז
    1. באמצעות הפתרון pH 7.4 ג'ל, להשעות מחדש את התאים GFP-ו-לוציפראז-התווית בתאי 4T1 לריכוז של 500,000 או 1,000,000 תאים/mL של תמיסת ג'ל. הוסף 16 μL של פתרון התאים ג'ל לכל באר של שקופית קאמרית של 16 היטב. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
    2. הוסף 100 μL של מדיית RPMI מלאה לכל טוב. המשך הדגירה עבור 48 h ב 37 ° c. התאים GFP-ו לוציפראז-התוויות ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ הזריחה ב 0 שעות, 24 שעות, ו 48 שעות לאחר הגגנציה.
      הערה: ניתן למדוד את התפשטות התא עבור התאים GFP-ולוציפראז המסומנים ב-4T1 בשימוש כאן על ידי הוספה (S)-4, 5-Dihydro ידרו-2-(6-הידרוxy-2-בנזוטילקסיל) -4-טיזולקרבוקסילית חומצה אשלגן מלח (לראות את ה וביצוע דימות ביולומינציה באמצעות מערכת דימות ביולומינסנציה (ראה טבלת חומרים). לאחר הדמיה ביולומינסנציה, שלד התא יכול להיות דמיינו (ראה סעיף 10).
  2. שימוש בתאים ללא תווית
    1. באמצעות הפתרון pH 7.4 ג'ל, להשהות מחדש את התאים 4T1 בלתי מסומן לריכוז של 500,000 או 1,000,000 תאים/mL של תמיסת ג'ל. הוסף 16 μL של פתרון התאים ג'ל לכל באר של 16-היטב שקופית קאמרית וצלחת 96-באר. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
    2. הוסף 100 μL של מדיה לכל באר. המשך הדגירה עבור 48 h ב 37 ° c.
      הערה: ניתן למדוד את הכדאיות של התא (ראה סעיף 11). ניתן להשתמש בשקופית הקאמרית של 16 היטב לדימות, והצלחת 96-באר יכולה לשמש לשימוש בקוונפיקציה.

7. H & E צביעת

  1. עבור formalin-קבוע, פרפין רקמה מוטבעת, לטבול שקופיות המכיל 5 יקרומטר סעיפים פעמיים ב 100% קסילין (5-10 דקות) עבור דה-פראפיזציה. מימה מחדש על ידי מיזוג משנה ב 100%, 95%, 85%, ו 70% אתנול עבור 5 דקות כל אחד ואחריו די מים עבור 5 דקות. המשך לשלב 7.6.
  2. עבור מקטעי רקמות קפואים, לקחת סעיפים מיד ממקפיא לטבול אותם ב 10% NBF עבור 10 דקות. לשטוף ב-1x PBS שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד. לשטוף במים עבור 5 דקות.
  3. כתמים של גרעינים עם המטאוקסילין במשך 3 דקות. לשטוף את הריצה מי ברז.
  4. להבדיל על ידי טבילה 1 – 2 פעמים ב 0.3% חומצת אלכוהול (0.3% HCl ב 70% אתנול). לשטוף את הריצה מי ברז עבור 5 דקות.
  5. הוסף סוכן בלובינג עבור 30 s. לשטוף את הריצה מים הברז עבור 5 דקות. לטבול ב 95% אתנול עבור 30 s.
  6. מודטה עם אאוזין עבור 90 s בטמפרטורת החדר. הדמיים ב 3 שינויים של 100% אתנול עבור 5 דקות כל אחד.
  7. הטבול פעמיים ב 100% קסילן עבור 5 דקות כל אחד. הוסף את המדיה הDPX0 לשקופית והוסף שמיכות. תן לזה לרפא לילה לפני הדמיה.

8.1-([4-(xylyzo) "אזו" -2-נפתלי מכתים

  1. להכין 1-([4-(Xylyzo) מגרד] אזו -2-פתרון נפתלי.
    1. להוסיף 0.5 g של 1-([4-(Xylyzo) xylyl] אזו) -2-מאבקה לגביע עם 100 mL פרופילן גליקול. חום ל-95 – 100 ° צ' תוך כדי ערבוב לפחות 30 דקות. מניעת הטמפרטורה עולה על 100 ° c.
    2. להסיר את הגביע מהחום ולאפשר קריר מעט. שופכים פתרון דרך נייר כיתה 4 מסנן איכותי כדי להסיר את כל החלקיקים שיורית.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר ויש לסנן דרך מסנן מזרק 0.45 יקרומטר מיד לפני הצביעת.
  2. . כתם של חתכים קפואים
    1. הסרת שקופיות מ-80 ° c מקפיא ואוויר יבש עבור 30 דקות. לפני מגניב 10% NBF ב-20 ° c עבור 30 דקות בצנצנת Coplin. תקן את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. שטוף במים די 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד.
    2. להסיר את המים העודפים באמצעות ניגוב משימה עדינה לפני הפרופילן גליקול 2 פעמים עבור 5 דקות כל אחד. הסר שקופיות מפרופילן גליקול. אין לשטוף.
    3. מניחים שקופיות לתוך מזרק מסוננים שמן אדום כתמים הפתרון עבור 3 h בטמפרטורת החדר.
    4. להבדיל על ידי הצבת שקופיות ב 85% פרופילן גליקול עבור 5 דקות. לשטוף דגימות ב-PBS פעמיים עבור 5 דקות כל אחד.
    5. דגימות מכתמים עם המטאוקסילין. במשך 30 שנות לשטוף את הריצה מי ברז עבור 5 דקות ולאחר מכן למקם את השקופיות ב-DI מים.
    6. דוגמאות מטען באמצעות בינוני מימית מבוסס הרכבה ולאפשר מדיה יבש לילה לפני הדמיה.

9. ראולוגיה

  1. הביאו פתרונות קדם-ג'ל משלב 5.4 למטר הקרח.
  2. הצמדת זרוע וצלחת של 25 מ"מ למשטח הזכוכית. פתח את תוכנת ה-rheology במחשב המחובר לרטימטר.
  3. לבצע מיפוי הסיבוב ולקבוע את הפער אפס. . הרם את היד כשאתה מסיים
  4. פיפטה 500 μL של ג'ל מקדים על הצלחת. הנמך את היד עד שהפתרון שלפני ג'ל תופס לחלוטין את הפער בין הצלחת לבין הזרוע. שיהיה שמרני מכיוון שהורדת היד מעבר לנקודה זו תגרום לתמיסת מקדם ג'ל לשפוך מהצד.
  5. בצעו סריקת תדר על התמיסה שלפני ג'ל מ-0.1 – 100 Hz לאחר שנותרה ב-37 ° c למשך 30 דקות.
  6. הרימו את זרוע הרטימטר. כשאתם מושלמים נגב נוזל עם מחיקת משימה עדינה. לשטוף עם מים די לנגב עם מחיקה עדין משימה. חזור על שלבים 9.4 – 9.6 עם דוגמאות נוספות.

10. פאלודין המשלים כתמים של F-actin

  1. הביאו את הפתרון המשלים לטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בקצרה במהירות נמוכה לפני הפתיחה. מספיק לפתור את הבעיה ולאחסן את השאר ב-20 ° c.
  2. לדלל 1000x phalloidin מניות הפתרון המשלים לפתרון עבודה של 1x על ידי הוספת 1 μL פתרון מלאי 1 mL 1x PBS + 1% בסרום בפרה אלבומין (BSA). זה הופך מספיק עבור 10 בארות (100 μL/ובכן).
    הערה: ניתן להשתמש ברגיל 1x PBS, אבל 1x PBS + BSA הוא המועדף כדי למנוע המשלים phalloidin לדבוק השפופרת. אל תאחסן פתרון זה לאחר השיטת הפעולה. 1 μL של צבע פלורסנט כחול (לראות את הטבלה של חומרים) פתרון עובד ניתן להוסיף כתם עבור גרעינים. פתרון העבודה עשוי להתבצע על ידי ערבוב 1 μL של 20 מ"מ צבע פלורסנט כחול עם 11.3 μL 1x PBS.
  3. מנושף מדיה מבארות (שלב 6.1). לשטוף בארות עם 1x PBS.
  4. הוסף 10% NBF. בארות הדגירה עם 10% NBF עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. . הסר את הסופרנטאנט לרחוץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
  5. הוסף 0.1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol ב-PBS במשך 5 דקות. מטפי ורוחץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
  6. הוסף 100 μL של פתרון עבודה משלב 10.2 לכל באר. . מיכל החום בטמפרטורת החדר מטפי ורוחץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם. השאר בערוץ הPBS ב -4 ° c.
  7. מתיף ומסיר בארות מהאטם. בשקופית הקאמרית השתמש בפינצטה האף המחט כדי להסיר את האטם מהשקופית. הרכבה ודגימות שמיכות באמצעות מימית ההרכבה מבוסס בינוני. אפשר לרפא (5 דקות).
  8. להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ב עירור/פליטה של 590/618 ננומטר.

11. שיטת הכדאיות

  1. שטפו את התאים באמצעות ה-PBS של דולסקו (DPBS). הוסף 100 μL של DPBS המכיל 1 μM calcein AM ו 2 μM אתידיום הומודימר לכל טוב. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. תמונה של 16-היטב שקופית קאמרית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. הכלב הטוב ביותר (calcein AM) ניתן לצפות ב עירור/פליטה = 494/517 nm. אתידיום הומדימר ניתן לצפות ב עירור/פליטה = 528/645 ננומטר.
  3. לקרוא את הצלחת 96-באר על קורא צלחת באמצעות אותם אורכי גל בשלב 11.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MFPs היו decellularized בעקבות הקרנה באמצעות ההליך המוצג באיור 1A. MFPs pre-decellularization (איור 1B) ו-post-Decellularization (איור 1b) מוצגים. Decellularization אושרה באמצעות המטאוקסילין ו-אאוזין (H & E) כתמים, ו-1-([4-(Xylylazo) "אזו" -2-נפתלי מכתים שימש להערכת תוכן השומנים (איור 2). תכונות רטיולוגית של ההידרוג'ל ECM העריכו גם ב 37 ° צ' (איור 3). מודול האחסון היה גבוה יותר מאשר מודול ההפסד עבור כל התנאים, הוכחת היווצרות הידרוג'ל יציב.

GFP-ו-לוציפראז-מתויג בתאי סרטן החלב 4T1 שעברו אנקפסולציה בהידרוג. התפשטות התא נבדק על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, מדידות ביולומינסנציה, ואת הכדאיות מכתים 48 h לאחר כימוס (איור 4). הידרוג'לים שעברו קרינה הראו מגמה גוברת התפשטות תאים סרטניים. למעשה, שימש להמחיש את F-actin בתאים המכופף (איור 5). ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון את המבנה התאי ואת תכונות הציטולדים.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה ניסויית. (א) סכמטי היווצרות הידרוג'ל. תמונות מצלמה דיגיטלית צולמו של MFPs pre-(ב) ו post-decellularization (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אישור הdecellularization והדה-ליפציה ב-MFPs. המטאוקסילין ואאוזין הצביעת (H & E) של מניות mfps שלא הוקרן מוטבע פרפין ו מנות ב 5 יקרומטר (א) הושוו mfps קפוא בתוך הטבעה קריוstat בינונית (5 יקרומטר סעיפים) לפני (ב) ואחרי decellularization (ג), מודרת עם סוכרוז לפני הקפאת הטבעה קריוסטט בינוני ומנות ב 30 יקרומטר (ד). 1-([4-(xylyto) xylyl] אזו) -2-נפתנול כתמים נעשה כדי להמחיש שמירה ליפיד ב mfps קפוא במדיום הטבעה קריוסטט (5 מקטעים יקרומטר) לפני (E) ואחרי decellularization (F) ו-מודגנה עם סוכרוז לפני הקפאה ב הטבעה קריוstat בינונית ומנות בסעיפים 30 יקרומטר (G). סרגלי קנה מידה מייצגים 50 μm. Decell = decellularization. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אישור מערך הידרוג'ל. Rheology שימש כדי לקבוע את האחסון והפסד של המקור של שליטה (A) ו לקרינה (ב) הפתרון לפני ג'ל שנעשו מ Mfps ב 37 ° צ' ו 0.5% המתח. קווי שגיאה מציגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התפשטות תאי הגידול בהידרוג ECM לקרינה. הפצת תאים 4T1 48 h לאחר החיסון מוצג עם pre-ג'ל נגזר שליטה (A) ו לקרינה (ב) mfps. (ג) ביולומינסנציה אות מתאי 4t1 המוטבעים בתוך שליטה והידרולים שעברו קרינה. Calcein AM מוכתם תאים ומוכתם הומודידים תאים מתים ויטראז ' הוערכו בשליטה (ד) ו הידרו לקרינה (E), ואת היחס חי/מת היה לכמת (F). סרגלי קנה מידה מייצגים 200 μm. קווי שגיאה מציגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השלד מאפייני הציטוזה ב ECM הידרוג. תאים בתוך (א) שליטה ו (ב) לקרינה ecm הידרוג'ל מוכתם עם המשלים phalloidin כדי להמחיש F-actin (אדום) וצבען פלורסנט כחול כדי להמחיש גרעינים (כחול) ב mfps לקרינה. סרגל קנה מידה מייצג 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משקל רקמה (גר') פקד
(0 Gy)		 קרינה
(20 Gy)
משקל ראשוני MFP 0.461 0.457
משקל MFP לאחר הסרת דגימת היסטולוגיה 0.423 0.416
משקל MFP לאחר decellularization 0.025 0.025
משקל Decellularized MFP לאחר הסרת דגימת היסטולוגיה 0.015 0.016

טבלה 1: משקולות רקמה לפני ואחרי decellularization. משקולות רקמות מייצגים עבור כל תנאי נמדדו לפני ואחרי MFP decellularization.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה זו של יצירת הידרוג'ל תלויה במידה רבה בכמות של הרקמה ההתחלתית. מוריין MFPs הם קטנים, והתהליך הdecellularization מביא לירידה משמעותית בחומר (שולחן 1). התהליך יכול לחזור עם יותר MFPs כדי להגדיל את התשואה הסופית. כרסום הוא צעד חשוב נוסף שעלול לגרום לאובדן החומר. אחרים הראו הצלחה עם טחנת קריוגני, אבל פרוטוקול זה מבוסס על כרסום באמצעות מרגמה כף יד ומקדחה חשמלית עם אביזר מצורף8,17. הדבר מכיל את היתרון של עלויות הון נמוכות ומזעור אובדן חומרים, אך עשוי להציג את השונות במוצר הסופי.

אתגר לאישור הdecellularization והסרת הליפיזציה הוא הקפאת רקמת אדיפוז במדיום הטבעה קריוסטט. איור 2A מראה H & כתמים של mfp שלא ניתן לקרינה מוטבע ו מנות בפרפין. גרעינים שונים גלויים על קצות התאים של אדיפוז ליד צמתים עם תאים אחרים, ומורפולוגיה אדיפוציט מתוחזק היטב. איור 2B , C, E, F show mfps שהוכנו על ידי הטבעה והקפאה של mfps בתוך הטבעה בינונית הטמעה והקפאת 5 יקרומטר פרוסות. תהליך זה לא הצליח לשמור על מורפולוגיה וצורה של אדיפוטיט. עם זאת, decellularization אושרה באמצעות אובדן של גרעינים ועקבות אחרים של ה-DNA (איור 2C), ו דה ליפיזציה היה מדמיין עם אובדן של תוכן נייטרלי השומנים כתמים (איור 2c). אדיפוציטוטה מורפולוגיה נשמרה על ידי דגירה mfps ב סוכרוז, הטבעה והקפאה במדיום הטבעה קריוסטט, והפחתה 30 יקרומטר פרוסות (איור 2d, G).  בעוד ההדמיה של H & מכתים E היה קשה עם שיטה זו (איור 2D), 1-([4-(Xylylazo) ה-2-נפתלי) הכתים את ההחזקה של מורפולוגיה אדיפוציט (איור 2d).

פיתחנו מודל הידרוג'ל להפריה חוץ גופית שיכול לחקות את vivo מיקרוסביבה רגילה של רקמות והתגובה שלה לנזק קרינה. Ecm הידרוג'ל הפוברק במחקרים דומים, אבל ההשפעה של נזק הקרינה על התנהגות תא הגידול לא הוערך9,12,16,17,18. אנו מצפים כי הקרנה של mfps תשנה שיפוץ ecm וקומפוזיציה, ושינויים אלה הלחנה יהיו מאופיינים במחקרים עתידיים. הבחנו מגמה גוברת התפשטות של 4T1 תאים בתוך הידרוג ECM הוקרן באמצעות הדמיה ביולומינציה וכתמים הכדאיות (איור 4). בנוסף, השתמשנו phalloidin המשלים לכתם F-אקטין בתאי גידול כדורית ומצא גידול איכותני ביישור אקטין והתארכות תא הגידול בתוך הידרוג ecm הוקרן, אשר מציע עלייה חוזק הדבקה ו קיבולת פולשנית (איור 5)19,20. ניסויים בעתיד יהיה לחקור שינויים הדינמיקה המוקד ושיפוץ פרוטאז בתיווך להערכת הגירה תא ופלישה.

שיטה זו פותחה באמצעות קו טלפון מוראן TNBC, אך שיטה זו עשויה לשמש כפלטפורמה להערכת התפשטות ובקרה של סוגי תאים אחרים. מחקרים עתידיים עשויים לשלב תאים חיסוניים כדי לקבוע את תפקידם בתגובה קרינה, כמו גם צורות אחרות של נזק לרקמות (למשל, ניתוח). למרות מחקר זה העריך ECM הידרוג'לים מ-MFPs הקרינה ex vivo, מחקרים נוספים לחקור vivo הקרינה של MFPs להעריך את ההשפעה של תגובת קרינה פיזיולוגית וחדירה תאים חיסוניים על מאפייני ECM. הקמנו שיטה כדי ליצור הידרוג ECM מעכבר MFPs ללמוד את ההשפעה של קרינת רקמה נורמלית על התנהגות תא הגידול, טכניקה זו עשויה להיות מורחבת לרקמת האדם עבור מודל רלוונטי יותר הידרוג'ל. בסך הכל, בחינת נזק רקמות נורמלי דרך הידרוג ECM עלול להוביל תובנות לתוך התפקיד של שינויים ECM לאחר טיפול בקרינה בהישנות המקומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לד ר לאורה ל. ברוסארט על מתן התאים הגFP והלוציפריאז-4T1, ד ר אדוארד ל. לייורי לקבלת ייעוץ ב-1-([4-(Xylyzo) "אזו" -2-נפתלי כתמים, ד ר קרייג ל. דובאל עבור איביס וליטוליזר שימוש, וד ר סקוט א. גוכר לראומטר השתמש. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot VWR 16004-128 -
2-methylbutane Alfa Aesar 19387 -
AR 2000ex Rheometer TA Instruments 10D4335 rheometer
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A1933-25G -
calcein acetoxymethyl (calcein AM) Molecular Probes, Inc. C1430 -
D-Luciferin Firefly, potassium salt Biosynth Chemistry & Biology L-8820 (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
DPX Mountant for Histology Sigma-Aldrich 06522-500ML -
Dulbecco's phosphate-buffered saline Gibco 14040133 -
Eosin-Y with Phloxine Richard-Allan Scientific 71304 eosin
ethidium homodimer Molecular Probes, Inc. E1169 ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F0926-500ML -
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571 cryostat embedding medium
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 aqueous based mounting medium
FreeZone 4.5 Labconco 7751020 lyophilizer
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Scientific 62249 blue fluorescent dye
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML -
IVIS Lumina III PerkinElmer CLS136334 bioluminescence imaging system
Kimtech Science Kimwipes Kimberly Clark delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1130-500 -
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625-25G 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder OPS Diagnostics, LLC CG-08-02 -
PBS (10X), pH 7.4 Quality Biological, Inc. 119-069-151 Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 -
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma-Aldrich P6887-5G pepsin
Peracetic acid Sigma-Aldrich 77240-100ML -
Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) abcam ab176757 phalloidin conjugate
Propylene glycol Sigma-Aldrich W294004-1KG-K -
Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent Richard-Allan Scientific 7301L bluing agent
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 Richard-Allan Scientific 7211 -
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093 -
Sodium deoxycholate, 98% Frontier Scientific JK559522 deoxycholic acid
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 -
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-100ML t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200-056 -
Whatman qualitative filter paper, Grade 4 Whatman 1004-110 grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific X5-4 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
  4. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
  5. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  6. Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
  7. Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
  8. Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
  9. Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  12. Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
  13. Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  14. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  15. Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  16. Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
  17. Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
  18. Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
  19. Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
  20. Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 149 סרטן השד קרינה מטריצה מdecellularization הידרוג'לים
לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alves, S. M., Zhu, T., Shostak, A.,… More

Alves, S. M., Zhu, T., Shostak, A., Rossen, N. S., Rafat, M. Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels. J. Vis. Exp. (149), e59304, doi:10.3791/59304 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter