Summary
이 프로토콜은 생체 조사 후 뮤린 유방 지방 패드의 탈세포화 및 후속 하이드로겔 형성방법을 제시한다.
Abstract
방사선은 삼중 음성 유방암환자를 위한 치료법입니다. 건강한 유방 조직의 세포 외 매트릭스 (ECM)에 대한 방사선의 효과와 1 차종양 부위에서의 국소 재발에 대한 역할은 알려지지 않았습니다. 여기서 우리는 뮤린 유방 지방 패드에서 유래한 ECM 하이드로겔의 탈세포화, 투식, 제조방법을 제시한다. 결과는 탈세포화 과정의 효과에 제시되고, 유변학적 파라미터를 평가되었다. 하이드로겔에 캡슐화된 GFP- 및 루시퍼라제 표지 유방암 세포는 조사된 하이드로겔의 증식증가를 입증하였다. 마지막으로, 남근 컨쥬게이트 염색은 캡슐화된 종양 세포의 세포골격 조직을 시각화하기 위해 사용되었다. 우리의 목표는 종양 세포 행동을 연구하기 위하여 생체 내 유방 조직 환경 및 방사선에 그것의 반응을 모방하는 생체외 연구를 위한 하이드로겔을 제조하는 방법을 제시하는 것입니다.
Introduction
암은 세포사멸을 회피하고 또한 먼 부위로 전이할 수 있는 세포의 과잉 증식을 특징으로한다1. 유방암은 2018년에 추정된 266,000의 새로운 케이스 및 40,000의 죽음과 함께 미국에있는 여성 중 일반적인 양식의 한개입니다 2. 특히 공격적이고 치료하기 어려운 것은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 및 인간 표피 성장 인자(HER2)가 결여된 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 방사선 요법은 일반적으로 유방암에서 요추 절제술 다음 잔여 종양 세포를 제거하는 데 사용되지만, TNBC 환자의 13 %이상은 여전히 1 차적인 종양 부위3에서 재발을 경험합니다.
방사선 요법은 유방 절제술과 동일한 장기 생존을 초래하기 때문에 전이 및 재발을 완화하는 데 효과적인 것으로 알려져 있습니다4. 그러나, 방사선 치료는 면역 손상 설정5,6에서원발성 종양 부위에 국소 재발과 연관되어 있음을 최근에 나타났다. 또한, 방사선이 섬유증7을유도함으로써 정상 조직의 세포외 기질(ECM)을 변화시키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 종양 세포 거동을 지시하는 방사선 유도 ECM 변화의 역할을 이해하는 것이 중요하다.
세포화 된 조직은 질병을 연구하기 위해 시험관내 모델로 사용되어 왔다 8,9. 이들 탈세포화된 조직은 ECM 조성물을 보존하고 생체 내 복합체를 재보존한다. 이러한 탈세포화된 조직 ECM은 세포 성장 및기능(10,11)을연구하는데 사용될 수 있는 재구성된 ECM 하이드로겔을 형성하기 위해 추가로 처리 및 소화될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화된 인간 리포아스해적 및 심근 조직에서 유래한 주사용 하이드로겔은 비침습적 조직 공학의 방법으로 사용되었으며, 돼지 폐 조직에서 유래한 하이드로겔은 시험관내 시험법으로 활용되었다. 중간 엽 줄기 세포 부착 및 생존력12,13,14. ECM 속성에 정상적인 조직 방사선 손상의 효과, 그러나, 조사 되지 않았습니다.
ECM으로부터 유래된 하이드로겔은 생체내 현상의 시험관내 연구에 가장 큰 잠재력을 가지고 있다. 콜라겐, 피브린 및 마트리겔을 포함한 여러 가지 다른 물질이 연구되었지만, ECM13의조성물을 종합적으로 재구성하기는 어렵다. ECM 유래 하이드로겔을 사용하는 장점은 ECM이 특정 조직에 필요한 단백질 및 성장 인자를 함유한다는 점입니다(14,15). 요추 절제술 동안 정상 조직의 조사는 ECM에 중요한 변화를 일으키고, ECM 유래 하이드로겔은 시험관내에서 이 효과를 연구하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 질병의 더 복잡하고 정확한 시험관 내 모델로 이어질 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 유방 유방 지방 패드 (MFPs)를 방사선 엑보에 실시하였다. MFPs를 탈세포화하고 프리겔 용액으로 만들었습니다. 하이드로겔은 내장된 4T1 세포, 뮤린 TNBC 세포주로 형성되었다. 하이드로겔 물질의 유변학적 특성을 조사하고, 종양 세포 역학을 하이드로겔 내에서 평가하였다. 조사된 MF에서 제조된 하이드로겔은 종양 세포 증식을 강화시켰다. 미래 연구 결과는 치료 다음 암 재발의 맥락에서 세포 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 그밖 세포 모형을 통합할 것입니다.
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Protocol
동물 연구는 밴더빌트 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 기관 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. MFPs의 준비 및 생체 조사
- CO2 질식을 이용한 심질 Nu/Nu 마우스(8-10주)를 희생하고 자궁 경부 탈구를 수행하였다.
- 70% 에탄올을 사용하여 피부를 깨끗하게 합니다.
- 완전한 RPMI 매체를 포함하는 15 mL 원엽 관에 미리 살균된 가위와 집게를 사용하여 희생된 마우스에서 유방 지방 패드 (MF)를 수집하십시오 (RPMI는 1% 페니실린-스트렙토마이신및 10% 태아 소 혈청으로 보충됨) (재료표 참조) ).
- 세슘 공급원을 사용하여 20 Gy에 샘플을 조사합니다.
- 조사된 MF와 완전한 RPMI 미디어를 생체 안전 성 캐비닛에 넣습니다. 매체는 최종 하이드로겔에서 성장되는 세포주에 의존할 것이다. 6cm 또는 10cm 접시를 충분한 매체로 채우고 MF를 담그도록 하십시오. 6cm 접시의 경우 8 mL의 용지를 사용하고 10cm 접시에 20 mL의 용지를 사용하십시오.
- 37°C/5%CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양한다. 인큐베이터에서의 시간의 길이는 조정될 수 있다.
- 인산완충식염수(PBS)로 티슈를 헹구고, 과잉 수분을 제거하고, MF를 15 mL 원추형 튜브에 넣고 탈세포화전까지 보관하십시오. 이 동결 단계는 탈세포화 단계를 돕고 다음 단계가 그렇지 않으면 준비된 경우에도 샘플을 동결시켜야 합니다.
2. 탈세포화 (참조12,16,17에서적응)
참고: 이 절차는 DNA를 효율적으로 제거하기 위해 나트륨 도데실 황산염이 아닌 나트륨 데옥시콜레이트 이온 성 세제를 포함하는 지방 세포 탈세포화에 초점을 맞춘 이전에 출판 된 방법에서 적응되었다12,16 , 17.
- 1일째에는-80°C에서 냉동 MF를 제거하고 실온에서 해동합니다.
- 해동되면, 섬세한 작업 닦아에 잠시 건조 MF. 분석 척도를 사용하여 MF를 계량합니다.
- 가위 또는 메스가있는 집게 한 쌍을 사용하여, 그대로 ECM및 하이드로 겔 생산을위한 나머지 조직을 연구하기 위해 3mm x 3mm x 3mm 샘플로 조직을 분할합니다.
참고 : 샘플의 수는 두 개의 샘플의 수집이 아래에 설명되어 있습니다 예를 들어, 테스트 방법의 수에 따라 달라집니다 : 파라핀 포함 (단계 2.5)에 대한 하나와 원하는 경우 저온 포함 매체에 동결 하나 (재료의 표 참조) 및 단계 2.6). - 조직의 무게를 측정합니다. 단면화용 파라핀에 포함시키는 경우 2.5단계를 계속합니다. 단면에 대한 저온 포함 매체에 동결하는 경우, 단계를 계속 2.6.
- 화학적 후드에서, 조직을 4°C에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 침수시켰다(물질표 참조). PBS에서 3회 5분동안 세척합니다. 4 °C에서 48 시간 동안 30 % 자당으로 조직을 잠급하십시오.
- 이 조각이 제거되었으므로 조직의 무게를 측정하십시오. 2.6단계를 계속합니다.
- 화학 후드에 MFP 조각을 저온 극저온 포함 매체로 준비한 라벨이 붙은 카세트에 놓습니다. 조직을 덮기 위해 더 많은 저온 막힘 포함 매체를 추가하십시오.
- 카세트를 액체 질소로 미리 냉각시킨 2-메틸부탄(재료 표참조)의 비커에 넣습니다. 비커는 바닥을 커버하기에 충분한 2-메틸부탄이 있어야하지만 저온 막힘 포함 매체가 2 메틸 부탄을 만지지 않아야하기 때문에 카세트를 잠수하기에 충분하지 않습니다. 카세트가 2-메틸부탄에 놓이게 하여 저온 극저온 매질이 얼어 불투명해질 때까지 놓습니다.
- 카세트를 호일에 싸서 라벨을 붙인 후 단면화에 사용될 때까지 -80°C에서 둡니다.
참고: 저온 유지액 포함 배지에 즉시 배치된 조직은 5 μm에서 단면화되었고, 자당에서 배양된 조직은 30 μm에서 절편되어 지방세포 형태를 유지하였다.
- 집게를 사용하여 남은 조직을 수동으로 마사지하십시오.
참고: 티슈 조각은 또한 24-48시간 동안 10% NBF에 넣고, PBS에서 헹구고, 파라핀에 포함될 때까지 70% 에탄올에 남아 있습니다. 임베딩 후, 5 μm 섹션은 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색에 사용할 수 있습니다 (아래 섹션 7 참조). - 5 mL 0.02 % 트립신 / 0.05 % EDTA 용액으로 6cm 접시에 MF를 놓습니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하고 인큐베이터에 넣기 전에 70% 에탄올로 접시를 닦아냅니다.
- 0.7 mm 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 3회 부어 탈이온화(DI) 물로 MF를 세척합니다. 집게를 사용하여 세안 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오. 적절한 크기의 교반 바가 들어있는 사전 오토클레이브 비커에 티슈를 놓습니다. 3% t-옥틸록시폴리에티탄올 60 mL로 조직을 덮고(재료 표참조) 조직 1g당 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 최소 20mL를 사용하십시오.
- 조직과 내용물기를 스트레이너에 넣습니다. 비커를 DI 물로 헹구고 티슈에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 집게를 사용하여 헹군 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오. 티슈와 저어바를 같은 비커에 넣고, 조직 1g당 4% 데옥시콜산 60 mL로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어주세요. 최소 20mL를 사용하십시오.
- 조직과 내용물들을 메쉬 스트레이너에 넣습니다. 비커를 DI 물로 헹구고 티슈에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 집게를 사용하여 헹군 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오.
- 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 신선한 DI 물로 같은 비커에 티슈를 놓습니다. 파라핀 필름으로 단단히 덮습니다. 4°C에서 하룻밤 동안 둡니다.
- 다음 날 사용하기 위해 스트레이너와 비커를 씻으세요.
- 2일째에는 비커 내용물을 여과기에 넣습니다. 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오.
- 적절한 크기의 교반 막대가 있는 동일한 비커에 MF를 놓습니다. 조직 1g당 60 mL 4% 에탄올/0.1% 페라세트산 용액으로 덮습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 2시간 동안 저어주세요.
- 0.7 mm 스트레이너에 조직과 내용물 덤프. 집게를 사용하여 수동으로 조직을 마사지하십시오. 내용물 비커에 다시 넣습니다. 조직 1 g 당 1x PBS의 60 mL로 덮어서 조직을 씻으하십시오. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 간 저어주세요. 한 번 반복합니다.
- 0.7 mm 스트레이너에 조직과 내용물 덤프. 집게를 사용하여 수동으로 조직을 마사지하십시오. 내용물 다시 비커에 넣습니다. 조직 1 g 당 60 mL DI 물로 덮어서 조직을 씻으하십시오. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 간 저어주세요. 한 번 반복합니다.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오. 조직과 내용물기를 스트레이너에 넣습니다. 집게를 사용하여 수동으로 조직을 마사지하십시오.
- 내용물 다시 비커에 넣습니다. 조직 1 g 당 100 % n-프로판올 60 mL로 조직을 덮습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 1시간 동안 저어주세요.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오. 0.7 mm 스트레이너에 조직과 내용물 덤프. 집게를 사용하여 수동으로 조직을 마사지하십시오.
- 내용물 다시 비커에 넣습니다. 조직 1 g 당 60 mL의 DI 물로 덮어서 조직을 씻으하십시오. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 간 저어주세요. 세 번 반복합니다.
- 조직과 내용물기를 스트레이너에 넣습니다. 2.3-2.6 단계를 반복하여 자당 배양 및 저온 상승 포함 배지에서 동결을위한 조직 조각을 수집합니다.
- 섬세한 작업으로 티슈를 짧게 건조시키고 계량하십시오. 라벨이 부착된 15 mL 튜브에 놓습니다. 하룻밤 동안 -80 °C에서 동결.
3. 부호화
- -80°C에서 15 mL 튜브를 제거하고 드라이 아이스위에 놓습니다. 시료를 드라이 아이스에 동결된 후 동결약식에 보관하십시오.
- 캡을 제거합니다. 고무 밴드를 사용하여 섬세한 작업 와이프를 상단에 부착하여 개구부를 덮으하십시오. 적어도 2 일 동안 동약에 샘플을 넣습니다.
- 사용료에서 샘플을 제거하고 드라이 아이스에 튜브를 놓습니다. 각 시료의 무게를 분석된 스케일로 분리하는 섬세한 작업 와이프. 캡을 부착하고 하룻밤 동안 -80 °C에서 놓습니다.
4. 밀링
- 액체 질소로 얕은 용기를 채웁니다. -80°C 냉동고에서 샘플을 제거합니다. 각 동약 MFP의 무게.
- 하나의 샘플을 박격포에 놓습니다. 극저온 장갑을 사용하여 액체 질소에 박격포를 고정하십시오.
- 핸드헬드 드릴에 부착된 유봉을 사용하여 샘플을 밀링합니다. 진행 상황을 확인하고 액체 질소에서 장갑을 낀 손을 제거하기 위해 1 분 간격으로 밀링하십시오. 최소 5분 간 밀링합니다.
- 모든 샘플에 대해 반복합니다. 각 샘플 사이에 에탄올로 박격포와 유봉을 스프레이하고 닦으하십시오.
- 분말 시료를 15 mL 튜브에 -80°C에서 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오.
참고: 샘플은 즉시 사용하거나 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
5. 하이드로 겔 형성
- 하룻밤 동안 -80°C에서 보관한 경우, 실온에서 제거하고 해동한다. 해동하는 동안, 펩신의 필요한 무게를 계산 (재료의 표참조) 및 0.01 M HCl에서 1 % w / v 샘플 분말 및 0.1 % w / v 펩신을 초래하는 용액을 초래하는 각 샘플에 필요한 염산 (HCl)의 부피. HCl에 펩신을 추가하여 형성 펩신-HCl 용액.
- 샘플 분말과 펩신-HCl 용액을 15 mL 튜브에 추가합니다. 작은 저어주근바를 넣고 48시간 동안 저어줍니다.
- 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 1x PBS 농도가 있는 용액을 생성시키는 각 샘플에 필요한 10x PBS의 부피를 계산합니다. 각 튜브에 10x PBS의 적절한 부피를 추가합니다.
- 각 용액에 10% v/v 0.1 M NaOH를 추가하여 pH 7.4에 도달합니다. pH 용지를 사용하여 개별적으로 테스트하십시오.
참고: 겔 용액은 1주일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
6. 하이드로겔에 세포를 캡슐화
- GFP- 및 루시퍼라아제 라벨이 부착된 세포 사용
- pH 7.4 겔 용액을 사용하여 펠릿 GFP 및 루시퍼라제 라벨이 부착된 4T1 세포를 500,000 또는 1,000,000 세포/mL의 농도로 다시 일시 중단합니다. 16웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 16 μL의 젤 셀 용액을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 각 웰에 100 μL의 완전한 RPMI 미디어를 추가합니다. 37 °C에서 48 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오. GFP- 및 루시퍼라제 표지된 세포는 겔화 후 0시간, 24시간 및 48시간 동안 형광 현미경 검사법을 사용하여 시각화할 수 있습니다.
참고: 세포 증식은 (S)-4,5-디하이드로-2-(6-하이드록시-2-벤조티아졸리엘)-4-티아졸카르복실산 칼륨 염(재료표 참조)을 10분 동안 우물에 첨가하여 여기에 사용된 GFP- 및 루시퍼라아제 라벨이 붙은 4T1 세포에 대해 측정될 수 있습니다. 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 생물 발광 이미징을 수행합니다(재료 표참조). 생물 발광 이미징에 이어 세포 골격을 시각화 할 수 있습니다 (섹션 10 참조).
- 레이블이 지정되지 않은 셀 사용
- pH 7.4 겔 용액을 사용하여, 펠릿무표지된 4T1 세포를 겔 용액의 500,000 또는 1,000,000 세포/mL의 농도로 다시 중단시. 16웰 챔버 슬라이드와 96웰 플레이트의 각 웰에 16 μL의 겔 셀 용액을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 각 웰에 100 μL의 용지를 추가합니다. 37 °C에서 48 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오.
참고: 세포 생존가능성을 측정할 수 있습니다(섹션 11 참조). 16웰 챔버 슬라이드는 이미징에 사용할 수 있으며, 96웰 플레이트는 정량화에 사용할 수 있습니다.
7. H & E 염색
- 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직의 경우, 탈 파라핀화를 위해 100% 자일렌(5-10분)에 5 μm 섹션을 두 번 함유한 슬라이드를 잠급니다. 100%, 95%, 85%, 70%로 침수하여 5분 동안 각각 5분 간 DI 물을 침수하여 재수화합니다.
- 냉동 조직 섹션의 경우, 냉동고에서 즉시 섹션을 취하고 10 분 동안 10 % NBF에 담그십시오. 물로 5분 동안 헹구어 내보소서
- 흐르는 수돗물에 헤마톡슬린으로 핵을 3분 동안 헹구어 보릅니다.
- 0.3 % 산 성 알코올 (70 % 에탄올에서 0.3 % HCl)에 1 - 2 회 찍어 분화하십시오. 흐르는 수돗물로 5분 동안 헹구어 보시고 자릅니다.
- 흐르는 수돗물에 30초 동안 블러링 제를 넣고 5분 동안 헹구고, 30초 동안 95% 에탄올에 담급률을 넣습니다.
- 실온에서 90s동안 에오신으로 배양합니다. 각각 5분 동안 100% 에탄올의 3가지 변화로 탈수합니다.
- 100% 자일렌에 두 번 두 번 담그고 5분 동안 담급전합니다. 디스티렌-플라스틱-자일렌(DPX0 마운팅 미디어)을 슬라이드에 넣고 커버슬립을 추가합니다. 이미징 전에 하룻밤 동안 치료합시다.
8. 1-(4-(자일라조)자일릴 아조)-2-나프톨 염색
- 1-(4-(자일라조)자일릴]아조-2-나프톨 용액을 준비합니다.
- 1-(4-4-(실릴릴)아조 0.5 g을 넣고 100 mL 프로필렌 글리콜을 넣은 비커에 2-나프톨 파우더를 넣습니다. 95-100 °C로 가열하면서 30 분 이상 교반하십시오.
- 비커를 열에서 제거하고 약간 식힙니다. 4등급 정성적 필터 용지를 통해 용액을 부어 잔류 미립자를 제거합니다.
참고: 용액은 실온에서 보관할 수 있으며 염색 직전에 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과해야 합니다.
- 얼룩 냉동 조직 섹션.
- -80°C 냉동고에서 슬라이드를 제거하고 30분간 공기 건조. 코플린 병에 30분 동안 -20°C에서 10% NBF를 미리 식힌다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 고정합니다.
- 프로필렌 글리콜에 2회 5분 동안 담그기 전에 섬세한 작업 와이프를 사용하여 여분의 물을 제거합니다. 프로필렌 글리콜에서 슬라이드를 제거합니다. 헹위지 마십시오.
- 슬라이드를 실온에서 3시간 동안 주사기 여과된 오일 레드 O 염색 용액에 넣습니다.
- 85% 프로필렌 글리콜에 슬라이드를 5분 동안 넣음으로써 PBS에서 시료를 5분 동안 두 번 헹구십시오.
- 30초 동안 헤마톡실린으로 샘플을 얼룩지게 한 다음, 흐르는 수돗물로 5분 동안 씻은 다음 슬라이드를 DI 물에 놓습니다.
- 수성 기반 마운팅 매체를 사용하여 샘플을 장착하고 이미징 전에 용지가 밤새 건조되도록 하십시오.
9. 회병학
- 5.4단계에서 얼음의 레오미터까지 프리젤 용액을 준비합니다.
- 레오미터에 25mm 암과 플레이트를 부착합니다. 레오미터에 연결된 컴퓨터에서 레오로지오소프트웨어를 엽니다.
- 회전 매핑을 수행하고 0 간격을 결정합니다. 완료되면 팔을 들어 올립니다.
- 파이펫 500 μL 의 프리 젤 플레이트. 프리 겔 용액이 플레이트와 암 사이의 간격을 완전히 차지할 때까지 팔을 낮춥시다. 이 지점을 지나 팔을 낮추면 프리 젤 용액이 옆으로 흘러 나오므로 보수적이어야합니다.
- 30분 동안 37°C에 유지된 후 0.1-100Hz에서 프리겔 용액에 대한 주파수 스윕을 수행합니다.
- 완료되면 레오미터 팔을 들어 올립니다. 섬세한 작업 으로 액체를 닦으하십시오. DI 물로 헹구고 섬세한 작업 물티슈로 닦으소. 추가 샘플로 9.4-9.6 단계를 반복합니다.
10. F-액틴의 파할로이드 컨쥬게이트 염색
- 실온에 남근 공액을 가져오십시오. 개통 전에 저속으로 잠시 원심분리기. 분석에 대한 충분한 용액을 알리쿼트하고, 나머지는 -20°C에 저장한다.
- 1mL 1x PBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 1 μL 스톡 용액을 추가하여 1x 작업 용액에 1000x phalloidin 컨쥬게이트 스톡 용액을 희석시. 이것은 10 개의 우물 (100 μL / well)에 충분합니다.
참고 : 하나는 일반 1x PBS를 사용할 수 있지만, 1x PBS + BSA는 튜브에 달라 붙는 에서 팔로이드 컨쥬게이트를 방지하기 위해 바람직하다. 분석 결과 이 용액을 저장하지 마십시오. 1 μL의 청색 형광 염료(재료 표참조) 작동 용액은 핵용 얼룩에 첨가될 수 있다. 작업 용액은 11.3 μL 1x PBS와 20 mM 청색 형광 염료의 1 μL을 혼합하여 이루어질 수 있다. - 우물에서 미디어를 흡인 (단계 6.1). 1x PBS로 우물을 헹구고 있습니다.
- 10% NBF를 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 10 % NBF로 우물을 배양하십시오. 상급을 제거합니다. 매번 PBS로 3회 세척합니다.
- PBS에 0.1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol을 5 분 동안 추가하십시오.
- 10.2단계에서 각 우물에 100 μL의 작업 용액을 추가하십시오. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 매번 PBS로 3회 세척하고 5분동안 세척합니다. 4 °C에서 PBS에 둡니다.
- 챔버 슬라이드의 개스킷에서 우물을 흡인하고 제거합니다. 바늘 코 핀셋을 사용하여 슬라이드에서 개스킷을 제거합니다. 수성 기반 마운팅 매체를 사용하여 시료를 장착하고 커버합니다. (5 분) 치료할 수 있습니다.
- 590/618 nm의 여기/방출시 형광 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
11. 생존 분석
- 덜베코의 PBS (DPBS)로 세포를 헹구는다. 1 μM 칼세인 AM과 2 μM 에티듐 호모디머를 함유한 DPBS 100 μL을 각 우물에 첨가합니다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 형광 현미경검사법에 의해 16웰 챔버 슬라이드를 이미지화한다. 칼세인 아세톡시메틸 (칼세인 AM)은 여기 / 방출 = 494 / 517 nm에서 관찰 될 수있다. 에티듐 호모디머는 여기 /방출 = 528/645 nm에서 관찰 될 수있다.
- 11.2단계에서 동일한 파장을 사용하여 플레이트 리더에서 96웰 플레이트를 판독한다.
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Representative Results
MFPs는 도 1A에도시된 절차를 사용하여 조사 후 탈세포화되었다. MFPs 전 세포화(그림 1B)및 세포 후 탈세포화 (그림1C)가도시됩니다. 탈세포화는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 확인되었고, 1-[4-(자일릴라조)-아조]-2-나프톨 염색을 사용하여 지질 함량을 평가하는데 사용하였다(도 2). ECM 하이드로겔의 유변학적 특성도 37°C에서평가하였다(도 3). 저장 계수는 모든 조건에 대한 손실 계수보다 높았으며, 안정적인 하이드로겔 형성을 입증했다.
GFP- 및 루시퍼라제 표지된 4T1 유방 암종 세포를 하이드로겔에 캡슐화하였다. 세포 증식은 형광 현미경, 생물 발광 측정 및 캡슐화 후 48시간 염색에 의해 조사되었다(도 4). 조사된 하이드로겔은 종양 세포 증식에서 증가하는 추세를 보였다. 파할로이드 컨쥬게이트를 캡슐화된 세포에서 F-액틴을 시각화하는데 사용되었다(도 5). 이 기술은 세포 형태및 세포골격 특성을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 실험 워크플로우. (A) 하이드로겔 형성의 회로도. 디지털 카메라 이미지는 MFS 사전(B) 및 세포제거 후(C)로 촬영하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MFPs에서 탈세포화 및 탈지질의 확인. 파라핀에 내장된 비방산 MF의 헤마톡신 및 에오신 염색(H&E)을 5 μm(A)로 단면화하고 저온 살균 매질(5 μm 섹션)에서 동결된 MFPs와 비교하였다(B) 전과 탈세포화후(C), 저온 상승 배지에 동결하기 전에 자당으로 배양하고 30 μm(D)에서 단면화하였다. 1-(4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-나프톨 염색은 저온 유지에 동결된 MFPs의 지질 보유를 가시화하기 위해 수행되었다(5 μm 섹션) 전 (E) 및 탈세포화 후 (F) 및 동결 하기 전에 자당으로 배양 저온 막힘 포함 매체및 30 μm섹션에서 단면 (G). 축척 막대는 50 μm를 나타냅니다. 디셀 = 탈세포화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 하이드로겔 형성 확인. 유변학은 37°C 및 0.5%스트레인에서 MF로 만든 대조군(A) 및 조사(B) 프리겔 용액의 저장 및 손실 계수를 결정하는데 사용되었다. 오류 막대는 표준 편차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 조사된 ECM 하이드로겔에서종양 세포 증식. 4T1 세포 증식 48시간 접종 후 대조군(A)및 조사(B)MFPs. (C) 제어 및 조사된 하이드로겔 내에 내장된 4T1 세포로부터의 생발광 신호로부터 유래된 프리-겔로 나타났다. 칼세인 AM 스테인드 라이브 셀 및 에티듐 호모디머 염색 죽은세포를 대조군(D)에서 평가하고 조사(E) 하이드로겔을 조사하였고, 살아있는/죽은 비율을 정량화하였다(F). 축척 막대는 200 μm를 나타냅니다. 오류 막대에 표준 오류가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ECM 하이드로겔의 세포골격 특성. 세포 내(A) 대조군 및 (B) 조사된 ECM 하이드로겔은 F-액틴(적색) 및 청색 형광염료를 시각화하기 위해 파할로이드 컨쥬게이트로 염색되어 조사된 MPs에서 핵(청색)을 시각화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 티슈 웨이트(g) | 컨트롤 (0 Gy) |
조사 (20 Gy) |
| 초기 MFP 가중치 | 0.461 | 0.457 |
| 반역성 샘플 제거 후 MFP 중량 | 0.423 | 0.416 |
| 탈세포화 후 MFP 중량 | 0.025 | 0.025 |
| 조직학 샘플 제거 후 탈셀로화된 MFP 중량 | 0.015 | 0.016 |
표 1: 탈세포화 전후의 조직 분동. 각 조건에 대한 대표적인 조직 중량은 MFP 탈세포화 전후에 측정되었다.
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Discussion
하이드로 겔 형성의이 방법은 시작 조직의 양에 크게 의존한다. 뮤린 MPS는 작고, 탈세포화 공정은 물질의 현저한감소를 초래한다(표 1). 이 프로세스는 최종 수율을 높이기 위해 더 많은 MF로 반복될 수 있습니다. 밀링은 재료의 손실로 이어질 수있는 또 다른 중요한 단계입니다. 다른 사람들은 극저온 밀로 성공을 보였지만,이 프로토콜은 유봉 부착8,17이있는휴대용 모르타르 및 전기 드릴을 통한 밀링을 기반으로합니다. 이는 자본 비용을 낮추고 재료 손실을 최소화하는 장점이 있지만 최종 제품의 변동성을 유발할 수 있습니다.
탈세포화 및 탈지질의 확인에 대한 도전은 저온 막힘 포함 매체에 지방 조직을 동결에 있습니다. 도 2A는 파라핀에 내장되고 단면화된 비조사되지 않은 MFP의 H&E 염색을 나타낸다. 뚜렷한 핵은 다른 세포와의 접합 부근의 지방 세포의 가장자리에 볼 수 있으며 지방 세포 형태는 잘 유지됩니다. 그림 2B , C, E, F는 저온 삽입 매체에 MF를 포함하고 동결하고 5 μm 슬라이스를 단면화하여 제조 된 MFPs를 보여줍니다. 이 과정은 지방 세포 형태와 모양을 유지할 수 없었다. 그러나, 탈세포화는 핵및 DNA의 다른 흔적(도2C)의손실을 통해 확인되었고, 탈지질은 중성 지질 함량 염색의 손실로 가시화되었다(도2F). 지방세포 형태는 수크로오스에 MF를 배양하고, 저온 가트 임베딩 배지에 포함 및 동결하고, 30 μm 슬라이스를 단면화함으로써 유지되었다(도2D,G). H&E 염색의 가시화가 어려웠지만 이 방법(도2D),1-(4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-나프톨 염색은 지방세포 형태학의 보존을 확인하였다(도2G).
우리는 생체 내 정상 조직 미세 환경과 방사선 손상에 대한 반응을 모방 할 수있는 시험관 내 하이드로 겔 모델을 개발했습니다. ECM 하이드로겔은 유사한 연구에서 제조되었지만 종양 세포 행동에 대한 방사선 손상의영향은 9, 12,16,17,18로평가되지 않았다. 우리는 MF의 조사가 ECM 리모델링 및 구성을 바꿀 것으로 예상하고, 이러한 조성 변화는 향후 연구에서 특징이 될 것입니다. 우리는 생물 발광 이미징 및 생존 성 염색을 모두 사용하여 조사 된 ECM 하이드로 겔 내에서 4T1 세포의 증식증가 추세를 관찰했습니다(그림4). 또한, 캡슐화된 종양 세포에서 F-액틴 필라멘트를 염색하기 위해 파할로이드 컨쥬게이트를 사용했으며, 조사된 ECM 하이드로겔에서 액틴 정렬 및 종양 세포 신장의 질적 증가를 발견했으며, 이는 접착 강도의 증가를 시사하고 침략적용량 (그림 5)19,20. 향후 실험은 세포 이동 및 침입 평가를 위한 초점 접착 역학 및 프로테아제 매개 리모델링의 변화를 탐구할 것입니다.
이 방법은 뮤린 TNBC 세포주를 사용하여 개발되었지만, 이 방법은 다른 세포 유형의 증식 및 침습성을 평가하기 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 향후 연구는 방사선뿐만 아니라 조직 손상의 다른 형태 (예를 들어, 수술)에 대한 응답에서 자신의 역할을 결정하기 위해 면역 세포를 통합 할 수있다. 이 연구는 MFPs에서 ECM 하이드로겔을 조사한 생체 내 생체 내 를 평가했지만, 추가 연구는 생리적 방사선 반응의 효과를 평가하고 ECM 특성에 면역 세포에 침투하는 것을 연구할 것입니다. 우리는 종양 세포 행동에 대한 정상 조직 방사선의 효과를 연구하기 위해 마우스 MF에서 ECM 하이드로겔을 제조하는 방법을 확립했으며, 이 기술은 보다 관련성이 있는 하이드로겔 모델을 위해 인간 조직으로 확장될 수 있다. 전반적으로, ECM 하이드로겔을 통해 일반적인 조직 손상을 검토하는 것은 현지 재발에 있는 방사선 요법 다음 ECM 변경의 역할에 통찰력으로 이끌어 낼 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 GFP- 및 루시퍼라제-4T1 세포를 제공한 로라 L. 브론사트 박사에게 감사드리며, 에드워드 L. 라고리 박사는 1-(4-(실릴라조)-아조(2-naphthol 염색) -2-나프톨 염색, IVIS 및 라이오필러 사용에 대한 크레이그 L. 듀발 박사, 그리고 박사 에 대한 조언을 구해주었습니다. 사용. 이 연구는 NIH 교부금 #R00CA201304 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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