Summary
Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.
Abstract
Radyasyon Üçlü negatif meme kanseri olan hastalar için bir terapidir. Radyasyon, sağlıklı meme dokusu ve primer tümör bölgesinde lokal nüks rolündeki rol dışı matris (ECM) üzerinde etkisi bilinmiyor. Burada, duvar meme yağlı pedlerden elde edilen ECM hidrojellerin deselülarizasyon, lyophilization ve imalatı için bir yöntem sunuyoruz. Bulgular deselülarizasyon sürecinin etkinliğinde sunulmuştur ve reolojik parametreler değerlendirildi. GFP-ve luciferase-etiketli meme kanseri hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiş hidrojellerin proliferasyon bir artış göstermiştir. Son olarak, phalloidin Konjugat boyama kapsüllenmiş tümör hücrelerinin siterit organizasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hedefimiz, tümör hücresi davranışlarını incelemek için in vivo meme dokusu ortamını ve radyasyona olan tepkisini taklit eden in vitro çalışma için Hidrojeller üretebilmek için bir yöntem sunmadır.
Introduction
Kanser apoptozis kaçınmak ve aynı zamanda uzak sitelere metastaz hücrelerin aşırı proliferasyon ile karakterize1. Meme kanseri ABD 'de kadınlar arasında en yaygın formlardan biridir, tahmini 266.000 yeni vaka ve 40.000 ölüm ile 20182. Özellikle agresif ve alt türü tedavi etmek zor üçlü negatif meme kanseri olduğunu (TNBC), hangi östrojen reseptörü yoksun (ER), progesteron reseptör (PR), ve insan epidermal büyüme faktörü (HER2). Radyasyon terapisi, lumpektomi sonrasında kalan tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için meme kanserinde yaygın olarak kullanılır, ancak TNBC hastalarının% 13 ' ünden fazlası primer tümör bölgesinde nüks deneyimi yaşıyor3.
Lumpektomi ve radyasyon kombinasyonu mastektomi olarak aynı uzun vadeli hayatta kalma nedeniyle radyasyon tedavisinin metastaz ve nüks azaltıcı etkili olduğu bilinmektedir4. Bununla birlikte, son zamanlarda radyasyon tedavisinin, immünoterapi sağlayan ayarlarda primer tümör sitesine yerel nüks ile ilişkili olduğu gösterildi5,6. Ayrıca, radyasyon fibrozis inducing tarafından normal doku (ECM) ekstrasellüler matris değiştirir bilinmektedir7. Bu nedenle, tümör hücresi davranışlarını dikte ederek radyasyona bağlı ECM değişikliklerinin rolünü anlamak önemlidir.
Deselülarize dokularda hastalık8,9çalışma in vitro modelleri olarak kullanılmıştır. Bu deselülarized dokular ECM bileşimi korumak ve Complex in vivo ECM reapitulate. Bu deselülarize edilen doku ECM 'si, hücre büyümesini ve fonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek yeniden oluşturulmuş ECM Hidrojeller oluşturmak için daha fazla işlenmiş ve sindirilebilir10,11. Örneğin, deselülarized insan lipoaspirate ve miyokard dokusundan elde edilen enjekte edilebilir hidrogeller, non-invaziv doku mühendisliği yöntemleri olarak hizmet vermiştir ve bir in vitro test yöntemi olarak domuz akciğer dokusundan elde edilen bir hidrojel kullanılmıştır mezenkimal kök hücre ataşmanı ve canlılığı12,13,14. Ancak, normal doku radyasyon hasarının ECM özelliklerine etkisi araştırılmamıştır.
ECM 'den elde edilen Hidrojeller, in vivo fenomenlerin in vitro çalışması için en büyük potansiyele sahiptir. Kollajen, fibrin ve matrigel de dahil olmak üzere birçok başka malzeme incelenmiştir, ancak ECM13' ün bileşimi için sentetik olarak reapitleştirmek zordur. ECM 'nin türevi hidrojellerin kullanmanın bir avantajı ECM 'nin belirli bir doku için gerekli proteinleri ve büyüme faktörlerini içerdiğinden14,15. Lumpektomi sırasında normal dokuların ışınlanması ECM 'de önemli değişikliklere neden olur ve ECM-türevi Hidrojeller bu etkiyi içinde vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hastalığın daha karmaşık ve daha doğru in vitro modellerinde yol açabilir.
Bu çalışmada, duvar meme yağ yastıkları (MFP) radyasyon ex vivo maruz. MFP 'ler deselülarize edilmiş ve ön jel çözeltisi halinde yapılmıştır. Hydrogels Embedded 4T1 hücreler, bir murine TNBC hücre hattı ile kuruldu. Hidrojel materyalinin reolojik özellikleri incelenmiştir ve tümör hücre dinamikleri Hidrojeller içinde değerlendirildi. Radyasyon radyal MFPs gelişmiş tümör hücre proliferasyon imal. Gelecekteki çalışmalar, tedavi sonrasında Kanser nüks bağlamında hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için diğer hücre türlerini dahil edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. MFP 'lerin hazırlanması ve ex vivo ışınlama
- Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8 – 10 hafta) kurban servikal dislocation tarafından takip.
- 70% etanol kullanarak cildi temizleyin.
- Tam rpmi medya içeren 15 ml konik tüp önceden sterilize makas ve forseps kullanarak feda fareler meme Yağ pedleri (MFP) toplamak (rpmi 1% penisilin-streptomisin ve% 10 fetal Sığır serum ile tamamlayıcı) ( malzeme tablosuna bakın ).
- Bir sezyum kaynağı kullanarak 20 GY 'ye radyasyon örnekleri.
- Radyasyona neden olan MFP 'leri ve tam RPMı medyasını Biyogüvenlik kabinine getirin. Medya son hidrojel yetişecek hücre hattına bağımlı olacaktır. MFP 'leri alt etmek için yeterli medyaya sahip 6 cm veya 10 cm 'lik yemekleri doldurun. 6 cm 'lik yemekler için 8 mL medya kullanın ve 10 cm 'lik yemekler için 20 mL medya kullanın.
- İki gün boyunca 37 °C/5% CO2 kuluçko içinde inkübe. Kuluçte zaman uzunluğu ayarlanabilir.
- Fosfat-tamponlu tuz (PBS), leke aşırı nem ve yer MFP 'leri 15 ml konik tüplere muhafaza ederek-80 °c ' de deselülarizasyon kadar durulayın. Bu donma adımı deselülarizasyon adımını yardımcı olur ve sonraki adımlar Aksi halde hazır olsa bile örnek dondurulmuş olmalıdır.
2. deselülarizasyon (referanslara göre uyarlanmış12,16,17)
Not: Bu prosedür, sodyum Dodesil sülfatın yerine sodyum deoksikolatın iyonik deterjan dahil yağ deselülarizasyon üzerinde odaklanan daha önce yayımlanan yöntemlerden adapte edildi DNA 'yı verimli bir şekilde kaldırmak için12,16 , 17 yaşında.
- 1. gün, dondurulmuş MFP 'leri-80 °c ' den çıkarın ve oda sıcaklığında çözüyor.
- Bir kez çözülür, hassas bir görev silme üzerinde kısaca kuru MFP 'ler. MFP 'leri analitik bir ölçek kullanarak tartın.
- Makas veya neşter ile bir çift forseps kullanarak, bozulmamış ECM ve hidrojel üretimi için kalan doku çalışması için 3 mm x 3 mm x 3 mm örneklere bölme doku.
Not: örnek sayısı, test yöntemlerinin sayısına bağlıdır, örneğin iki numune koleksiyonu aşağıda açıklanmıştır: biri parafin katıştırma (adım 2,5) ve bir tane kriyostat gömme ortamında donma için, istenirse ( malzeme tablosuna bakın ve adım 2,6). - Dokuları tartın. Bölümleme için parafin katıştırmak, adım 2,5 devam edin. Kesme için kriyostat gömme orta donma, adım 2,6 devam edin.
- Kimyasal bir kaput olarak,% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içinde dokuyu ( malzeme tablosunabakın) 4 °c ' de 24 saat içinde taşın. 5 dakika boyunca PBS 'de 3 kez yıkayın. 4 °C ' de 48 h için% 30 sakaroz içinde dokusu taşın.
- Bu parça kaldırıldı şimdi doku tartmak. 2,6 adıma geçin.
- Kimyasal bir kaput içinde, MFP parçalarını kriyostat gömme ortamıyla hazırlanmış etiketli bir kasete yerleştirin. Doku kapsayacak şekilde daha kriyostat gömme orta ekleyin.
- Kaset 2-metilbutan bir kabı içine yerleştirin ( malzeme tablosunabakın) Bu sıvı nitrojen ile önceden soğutulur. Kabı yeterli olmalıdır 2-metilbutan alt kapsayacak şekilde ancak kriyostat gömme Orta 2-methylbutane dokunmamalıdır çünkü kaseti gömmek için yeterli değil. Kriyostat gömme orta donuyor ve opak hale gelene kadar Kaset 2-methylbutane oturmak edelim.
- Kaset (lar) ı folyo, etikete sarın ve kesme için kullanılıncaya kadar-80 °C ' ye bırakın.
Not: kriyostat gömme ortamına hemen yerleştirilen dokularda 5 μm ' de kesitli, sakaroz içinde inküklenmiş dokularda adipoksit morfolojisi korumak için 30 μm ' de kesilmiştir.
- El kalan doku masaj için forseps kullanın.
Not: doku parçaları da% 10 NBF içinde 24 – 48 h, PBS durulanır ve 70% etanol içinde parafin gömme kadar sol yerleştirilir. Gömme işleminden sonra, 5 μm bölüm hematoksinlin ve eozin (H & E) boyama için kullanılabilir (aşağıdaki bölüm 7 ' ye bakın). - MFPs 'yi 5 mL 0,02% tripsin/% 0.05 EDTA çözeltisi ile 6 cm 'lik yemeklerle yerleştirin. 37 °C ' de 1 saat boyunca kuluçk. inküyörün içine yerleştirmeden önce% 70 etanol ile yemekleri sprey ve silin.
- 0,7 mm süzgeci kullanarak MFP 'leri deiyonize (dı) su ile yıkayarak doku üzerinde üç kez su dökerek kullanın. El yıkanıyor arasında doku masaj için forseps kullanın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Uygun boyutta bir karıştırın bar içeren bir pre-otoklav kabı içinde doku yerleştirin. 60 mL ile kapak dokular 3% t-octylphenoxypolithoxyethanol (bkz. malzeme tablosu) başına 1 g doku ve karıştırın 1 saat oda sıcaklığında. En az 20 mL kullanın.
- Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. DI su ile kabı durulayın ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarlayın. El ile durulama arasında doku masaj için forseps kullanın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Dokulara yerleştirin ve aynı Beakers geri çubuklar karıştırın, ve 60 ml ile kapak 4% desoksikolik asit 1 g doku başına. Oda sıcaklığında 1 h için karıştırın. En az 20 mL kullanın.
- Doku ve içeriği bir kafes süzgecine döküyor. Ma suyu ile yıkama kabı ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarlayın. El ile durulama arasında doku masaj için forseps kullanın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın.
- % 1 penisilin-streptomisin ile tamamlayıcı taze dı su ile aynı kabı içinde doku yerleştirin. Parafin filmi ile sıkıca Kapla. Gece 4 °C ' de bırakın.
- Ertesi gün kullanım için yıkama süzgeçleri ve pancar.
- 2. gün, bir süzgeç içine drenaj kabı içeriği. Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın.
- Uygun boyutta bir karıştırın Bar ile aynı kabı içinde MFP 'ler yerleştirin. 60 mL 4% etanol/1 g doku başına% 0.1 Perasetik asit çözeltisi ile kapak. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca karıştırın.
- 0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın. İçeriği geri beçine yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL 1x PBS ile kaplayan dokusu ile yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez daha tekrarlayın.
- 0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın. İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 gr doku başına 60 mL dı su ile kaplayan dokusu yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez daha tekrarlayın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. Manuel doku masaj için forseps kullanın.
- İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL 100% n-propanol ile kapak dokular. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 1 h için karıştırın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. 0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın.
- İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL dı su ile kaplayan dokusu yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Üç kez tekrarlayın.
- Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. Kriyostat gömme ortamında sukrose inkübasyon ve donma için doku parçalarını toplamak için 2.3 – 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Etiketli 15 mL 'Lik bir tüp yerleştirin. Gece-80 °C ' de dondur.
3. lyophilization
- 15 mL tüpü-80 °C ' den çıkarın ve Kuru buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri lyophilizer 'a kadar kuru buzda dondurulmuş tutun.
- Kapakları çıkarın. Hassas bir görev açmak için üst silmek eklemek için bir kauçuk bant kullanın. En az 2 gün boyunca kurutucu örnekleri koyun.
- Kurutucu ve yer tüpleri kuru buzdan örnekleri çıkarın. Hassas görev mendilleri, her numuneyi analitik ölçekte tartın. Bir gecede-80 °C ' de kapaklar ve yer takın.
4. freze
- Sığ bir kabı sıvı azot ile doldurun. -80 °C dondurucudan numuneleri çıkarın. Her likofilized MFP 'yi tartın.
- Harç bir örnek yerleştirin. Sıvı nitrojen harç tutmak için bir kriyojenik eldiven kullanın.
- Örnek değirmen için bir el matkap bağlı bir havaneli kullanın. Mill 1 dk aralıklarla ilerleme kontrol etmek ve sıvı nitrojen el eldiven çıkarın. En az 5 dakika değirmen.
- Tüm örnekler için tekrarlayın. Sprey ve her örnek arasında etanol ile harç ve havaneli silin.
- Toz örneklerini 15 mL tüpte-80 °C ' de kullanıma hazır olana kadar saklayın.
Not: örnekler hemen kullanılabilir ya da bir gecede depolanabilir.
5. hidrojel oluşumu
- Bir gecede-80 °C ' de depolanırsa, oda sıcaklığında çıkarın ve çözüyor. Çözme sırasında, pepsin gerekli ağırlığı hesaplamak ( malzeme tablosunabakın) ve hidroklorik asit hacmi (HCL) her örnek için gerekli olan bir çözüm sonuçları 1% w/v örnek toz ve 0,1% w/v pepsin Içinde 0,01 M HCL. form için HCL pepsin ekleyin bir pepsin-HCl çözümü.
- 15 mL tüpüne örnek toz ve pepsin-HCl çözeltisi ekleyin. Küçük bir karıştırın Bar ekleyin ve 48 h için karıştırın.
- Tüpleri 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 1x PBS konsantrasyonu ile bir çözüme neden olan her örnek için gerekli 10X PBS 'nin gerekli hacmini hesaplayın. Her tüp için 10X PBS uygun hacmi ekleyin.
- Eklemek 10% v/v 0,1 M NaOH her çözüm pH 7,4 ulaşmak için. Bireysel test etmek için bir pH kağıt kullanın.
Not: jel çözeltisi bir hafta boyunca 4 °C ' de depolanabilir.
6. Hidrojeller hücreleri Kapsüller
- GFP-ve luciferase etiketli hücreleri kullanma
- PH 7,4 jel çözeltisi kullanarak, pelletini pelleted Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri 500.000 veya 1.000.000 hücre/ml jel çözeltisi konsantrasyonuna etiketli. 16 kuyu odası kaydırağı her bir kuyu için 16 μL jel hücreli çözelti ekleyin. 37 °C ' de 30 dak.
- Her kuyu için tam RPMı medya 100 μL ekleyin. 37 °C ' de 48 h için inkübasyon devam eder. GFP-ve luciferase etiketli hücreler, floresan mikroskobu ile 0 saat, 24 saat, 48 saat ve jelleşme sonrasında görselleştirilebilir.
Not: hücre proliferasyonu GFP-ve luciferase etiketli 4T1 hücreleri için burada (S)-4 ekleyerek kullanılan ölçülebilir 5-dihydro-2-(6-hidroksi-2-benzothiazolyl) 10 dk için kuyulara (bkz ve Bioluminesans görüntüleme sistemi kullanarak biyolüminesans görüntüleme (bkz. malzeme tablosu). Biyolüminesans görüntüleme sonrasında, sitozit görselleştirilebilir (bkz. Bölüm 10).
- Etiketli olmayan hücreleri kullanma
- PH 7,4 jel çözeltisi kullanılarak pelletini, 500.000 veya 1.000.000 hücreli/ml jel çözeltisi konsantrasyonuna etiketlenmemiş 4t1 hücrelerini Solunar. 16 kuyu odası kaydırağı ve 96-kuyu plakasının her bir kuyusu için 16 μL jel hücreli çözelti ekleyin. 37 °C ' de 30 dak.
- Her kuyu için 100 μL medya ekleyin. 37 °C ' de 48 h için inkübasyon devam eder.
Not: hücre canlılığı ölçülebilir (bkz. Bölüm 11). 16-kuyu odası slayt görüntüleme için kullanılabilir, ve 96-Well plaka Ölçüleme için kullanılabilir.
7. H & E boyama
- Formalin-sabit, parafin-gömülü doku için, iki kez 100% Ksilin (5 – 10 dk) de-parihfinization için 5 μm bölümleri içeren kayılan slaytlar. % 100,% 95,% 85 ve% 70 etanol ile 5 dakika boyunca her biri, 5 dakika boyunca dı suyu tarafından takip edilmesiyle rehidrat. 7,6 adıma devam edin.
- Dondurulmuş doku bölümleri için, dondurucudan hemen bölümler alın ve 10 dakika boyunca 10% NBF 'de onları yıkın. 1x PBS 'de 5 dakika her biri için üç kez yıkayın. Suda 5 dakika durulayın.
- 3 dakika boyunca hematoksilen ile leke çekirdekleri. musluk suyunun çalışmasını durulayın.
- % 0,3 asit alkol (% 0,3 HCl% 70 etanol içinde) 1 – 2 kez daldırma ayırt. 5 dakika boyunca musluk suyunun çalışmasını durulayın.
- 30 s için ağartama maddeler Agent ekleyin. 5 dakika boyunca musluk suyunda durulayın. 30 s için 95% etanol içinde alt birleştirme.
- Oda sıcaklığında 90 s için eozin ile inkübe. 5 dk her biri için% 100 etanol 3 değişiklik içinde dehydrate.
- Her biri için 5 dk% 100 Ksilin iki kez Submerge. Distyrene-plasticiser-Xylene (DPX0 montaj ortamını slayda ekleyin ve bir coverslip ekleyin. Görüntüleme önce bir gecede tedavi edelim.
8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama
- Hazırlamak 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol çözüm.
- 100 ml propilen glikol ile bir kabı için 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol tozu 0,5 g ekleyin. 95 – 100 °C ' ye kadar ısınarak en az 30 dk. sıcaklığın 100 °C ' yi aşmasını engelleyin.
- Sıcaktan kabı çıkarın ve biraz soğumaya izin verin. Herhangi bir kalıntı parçacıklarını kaldırmak için Grade 4 nitel filtre kağıdı ile eriyik dökün.
Not: çözelti oda sıcaklığında depolanabilir ve boya yapmadan hemen önce 0,45 μm şırınga filtresinde filtrelenmelidir.
- Leke dondurulmuş doku bölümleri.
- -80 °C ' den gelen slaytları çıkarın 30 dakika boyunca dondurucu ve hava kuru.% 10 NBF-20 °C ' de bir Coplin kavanozunda 30 dakika boyunca soğutun. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar düzeltin. her biri 5 dakika boyunca 3 kez dı suyunda yıkayın.
- Propilen glikol 2 kez 5 dakika boyunca daldırmadan önce hassas bir görev silme kullanarak aşırı su çıkarın. Propilen glikol gelen slaytlar çıkarın. Durulayın.
- Oda sıcaklığında 3 saat için şırınga filtreli yağlı kırmızı O boyama çözeltisi içine slaytlar yerleştirin.
- % 85 propilen glikol içinde 5 dakika boyunca slaytlar yerleştirerek ayırt. PBS 'deki örnekleri 5 dakika boyunca iki kez durulayın.
- 30 s için hematoksilen ile leke örnekleri. 5 dakika boyunca musluk suyu çalışan yıkayın ve sonra dı su slaytlar yerleştirin.
- Sulu bazlı montaj ortamını kullanarak örnekleri monte edin ve medyanın görüntüleme öncesinde bir gecede kurumasına izin verin.
9. Reoloji
- Adım 5,4 ön jel çözümlerini buzun üzerindeki Reometre 'a getirin.
- Reometreye 25 mm 'lik bir kol ve plaka takın. Rheometre bağlı bilgisayarda Reoloji yazılımı açın.
- Rotasyonel eşleme gerçekleştirin ve sıfır boşluğu belirleyin. Tamamlandığında kolu kaldırın.
- Pipet 500 plaka üzerinde ön jel μL. Ön jel solüsyonu tamamen plaka ve kol arasındaki boşluğu kaplar kadar aşağı kolu. Bu noktadan geçmiş kolu düşürerek ön jel çözeltisi yan dışarı dökülmesine neden olacaktır çünkü muhafazakar olun.
- 37 °C ' de 30 dakika boyunca kaldıktan sonra 0.1 – 100 Hz ön jel çözeltisi üzerinde Frekans taraması gerçekleştirin.
- Tamamlandığında Reometre kolunu yükseltin. Hassas bir görev silme ile sıvı silin. Dı su ile durulayın ve hassas bir görev silme ile silin. 9.4-9.6 arasındaki adımları ek örneklerle yineleyin.
10. F-actin phalloidin Konjugat boyama
- Phalloidin Konjugat çözümünü oda sıcaklığına getirin. Açılmadan önce düşük hızda kısaca santrifüjün. Test için yeterli çözüm aliquot ve dinlenme at-20 °C saklayın.
- 1 ml 1x PBS + 1% sığır serum albümin (BSA) 1 μL stok çözüm ekleyerek 1x çalışma çözümü için seyreltmeli 1000x phalloidin Konjugat stok çözüm. Bu 10 kuyu (100 μL/iyi) için yeterli yapar.
Not: bir düz 1x PBS kullanabilirsiniz, ancak 1x PBS + BSA tüp yapışmasını phalloidin Konjugat önlemek için tercih edilir. Tahlil işleminden sonra bu çözümü saklamayın. 1 μL mavi floresan boya (bkz. malzeme tablosu) çalışma çözeltisi çekirdekler için leke eklenebilir. 1 μL 20 mM mavi floresan boya ile 11,3 μL 1x PBS karıştırılarak çalışma çözeltisi yapılabilir. - Kuyudan medya aspirate (adım 6,1). 1x PBS ile durulayın kuyuları.
- % 10 NBF ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 10 NBF ile kuyuları kulyın. Supernatant kaldırın. Her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- PBS 'de 5 dk. Aspirate için 0,1% t-octylphenoxypolithoxyethanol ekleyin ve her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- Ekle 100 μL adım 10,2 her iyi çalışma çözümü. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın. Her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez aspirate ve yıkayın. 4 °C ' de PBS 'de bırakın.
- Oda kaydırağı üzerindeki conta üzerindeki kuyuları aspirate ve çıkarın. İğne burun cımbız kullanın sürgülü conta kaldırmak için. Sulu bazlı montaj ortamını kullanarak Mount ve lamel magazini örnekleri. Tedavi için izin (5 dk).
- 590/618 nm 'nin uyarılması/emisyonunda Floresan Mikroskobu altındaki hücrelere uyun.
11. viability tahlil
- Hücreleri Dulbecco 'nun PBS 'iyle (DPBS) durulayın. Her bir kuyu için 1 μm kalcein ve 2 μm etidyum homodimer içeren dpbs 100 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- Floresan Mikroskobu ile 16-kuyu odası slaytı görüntü. Calcein acetoxymetyl (calcein AM) uyarma/emisyon = 494/517 nm görülebilir. Etidium homodimer, uyarma/emisyon = 528/645 nm 'de görülebilir.
- 11,2 adımda aynı dalga boylarını kullanarak bir plaka okuyucuda 96-Well plakasını okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFP 'ler Şekil 1a'da gösterilen prosedürü kullanarak ışınlama sonrasında deselülarize edildi. MFPs öncesi deselülarizasyon (Şekil 1B) ve sonrası Deselülarizasyon (Şekil 1C) gösterilir. Deselülarizasyon hematoksislin ve eozin (H & E) boyama kullanılarak onaylandı ve 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama lipid içeriğini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 2). ECM hidrojellerin reolojik özellikleri de 37 °C ' de değerlendirildi (Şekil 3). Depolama modülü, istikrarlı hidrojel oluşumu gösteren tüm koşullar için kayıp modülden daha yüksektir.
GFP-ve luciferase-etiketli 4T1 meme karsinomu hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiştir. Hücre proliferasyonu floresans mikroskopisi, Bioluminesans ölçümleri ve kapsülleme sonrası 48 h (Şekil 4) tarafından incelenmiştir. Radyasyon bazlı Hidrojeller, tümör hücrelerinin proliferasyonu konusunda artan bir eğilim göstermiştir. Phalloidin Konjugat kapsüllü hücrelerde F-aksini görselleştirmek için kullanılmıştır (Şekil 5). Bu teknik, hücre morfolojisi ve sitofat özelliklerini incelemek için kullanılabilir.
Şekil 1: deneysel iş akışı. (A) hydrojel oluşumu şematik. Dijital kamera görüntüleri MFP 'ler öncesi (B) ve sonrası deselülarizasyon (C) alınmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: MFP 'lerde deselülarizasyon ve de-lipidasyonun onaylanması. Parafin içinde gömülü olan ve 5 μm (A) ' da bölen ışınlanmamış MFP 'lerin hematoksinli ve eozin boyama (H & E), (B) önce ve deselülarizasyon (C) sonrası kriyostat gömme ortamında (5 μm bölüm) dondurulmuş MFP 'lere kıyasla, kriyostat gömme ortamında dondurulmadan önce sukroz ile inküklenmiş ve 30 μm (D) olarak kesitli. 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, kriyostat gömme Orta (5 μm bölüm) önce (E) ve deselülarizasyon (F) sonrası dondurulmuş MFPs 'de lipid tutulumu görselleştirmek için yapıldı ve donma öncesinde sakaroz ile inkübe kriyostat gömme orta ve 30 μm bölümlerde (G) kesitli. Ölçek çubukları 50 μm temsil eder. Decell = deselülarizasyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: hidrojel oluşumunun onayı. 37 °C ve% 0,5 gerilimde MFP 'lerden yapılan kontrol (A) ve ışınlanmış (B) ön jel çözeltisinin depolama ve kayıp modülünü belirlemek için Reoloji kullanılmıştır. Hata çubukları standart sapma gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: radyasyona neden olan ECM hidrojelinde tümör hücresi proliferasyonu. 4t1 hücre proliferasyonu 48 h aşı sonra kontrol (A) ve ışınlanmış (B) MFP 'ler türetilen pre-jel ile gösterilir. (C) kontrol ve ışınlanmış Hidrojeller içinde gömülü 4t1 hücrelerden Bioluminescence sinyali. Calcein lekeli canlı hücreler ve etidium homodimer lekeli ölü hücreler kontrol (D) ve radyasyon (E) hydrogels değerlendirildi ve canlı/ölü oranı (F) nicelendirilmiş oldu. Ölçek çubukları 200 μm temsil eder. Hata çubukları standart hata gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: ECM hidrojeli sitil iskelet özellikleri. (A) kontrol ve (B) IÇINDEKI hücreler radyasyonlu ECM Hidrojetleri, radyasyonlu MFP 'lerde çekirdekleri (mavi) görselleştirmek için F-actin (kırmızı) ve mavi floresan boya görselleştirmek için phalloidin konjukel ile lekelenebilir. ölçek çubuğu 100 μm ' yi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Doku ağırlığı (g) | Denetim (0 GY) |
ışınlanmış (20 GY) |
| İlk MFP ağırlığı | 0,461 | 0,457 |
| Histoloji numunesi çıkarılması sonrasında MFP ağırlığı | 0,423 | 0,416 |
| Deselülarizasyon sonrası MFP ağırlığı | 0,025 | 0,025 |
| Histoloji numunesi kaldırma işleminden sonra deselülarize MFP ağırlığı | 0,015 | 0,016 |
Tablo 1: deselülarizasyon öncesi ve sonrası doku ağırlıkları. Her koşul için temsili doku ağırlıkları, MFP deselülarizasyon öncesi ve sonrası ölçülmüştür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hidrojel oluşumu bu yöntem büyük ölçüde başlangıç dokusu miktarına bağlıdır. Murine MFP 'ler küçüktür ve deselülarizasyon süreci malzemenin önemli ölçüde azalmasına neden olur (Tablo 1). Son verimi artırmak için daha fazla MFP ile işlem tekrarlanabilir. Frezeleme, malzemenin kaybına yol açabilecek bir başka önemli adımdır. Diğerleri bir kriyojenik değirmen ile başarı göstermiştir, ancak bu protokol bir el harç ve bir havaneli eki ile elektrikli matkap ile frezeleme dayanmaktadır8,17. Bu düşük sermaye maliyetlerinin avantajı vardır ve malzeme kaybını en aza indirmek ancak nihai üründe değişkenlik tanıtmak olabilir.
Deselülarizasyon ve de-lipidasyon onayı için bir meydan okuma, kriyostat gömme orta donma yağ dokusu içinde. Şekil 2a , parafin içinde gömülü ve kesitli, ışınlanmamış bir MFP 'nin H & E boyama gösterir. Farklı çekirdekler, diğer hücreler ile kavşaklar yakın adipoz hücrelerin kenarları görünür ve adiposit morfoloji bakımlı. Şekil 2B , C, E, F, kriyostat gömme orta ve 5 μm Dilimleme bölümünde MFP 'lerin katıştırılması ve dondurulması ile hazırlanan MFP 'leri gösterir. Bu süreç adiposit morfolojisi ve şeklini koruyamadı. Ancak, deselülarizasyon nükleeler ve diğer DNA izleri (Şekil 2C) kaybı ile teyit edildi ve de-lipidasyon nötr lipid içerik boyama kaybı ile görselleştirildi (Şekil 2F). Adipoksit morfolojisi, MFPs 'yi sukrome, gömme ve dondurarak kriyostat gömme ortamına yerleştirerek ve 30 μm Dilimleme (Şekil 2D, G) tarafından sürdürülmüştür. H & E boyama görselleştirme bu yöntemle zordu iken (Şekil 2D), 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama adiposit morfoloji (Şekil 2G) tutulmasını doğruladı.
İn vivo normal doku mikroortamını ve radyasyon hasarına olan tepkisini taklit eden bir in vitro hidrojel modeli geliştirdik. ECM Hidrojeller benzer çalışmalarda üretilmiştir, ancak radyasyon hasarının tümör hücresi davranışına etkisi değerlendirilmez9,12,16,17,18. MFP 'lerin ışınlanması ECM yeniden modelleme ve bileşimi değiştirecektir ve Bu bileşim değişiklikleri gelecekteki çalışmalarda karakterize edilecektir. Hem biyolüminesans görüntüleme hem de uyulması (Şekil 4) kullanılarak ışınlanmış ECM hidrojelleri içinde 4t1 hücrelerinin proliferasyonu konusunda artan bir eğilim gözlemledik. Buna ek olarak, kapsüllenmiş tümör hücrelerinde F-aktin filaminleri lekelenmesi için phalloidin Konjugat kullandık ve ışınlanmış ECM hidrojelinde aktik hizalaması ve tümör hücre uzaması içinde nitel bir artış bulundu, bu da yapışma gücüne bir artış öneriyor ve invaziv kapasite (Şekil 5)19,20. Gelecekteki deneyler, hücre göçü ve istilasının değerlendirilmesi için odak yapışma dinamikleri ve proteaz aracılı remodeling değişiklikleri keşfedebilecektir.
Bu yöntem bir murine tnbc hücre hattı kullanılarak geliştirilmiştir, ancak bu yöntem diğer hücre türlerinin proliferasyonu ve invaziv değerlendirmek için bir platform olarak kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar radyasyon yanı sıra doku hasarı diğer formları (örneğin, cerrahi) yanıt rolünü belirlemek için bağışıklık hücreleri dahil olabilir. Bu çalışmada MFPs 'ye yayılan eski vivo ECM hidrojellerini değerlendirmesine karşın, ek çalışmalar, fizyolojik radyasyon tepkisi ve bağışıklık hücrelerinin ECM özelliklerine infiltrasyon etkisini değerlendirmek için MFP 'lerin in vivo radyasyonunu keşfedebilecektir. Normal doku radyasyonunun tümör hücresi davranışında etkisini incelemek için fare MFP 'lerden ECM hidrogonları üretebilmek için bir yöntem kurduk ve bu teknik daha alakalı bir hidrojel modeli için insan dokusuna uzatılabilir. Genel olarak, ECM hidrojetleri aracılığıyla normal doku hasarını incelemek, yerel nüks içinde radyoterapi sonrasında ECM değişikliklerinin rolü hakkında bilgi edinebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri sağlamak için Dr. Laura L. Bronsart teşekkür ederiz, Dr. Edward L. lagory 1 üzerinde tavsiye için-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, Dr. Craig L. Duvall Ivis ve kurutucu kullanımı için, ve Dr. Scott A. guelcher Reometre için Kullanın. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
