Summary
Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.
Abstract
A radiação é uma terapia para pacientes com câncer de mama triplo negativo. O efeito da radiação na matriz extracelular (ECM) do tecido saudável do peito e de seu papel no retorno local no local preliminar do tumor é desconhecido. Aqui nós apresentamos um método para o decellularization, o lyophilization, e a fabricação de hidrogéis do ECM derivados das almofadas gordas mamária murino. Os resultados são apresentados sobre a efetividade do processo de descelularização, e os parâmetros reológicos foram avaliados. As células de câncer de mama com rótulo de GFP e luciferase encapsuladas nos hidrogéis demonstraram um aumento na proliferação de hidrogéis irradiados. Finalmente, a mancha do conjugado do faloidina foi empregada para visualizar a organização do citoesqueleto de pilhas encapsuladas do tumor. Nosso objetivo é apresentar um método para fabricar hidrogéis para estudo in vitro que imitam o ambiente do tecido mamário in vivo e sua resposta à radiação, a fim de estudar o comportamento das células tumorais.
Introduction
O câncer é caracterizado por excesso de proliferação de células que podem evadir a apoptose e também metastasizar para locais distantes1. O câncer de mama é uma das formas mais comuns entre as fêmeas nos EUA, com uma estimativa de 266.000 novos casos e 40.000 mortes em 20182. Um subtipo particularmente agressivo e difícil de tratar é o cancro da mama triplo negativo (TNBC), que carece de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (RP), e fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A radioterapia é comumente usada no câncer de mama para eliminar células tumorais residuais após a lumpectomia, mas mais de 13% dos pacientes com TNBC ainda experimentam recidiva no sítio primário do tumor3.
Sabe-se que a radioterapia é efetiva na mitigação da metástase e recorrência, pois a combinação de lumpectomia e radiação resulta na mesma sobrevida em longo prazo que a mastectomia4. Entretanto, tem-se mostrado recentemente que o tratamento de radiação é associado com o retorno local ao local preliminar do tumor em ajustes imunocomprometidos5,6. Além disso, é bem sabido que a radiação modifica a matriz extracelular (ECM) do tecido normal induzindo fibrose7. Conseqüentemente, é importante compreender o papel de mudanças radiação-induzidas do ECM em diating o comportamento da pilha do tumor.
Os tecidos decelularizados têm sido utilizados como modelos in vitro para o estudo da doença8,9. Estes tecidos decelularizados preservam a composição do ECM e recapitulam o complexo ECM in vivo. Este ECM descelularizados do tecido pode mais ser processado e digerido para dar forma a hidrogéis reconstituídos do ECM que podem ser usados para estudar o crescimento da pilha e a função10,11. Por exemplo, os hidrogéis injetáveis derivados do lipoaspirado humano decelularizado e do tecido miocárdico serviram como métodos não invasivos de engenharia tecidual, e um hidrogel derivado do tecido pulmonar porcino foi utilizado como método in vitro de teste fixação e viabilidade de células-tronco mesenquimais12,13,14. O efeito de dano normal da radiação do tecido em Propriedades do ECM, entretanto, não foi investigado.
Os hidrogéis derivados do ECM têm o maior potencial para o estudo in vitro de fenômenos in vivo. Vários outros materiais foram estudados, incluindo colágeno, fibrina e matrigel, mas é difícil recapitular sinteticamente a composição do ECM13. Uma vantagem do uso de hidrogéis derivados de ECM é que o ECM contém as proteínas e fatores de crescimento necessários para um determinado tecido14,15. A irradiação do tecido normal durante lumpectomy causa mudanças significativas ao ECM, e os hidrogéis ECM-derivados podem ser usados para estudar este efeito in vitro. Este método poderia conduzir a uns modelos in vitro mais complexos e mais exatos da doença.
Neste estudo, nós sujeitamos almofadas gordas mamária murino (MFPs) à radiação ex vivo. Os MFPs foram descelularizados e feito na solução do pre-gel. Os hydrogels foram dados forma com as pilhas 4T1 encaixadas, uma linha celular murino de TNBC. As propriedades reológicas do material do hidrogel foram examinadas, e a dinâmica da pilha do tumor foi avaliada dentro dos hydrogels. Hidrogéis fabricados a partir de MFPs irradiados reforçada proliferação de células tumorais. Os estudos futuros incorporarão outros tipos da pilha para estudar interações da pilha-pilha no contexto do retorno do cancro depois da terapia.
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Protocol
Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Vanderbilt.
1. preparação e irradiação ex vivo de MFPs
- Sacrifique camundongos de nu/nu camundongos (8 – 10 semanas) usando o asfixia do co2 seguido pela deslocação cervical.
- Limpe a pele usando 70% de etanol.
- Colete almofadas de gordura mamárias (MFPs) de camundongos sacrificados usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps em um tubo cônico de 15 mL contendo meios completos de RPMI (RPMI suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal) (ver a tabela de materiais ).
- Irradiar amostras para 20 GY usando uma fonte de césio.
- Traga os MFPs irradiados e complete a mídia RPMI em um gabinete de biossegurança. A mídia será dependente da linha celular a ser cultivada no hidrogel final. Encha os pratos de 6 cm ou 10 cm com mídia suficiente para submergir os MFPs. Para pratos de 6 cm, use 8 mL de mídia, e para pratos de 10 cm, use 20 mL de mídia.
- Incubar em uma incubadora de 37 ° c/5% CO2 por dois dias. O período de tempo na incubadora pode ser ajustado.
- Enxague os tecidos em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), limpe o excesso de umidade e coloque MFPs em tubos cônicos de 15 mL para armazenamento a-80 ° c até a decelularização. Esta etapa de congelamento auxilia a etapa de decelularização e a amostra deve ser congelada mesmo que os próximos passos estejam de outra forma prontos.
2. decellularization (adaptado das referências12,16,17)
Nota: este procedimento foi adaptado de métodos previamente publicados com foco na decelularização adiposa, que incluiu o detergente iônico de desoxicolato de sódio em vez de sulfato de sódio para remover o DNA eficientemente12,16 , a 17.
- No dia 1, remova MFPs congelados de-80 ° c e descongele à temperatura ambiente.
- Uma vez descongelados, MFPs secos brevemente em uma tarefa delicada limpe. Pesar os MFPs usando uma escala analítica.
- Usando um par de fórceps com tesouras ou um bisturi, divida o tecido acima em 3 milímetros x 3 milímetros x 3 milímetros de amostras para o estudo do ECM intacto e do tecido restante para a produção do hidrogel.
Observação: o número de amostras depende do número de métodos de teste, por exemplo, a coleta de duas amostras é descrita abaixo: uma para incorporação de parafina (etapa 2,5) e outra para congelamento no meio de incorporação de criostat, se desejado (ver a tabela de materiais e passo 2,6). - Pesar os tecidos. Se a incorporação em parafina para o corte, continue a etapa 2,5. Se o congelamento em meio de incorporação de criostat para corte, continue a etapa 2,6.
- Em uma capa química, mergulhe o tecido em formalina tamponada neutra de 10% (NBF) (veja a tabela de materiais) por 24 h a 4 ° c. Lave 3 vezes em PBS por 5 min cada. Submergir o tecido em 30% de sacarose por 48 h a 4 ° c.
- Pesar o tecido agora que esta peça foi removida. Continue para a etapa 2,6.
- Em um capuz químico, coloque peças MFP em uma gaveta rotulada preparada com meio de incorporação de criostat. Adicione mais meio de incorporação de criostat para cobrir o tecido.
- Coloque a fita em uma taça de 2-metilbutano (ver a tabela de materiais) que é pré-arrefecida com nitrogênio líquido. O béquer deve ter 2-metilbutano suficiente para cobrir o fundo, mas não o suficiente para submergir a gaveta porque o meio de incorporação de criostat não deve tocar o 2-metilbutano. Deixe a gaveta sentar-se no 2-methylbutane até que o criostato que encaixa o meio congele e se torne opaco.
- Enrole o (s) Cassette (es) em folha, etiqueta e deixe-o a-80 ° c até ser utilizado para o corte.
Nota: os tecidos colocados imediatamente no meio de incorporação do criostat foram seccionados a 5 μm, enquanto os tecidos incubados em sacarose foram seccionados a 30 μm para reter a morfologia adipocitada.
- Use fórceps para massagear manualmente o tecido remanescente.
Nota: as peças de tecido também podem ser colocadas em 10% NBF por 24 – 48 h, enxaguadas em PBS, e deixadas em etanol a 70% até a incorporação em parafina. Após a incorporação, podem ser utilizadas secções de 5 μm para coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (ver secção 7 abaixo). - Coloque os MFPs em pratos de 6 cm com 5 mL de solução de 0, 2% de tripsina/0,05% de EDTA. Incubar a 37 ° c por 1 h. Pulverize e limpe os pratos com 70% de etanol antes de colocar na incubadora.
- Use os filtros de 0,7 milímetros para lavar os MFPs com água deionizada (di) derramando a água sobre o tecido três vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavas.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque os tecidos em uma taça pré-esterilizada contendo uma barra de agitação apropriadamente dimensionada. Cubra os tecidos com 60 mL de 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (veja a tabela de materiais) por 1 g de tecido e mexa por 1 h à temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
- Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Enxague o copo com água DI e despeje sobre os tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre enxaguos.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque os tecidos e mexa as barras de volta nos mesmos copos e cubra com 60 mL de ácido desoxicólico a 4% por 1 g de tecido. Mexa por 1 h à temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
- Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de malha. Enxague o copo com água DI e despeje sobre os tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre enxaguos.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa.
- Coloque os tecidos na mesma taça com água fresca de DI suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina. Cubra firmemente com película de parafina. Deixe durante a noite a 4 ° c.
- Lave os filtros e os copos para uso no dia seguinte.
- No dia 2, drenar o conteúdo da Taça em um filtro. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa.
- Coloque MFPs no mesmo copo com uma barra de agitação apropriadamente dimensionada. Cubra com 60 mL de solução de ácido peracético a 4% de etanol/0,1% por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 2 h à temperatura ambiente.
- Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no copo. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de 1X PBS por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita uma vez.
- Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta em taça. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL DI de água por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita uma vez.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
- Coloque o conteúdo de volta em taça. Cubra os tecidos com 60 mL de 100% n-propanol por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 1 h à temperatura ambiente.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
- Coloque o conteúdo de volta em taça. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água de DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita três vezes.
- Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Repita as etapas 2.3 – 2.6 para coletar pedaços de tecido para incubação de sacarose e congelamento no meio de incorporação de criostat.
- Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque em um tubo de 15 mL rotulado. Congelar a-80 ° c durante a noite.
3. liofilização
- Retire os tubos de 15 mL de-80 ° c e coloque no gelo seco. Mantenha as amostras congeladas em gelo seco até o liofililizante.
- Retire as tampas. Use uma faixa de borracha para prender uma tarefa delicada Limpe à parte superior para cobrir a abertura. Coloque amostras no liofililizante durante pelo menos 2 dias.
- Retire as amostras do liofililizante e coloque os tubos em gelo seco. Remova as limpezas delicadas da tarefa pesam cada amostra em uma escala analítica. Anexar tampas e colocar em-80 ° c durante a noite.
4. Fresamento
- Encha um recipiente raso com nitrogênio líquido. Retire as amostras do congelador-80 ° c. Pesar cada MFP liofilizado.
- Coloque uma amostra no almofariz. Use uma luva criogênica para segurar o almofariz no nitrogênio líquido.
- Use um pilão anexado a uma broca portátil para moer a amostra. Moinho em intervalos de 1 min para verificar o progresso e remover a mão gloved do nitrogênio líquido. Moinho para um mínimo de 5 min.
- Repita para todas as amostras. Pulverize e limpe o almofariz e o pilão com etanol entre cada amostra.
- Armazene amostras pulverizadas em tubos de 15 mL a-80 ° c até estar pronto para uso.
Nota: as amostras podem ser usadas imediatamente ou armazenadas durante a noite.
5. formação de hidrogel
- Se armazenado em-80 ° c durante a noite, retire e descongele à temperatura ambiente. Enquanto descongelar, calcule o peso necessário de pepsina (ver tabela de materiais) e volume de ácido clorídrico (HCL) necessário para cada amostra que resulta em uma solução com 1% w/v pó de amostra e 0,1% w/v pepsina em 0, 1 M HCL. Adicione a pepsina à HCL para formar uma solução de Pepsin-HCl.
- Adicione o pó da amostra e a solução de Pepsin-HCl a um tubo de 15 mL. Adicione uma pequena barra de agitação, e mexa para 48 h.
- Coloque os tubos no gelo por 5 min. calcule o volume necessário de PBS 10x necessário para cada amostra que resulte em uma solução com uma concentração de 1X PBS. Adicione o volume apropriado de 10x PBS a cada tubo.
- Adicionar 10% v/v 0,1 M NaOH a cada solução para atingir o pH 7,4. Use um papel de pH para testar individualmente.
Nota: a solução de gel pode ser armazenada a 4 ° c durante uma semana.
6. encapsulando células em hidrogéis
- Usando células rotuladas por GFP e luciferase
- Usando a solução do gel do pH 7,4, Ressuspender GFP-e células 4T1 luciferase-etiquetadas a uma concentração de 500.000 ou de 1 milhão pilhas/mL da solução do gel. Adicione 16 μL da solução da gel-pilha a cada poço de uma corrediça da câmara de 16 poços. Incubar por 30 min a 37 ° c.
- Adicione 100 μL de mídia RPMI completa a cada poço. Continue a incubação para 48 h em 37 ° c. As células GFP-e luciferase-etiquetadas podem ser visualizadas usando a microscopia de fluorescência em 0 horas, 24 horas, e 48 horas após a gelação.
Nota: a proliferação celular pode ser medida para as células 4T1 rotuladas por GFP e luciferase, usadas aqui, adicionando (S)-4, 5-dihidro-2-(6-hidroxi-2-benzothiazolyl)-sal de potássio ácido tiazolecarboxílico (ver a tabela de materiais) aos poços por 10 min e realizando a imagem de bioluminescência usando um sistema de imagem de bioluminescência (ver tabela de materiais). Após a imagem de bioluminescência, o citoesqueleto pode ser visualizado (ver secção 10).
- Usando células sem rótulo
- Usando a solução do gel do pH 7,4, Ressuspender células 4T1 sem rótulo peletizada a uma concentração de 500.000 ou 1 milhão Cells/ml da solução do gel. Adicione 16 μL da solução da gel-pilha a cada poço de uma corrediça da câmara de 16 poços e de uma placa 96-well. Incubar por 30 min a 37 ° c.
- Adicione 100 μL de mídia a cada poço. Continue a incubação para 48 h em 37 ° c.
Nota: a viabilidade celular pode ser medida (ver secção 11). A corrediça da câmara de 16 poços pode ser usada para a imagem latente, e a placa 96-well pode ser usada para a quantificação.
7. coloração de H & E
- Para o tecido fixado em formalina, parafina-encaixado, as corrediças de submergir que contêm seções de 5 μm duas vezes em 100% xileno (5 – 10 minutos) para o de-paraffinization. Rehidrate submergindo em 100%, 95%, 85% e 70% etanol por 5 min cada seguido por água DI por 5 min. continue a etapa 7,6.
- Para seções de tecido congelado, tomar seções imediatamente do congelador e submergir-los em 10% NBF por 10 min. Lave em 1X PBS três vezes por 5 min cada. Enxaguar em água durante 5 min.
- Núcleos de mancha com hematoxilina por 3 min. Enxague em água corrente da torneira.
- Diferencie-se mergulhando 1 – 2 vezes em álcool ácido 0,3% (0,3% HCl em 70% etanol). Enxágüe em água corrente da torneira durante 5 min.
- Adicione o agente bluing por 30 s. enxágüe em água corrente da torneira por 5 min. Mergulhe em etanol a 95% por 30 s.
- Incubar com eosina para 90 s à temperatura ambiente. Desidrata em 3 alterações de 100% de etanol por 5 min cada.
- Submerge duas vezes em 100% de xileno por 5 min cada. Adicionar distyrene-plastificante-xileno (DPX0 montagem de mídia para o slide e adicionar uma lamínula. Deixe-a curar durante a noite antes da imagem.
8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol coloração
- Prepare 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol solução.
- Adicionar 0,5 g de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol pó para um copo com 100 mL de propilenoglicol. Aqueça a 95 – 100 ° c enquanto mexendo durante pelo menos 30 min. Evite que a temperatura exceda 100 ° c.
- Retire o copo do lume e deixe arrefecer ligeiramente. Derrame a solução através do papel de filtro qualitativo da classe 4 para remover todas as partículas residuais.
Nota: a solução pode ser armazenada à temperatura ambiente e deve ser filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm imediatamente antes da coloração.
- Mancha congelados seções de tecido.
- Retire as lâminas do congelador-80 ° c e seque por 30 min. pre-Cool 10% NBF a-20 ° c por 30 min em um frasco de Coplin. Fixar os slides à temperatura ambiente durante 10 min. Lave em água de DI 3 vezes por 5 min cada.
- Retire o excesso de água usando uma delicada tarefa limpe antes de mergulhar em propilenoglicol 2 vezes por 5 min cada. Retire as lâminas do propilenoglicol. Não enxague.
- Coloque as lâminas em seringa filtrada óleo vermelho O solução de coloração para 3 h à temperatura ambiente.
- Diferenciar colocando slides em 85% propilenoglicol por 5 min. Enxágüe amostras em PBS duas vezes por 5 min cada.
- Amostras de mancha com hematoxilina por 30 s. Lave na água da torneira running por 5 minutos e coloc então as corrediças na água do DI.
- Monte amostras usando o meio de montagem baseado aquosa e permita que os meios seque durante a noite antes da imagem latente.
9. reologia
- Traga soluções pré-gel do passo 5,4 para o Reômetro no gelo.
- Fixe um braço e uma placa de 25 mm ao Reômetro. Abra o software de reologia no computador conectado ao Reômetro.
- Realize o mapeamento rotacional e determine a lacuna zero. Levante o braço quando terminar.
- Pipeta 500 μL de pré-gel na placa. Abaixe o braço até que a solução do pre-gel ocupe completamente a abertura entre a placa e o braço. Seja conservador porque abaixar o braço após este ponto conduzirá à solução do pre-gel que derrama fora do lado.
- Realize uma varredura da freqüência na solução do pre-gel de 0.1-100 Hertz depois que permaneceu no ° c 37 por 30 minutos.
- Levante o braço do Reômetro quando completo. Limpe o líquido com uma limpeza delicada da tarefa. Enxague com água DI e limpe com uma delicada limpeza de tarefas. Repita os passos 9.4 – 9.6 com amostras adicionais.
10. coloração conjugada com Phalloidin de F-Actina
- Traga a solução conjugada de faloidina à temperatura ambiente. Centrifugue momentaneamente em uma baixa velocidade antes da abertura. Aliquot suficiente solução para o ensaio, e armazenar o resto em-20 ° c.
- Diluir a solução de ações conjugadas de 1000x faloidina para uma solução de trabalho 1x adicionando 1 μL de solução de estoque a 1 ml 1X PBS + 1% de albumina sérica bovina (BSA). Isto faz bastante para 10 poços (100 μL/poço).
Nota: um pode usar Plain 1X PBS, mas 1X PBS + BSA é preferível para evitar faloidina conjugado de furar ao tubo. Não guarde esta solução após o ensaio. 1 μL de corante fluorescente azul (ver a tabela de materiais) a solução de trabalho pode ser adicionada à mancha para núcleos. A solução de trabalho pode ser feita misturando 1 μL de corante fluorescente azul de 20 mM com 11,3 μL 1X PBS. - Aspirar suportes de poços (passo 6,1). Enxaguar poços com 1X PBS.
- Adicionar 10% NBF. Incubar poços com 10% de NBF por 20 min à temperatura ambiente. Remover sobrenadante. Lave 3 vezes com PBS durante 5 min de cada vez.
- Adicionar 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol em PBS por 5 min. aspirar e lavar 3 vezes com PBS por 5 min de cada vez.
- Adicione 100 μL de solução de trabalho da etapa 10,2 a cada poço. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Aspirar e lavar 3 vezes com PBS por 5 min de cada vez. Deixar em PBS a 4 ° c.
- Aspirar e remover os poços da junta na corrediça da câmara. Use a pinça do nariz da agulha para remover a junta do slide. Amostras de montagem e de lamínula com meio de montagem aquosa. Permitir a cura (5 min).
- Observe as células um microscópio de fluorescência na excitação/emissão de 590/618 nm.
11. ensaio de viabilidade
- Enxágüe as pilhas com o PBS de Dulbecco (DPBS). Adicionar 100 μl de dpbs contendo 1 μm de calceina am e 2 μm de etídio homodímero a cada poço. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Imagem a corrediça da câmara de 16 poços pela microscopia de fluorescência. Calceina acetoxymethyl (calcein AM) pode ser observada na excitação/emissão = 494/517 nm. O homodímero de ethidium pode ser observado na excitação/emissão = 528/645 nanômetro.
- Leia a placa 96-well em um leitor da placa usando os mesmos comprimentos de onda na etapa 11,2.
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Representative Results
Os MFPs foram descelularizados depois da irradiação usando o procedimento mostrado na Figura 1a. As MFPs pré-descelularizadas (Figura 1b) e pós-descelularização (Figura 1C) são mostradas. A descelularização foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H & E), e a coloração de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naftol foi utilizada para avaliar o teor lipídico (Figura,2). As propriedades reológicas dos hidrogéis de ECM também foram avaliadas a 37 ° c (Figura 3). O módulo de armazenamento foi maior que o módulo de perda para todas as condições, demonstrando formação estável de hidrogel.
GFP-e as pilhas de carcinoma mamária 4T1 rotuladas luciferase foram encapsulados nos hydrogels. A proliferação celular foi examinada por microscopia de fluorescência, medições de bioluminescência e viabilidade de coloração 48 h após a encapsulação (Figura 4). Os hidrogéis irradiados mostraram uma tendência crescente na proliferação da pilha do tumor. O conjugado de Phalloidin foi utilizado para visualizar a F-Actina nas células encapsuladas (Figura 5). Esta técnica pode ser utilizada para examinar a morfologia celular e as propriedades citoesqueléticas.
Figura 1: fluxo de trabalho experimental. (A) esquema de formação de hidrogel. Foram realizadas imagens de câmeras digitais de MFPs pré-(B) e pós-decelularização (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: confirmação da decelularização e deslipidação em MFPs. A coloração de hematoxilina e eosina (H & E) de MFPs não irradiados embutidos em parafina e seccionadas a 5 μm (a) foi comparada com os MFPs congelados no meio de incorporação de criostat (seções de 5 μm) antes (B) e após a decelularização (C), incubados com sacarose antes do congelamento em meio de criostat e seccionados a 30 μm (D). 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol a coloração foi feita para visualizar a retenção lipídica em MFPs congelado em meio de incorporação de criostato (seções de 5 μm) antes (e) e após a descelularização (F) e incubada com sacarose antes do congelamento em criostat que encaixa o meio e seccionado em 30 μm seções (G). As barras de escala representam 50 μm. Decell = decellularization. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: confirmação da formação de hidrogel. A reologia foi utilizada para determinar o módulo de armazenamento e perda de controle (a) e a solução de pré-gel irradiada (B) feita a partir de MFPs a 37 ° c e 0,5% de cepa. As barras de erro mostram o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: proliferação de células tumorais em hidrogéis de ECM irradiados. a proliferação celular 4T1 48 h após a inoculação é mostrada com pré-gel derivado do controle (a) e das MFPs irradiadas (B). (C) sinal de bioluminescência de células 4T1 incorporadas dentro de controle e hidrogéis irradiados. As células mortas coradas de calceina e o etidium homodímero foram avaliados no controle (D) e nos hidrogéis irradiados (e), e a relação viva/morta foi quantificada (F). As barras de escala representam 200 μm. As barras de erro mostram o erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Propriedades Citoesqueléticas em hidrogéis de ECM. As células dentro de (a) controle e (B) hidrogéis de ECM irradiados são coradas com conjugado de faloidina para visualizar o corante fluorescente de F-Actina (vermelho) e azul para visualizar núcleos (azul) em MFPs irradiados. a barra de escala representa 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Peso do tecido (g) | Controle (0 GY) |
Irradiados (20 GY) |
| Peso inicial da MFP | 0,461 | 0,457 |
| MFP peso após a remoção da amostra histologia | 0,423 | 0,416 |
| Peso da MFP após a descelularização | 0, 25 | 0, 25 |
| Peso da MFP decellularized após a remoção da amostra da histologia | 0, 15 | 0, 16 |
Tabela 1: pesos teciduais antes e após a descelularização. Os pesos representativos dos tecidos para cada condição foram medidos antes e após a descelularização da MFP.
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Discussion
Este método de formação de hidrogel é em grande parte dependente da quantidade de tecido inicial. Os MFPs murinos são pequenos, e o processo de descelularização resulta em uma redução significativa do material (tabela 1). O processo pode ser repetido com mais MFPs para aumentar o rendimento final. O fresamento é outro passo importante que pode levar à perda de material. Outros mostraram sucesso com um moinho criogênico, mas este protocolo é baseado na moagem através de uma argamassa de mão e broca elétrica com um acessório de pilão8,17. Isso tem a vantagem de reduzir os custos de capital e minimizar a perda de material, mas pode introduzir variabilidade no produto final.
Um desafio à confirmação de decelularização e de-lipidation está em congelar o tecido adiposo no meio de incorporação do criostato. A Figura 2a mostra a coloração H & e de uma MFP não irradiada incorporada e seccionada em parafina. Núcleos distintos são visíveis nas bordas das células adiposas próximas a junções com outras células, e a morfologia adipocitta é bem mantida. Figura 2b , C, e, F mostram MFPs preparados pela incorporação e congelamento de MFPs em meio de incorporação de criostat e cortes de 5 μm de corte. Este processo foi incapaz de reter a morfologia e a forma do adipócitos. Entretanto, a decelularização foi confirmada pela perda de núcleos e outros traços de DNA (Figura 2C), e a deslipidação foi visualizada com a perda da coloração do conteúdo lipídico neutro (Figura 2F). A morfologia da adipocite foi mantida por MFPs incubadores em sacarose, incorporação e congelamento em meio de incorporação de criostat e corte de fatias de 30 μm (Figura 2D, G). Enquanto a visualização da coloração de H & E foi difícil com este método (Figura 2D), 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naftol de coloração confirmou a retenção da morfologia adipocitta (Figura 2G).
Nós desenvolvemos um modelo in vitro do hidrogel que possa imitar o microambiente normal in vivo do tecido e sua resposta aos danos da radiação. Os hidrogéis do ECM foram fabricados em estudos similares, mas o impacto de dano da radiação no comportamento da pilha do tumor não foi avaliado9,12,16,17,18. Esperamos que a irradiação de MFPs altere o remodelamento e a composição do ECM, e essas alterações composicional serão caracterizadas em estudos futuros. Observamos uma tendência crescente na proliferação de células 4T1 dentro de hidrogéis de ECM irradiados, utilizando tanto a imagem de bioluminescência quanto a viabilidade de coloração (Figura 4). Além, nós usamos o conjugado do faloidina para manchar filamentos de F-Actina em pilhas encapsuladas do tumor e encontramos um aumento qualitativo no alinhamento do actina e no alongamento da pilha do tumor em hydrogels irradiados do ECM, que sugere um aumento na força da adesão e capacidade invasiva (Figura 5)19,20. Experimentos futuros explorarão mudanças na dinâmica de adesão focal e na remodelação mediada pela protease para a avaliação da migração celular e invasão.
Este método foi desenvolvido usando uma linha celular Murina TNBC, mas esse método pode ser usado como uma plataforma para avaliar a proliferação e a invasividade de outros tipos de células. Estudos futuros podem incorporar células imunes para determinar seu papel em resposta à radiação, bem como outras formas de dano tecidual (por exemplo, cirurgia). Embora este estudo tenha avaliado hidrogéis de ECM a partir de MFPs irradiados ex vivo, estudos adicionais explorarão a radiação in vivo de MFPs para avaliar o efeito da resposta fisiológica de radiação e infiltrar células imunes nas características da ECM. Nós estabelecemos um método para fabricar hidrogéis do ECM dos MFPs do rato para estudar o efeito da radiação normal do tecido no comportamento da pilha do tumor, e esta técnica pode ser estendida ao tecido humano para um modelo mais relevante do hidrogel. Globalmente, o exame de danos teciduais normais através de hidrogéis ECM pode levar a insights sobre o papel das alterações de ECM após radioterapia na recorrência local.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer as células GFP-e luciferase-4T1, Dr. Edward l. lagory para o Conselho em 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol que mancha, Dr. Craig L. Duvall para ivis e uso do Liofilizador, e Dr. Scott A. guelcher para o Reômetro Usar. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela concessão de NIH #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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