Summary
Dit protocol presenteert een methode voor decellularisatie en daaropvolgende hydrogel vorming van muriene borst vetpads na ex vivo bestraling.
Abstract
Straling is een therapie voor patiënten met drievoudige negatieve borstkanker. Het effect van straling op de extracellulaire matrix (ECM) van gezonde borstweefsel en haar rol in lokale herhaling op de primaire tumor site zijn onbekend. Hier presenteren we een methode voor de decellularisatie, lyofilisatie en fabricage van ECM-hydrogels die zijn afgeleid van Murine-vetpads. Resultaten worden gepresenteerd over de effectiviteit van het decellularisatie proces, en reologische parameters werden beoordeeld. GFP-en Luciferase-gelabelde borstkankercellen die in de hydrogels zijn ingekapseld, toonden een toename van proliferatie in bestraalde hydrogels. Tot slot, phalloidin geconjugeerde kleuring werd gebruikt om cytoskelet organisatie van ingekapselde tumorcellen te visualiseren. Ons doel is om een methode voor het vervaardigen van hydrogels voor in vitro onderzoek dat nabootsen van de in vivo borstweefsel omgeving en haar reactie op straling te presenteren om tumor cel gedrag te bestuderen.
Introduction
Kanker wordt gekenmerkt door overmatige proliferatie van cellen die apoptosis kunnen omzeilen en ook metastaseren naar verre sites1. Borstkanker is een van de meest voorkomende vormen onder vrouwtjes in de VS, met naar schatting 266.000 nieuwe gevallen en 40.000 sterfgevallen in 20182. Een bijzonder agressief en moeilijk te behandelen subtype is drievoudige negatieve borstkanker (TNBC), die geen oestrogeen receptor (ER), progesteron receptor (PR) en humane epidermale groeifactor (HER2) mist. Radiotherapie wordt vaak gebruikt bij borstkanker om residuele tumorcellen na lumpectomie te elimineren, maar meer dan 13% van de TNBC-patiënten ervaart nog steeds een recidief bij de primaire tumor locatie3.
Het is bekend dat radiotherapie effectief is in het verzachten van metastase en herhaling, omdat de combinatie van lumpectomie en straling in dezelfde lange termijn Overleving resulteert als mastectomie4. Echter, het is onlangs aangetoond dat bestraling wordt geassocieerd met lokale herhaling van de primaire tumor site in immuungecompromitteerde instellingen5,6. Ook is het bekend dat straling de extracellulaire matrix (ECM) van normaal weefsel verandert door fibrose7te induceren. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de rol van straling-geïnduceerde ECM veranderingen in het diceren van tumor Celgedrag.
Decellularized weefsels zijn gebruikt als in vitro modellen om de ziekte te bestuderen8,9. Deze decellularized weefsels behouden ECM-samenstelling en recapituleren het complex in vivo ECM. Deze decellularized weefsel-ECM kan verder worden verwerkt en verteerd om gereconstitueerde ECM-hydrogels te vormen die kunnen worden gebruikt om celgroei en functie10,11te bestuderen. Bijvoorbeeld, injecteerbare hydrogels afgeleid van decellularized humaan lipoaspiraat en van myocard weefsel diende als niet-invasieve methoden van weefsel engineering, en een hydrogel afgeleid van varkens longweefsel werd gebruikt als een in vitro testmethode mesenchymale stamcel bevestiging en levensvatbaarheid12,13,14. Het effect van normale beschadiging van de weefsel straling op de ECM-eigenschappen is echter niet onderzocht.
Hydrogels afgeleid van ECM hebben het grootste potentieel voor in vitro onderzoek naar in vivo verschijnselen. Er zijn verschillende andere materialen bestudeerd, waaronder collageen, fibrin en matrigel, maar het is moeilijk om de samenstelling van de ECM13synthetisch te recapituleren. Een voordeel van het gebruik van ecu-afgeleide hydrogels is dat de ECM de nodige eiwitten en groeifactoren voor een bepaald weefsel14,15bevat. Bestraling van normaal weefsel tijdens lumpectomie veroorzaakt significante veranderingen in de ECM, en de ECM-afgeleide hydrogels kunnen worden gebruikt om dit effect in vitro te bestuderen. Deze methode kan leiden tot meer complexe en nauwkeurigere in vitro modellen van ziekte.
In deze studie hebben we Murine borst Fat pads (mfp's) blootgesteld aan straling ex vivo. De Mfp's waren decellularized en gemaakt in pre-gel oplossing. Hydrogels werden gevormd met ingesloten 4T1 cellen, een Murine TNBC cellijn. De Rheologische eigenschappen van het hydrogel materiaal werden onderzocht en de tumor celdynamiek werd geëvalueerd binnen de hydrogels. Hydrogels vervaardigd van bestraalde Mfp's verbeterde tumor celproliferatie. Toekomstige studies zullen omvatten andere celtypen om celcelinteracties te bestuderen in de context van herhaling van kanker na therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van de Vanderbilt University.
1. bereiding en ex vivo bestraling van Mfp's
- Offer athymische nu/nu muizen (8 – 10 weken) met behulp van co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
- Reinig de huid met 70% ethanol.
- Verzamel borst Fat pads (mfp's) van het opgeofferde muizen met behulp van voorgesteriliseerde schaar en Tang in een conische buis van 15 ml die volledige rpmi-media bevat (rpmi aangevuld met 1% penicileen-streptomycine en 10% foetaal runderserum) (Zie de tabel met materialen ).
- Bestraleren monsters tot 20 GY met behulp van een cesium bron.
- Breng de bestraalde Mfp's en complete RPMI-media in een bioveiligheidskast. De media zullen afhankelijk zijn van de cellijn die in de uiteindelijke hydrogel moet worden geteeld. Vul 6 cm of 10 cm gerechten met voldoende medium om de Mfp's te kunnen onderdompelen. Voor 6 cm gerechten, gebruik 8 mL media, en voor 10 cm gerechten, gebruik 20 mL media.
- Incuberen in een incubator van 37 °C/5% CO2 gedurende twee dagen. De lengte van de tijd in de incubator kan worden aangepast.
- Spoel weefsels in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), DEP overtollig vocht en plaats Mfp's in 15 mL conische buizen voor opslag bij-80 °C tot decellularisatie. Deze Vries stap helpt de decellularisatie stap en het monster moet worden bevroren, zelfs als de volgende stappen zijn anders klaar.
2. decellularisatie (aangepast uit de referenties12,16,17)
Opmerking: deze procedure werd aangepast uit eerder gepubliceerde methoden gericht op adipeus decellularisatie, die omvatte de natrium deoxycholaat Ionische detergent in plaats van natriumdodecyl sulfaat om DNA efficiënt te verwijderen12,16 , 17.
- Verwijder op dag 1bevroren mfp's van-80 °c en ontdooien bij kamertemperatuur.
- Eenmaal ontdooid, droge Mfp's kort op een delicate taak wissen. Weeg de Mfp's met behulp van een analytische schaal.
- Verdeel met een tang met een schaar of een scalpel weefsel in 3 mm x 3 mm x 3 mm monsters voor de studie van de intacte ECM en het resterende weefsel voor de hydrogel productie.
Opmerking: het aantal monsters is afhankelijk van het aantal testmethoden, bijvoorbeeld de verzameling van twee monsters wordt hieronder beschreven: één voor paraffine-insluiting (stap 2,5) en één voor invriezen in cryostaat-insluitings medium, indien gewenst (Zie de tabel met materialen en stap 2,6). - Weeg de weefsels af. Ga verder met stap 2,5 als u paraffine insluit voor het snijden. Als invriezen in cryostaat insluitings medium voor het snijden, ga verder naar stap 2,6.
- In een chemische afzuigkap, dompel het weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) (Zie de tabel van de materialen) voor 24 uur bij 4 °c. Was 3 keer in PBS gedurende 5 minuten per stuk. Dompel het weefsel onder in 30% sucrose voor 48 uur bij 4 °C.
- Weeg het weefsel nu dat dit stuk is verwijderd. Ga verder naar stap 2,6.
- Plaats in een chemische kap MFP-onderdelen in een gelabelde cassette met een cryostaat-insluitings medium. Voeg meer cryostaat-insluitings medium toe om het weefsel te bedekken.
- Plaats de cassette in een bekerglas van 2-methylbutaan (Zie de tabel met materialen) die wordt voorgekoeld met vloeibare stikstof. Het bekerglas moet voldoende 2-methylbutaan hebben om de bodem te bedekken, maar niet genoeg om de cassette te kunnen onderdompelen omdat het cryostaat-insluitings medium de 2-methylbutaan niet mag aanraken. Laat de cassette zitten in de 2-methylbutaan totdat het cryostaat-insluitings medium bevriest en ondoorzichtig wordt.
- Wikkel de cassette (s) in folie, label en laat deze bij-80 °C totdat deze wordt gebruikt voor het snijden.
Opmerking: weefsels die onmiddellijk in het cryostaat-insluitings medium zijn geplaatst, werden op 5 μm verdeeld, terwijl de in sucrose geïnde weefsels op 30 μm werden verdeeld om de morfologie van adipocyten te behouden.
- Gebruik de tang om het resterende weefsel handmatig te masseren.
Opmerking: weefsel stukken kunnen ook worden geplaatst in 10% NBF voor 24 – 48 h, gespoeld in PBS, en links in 70% ethanol tot inbedding in paraffine. Na inbedding kunnen 5 μm-secties worden gebruikt voor hematoxyline-en eosine-kleuring (H & E) (zie rubriek 7 hieronder). - Plaats de Mfp's in 6 cm gerechten met 5 mL 0,02% trypsine/0,05% EDTA-oplossing. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur. spray en veeg de afwas met 70% ethanol alvorens in de incubator te plaatsen.
- Gebruik 0,7 mm-zeven om de Mfp's te wassen met gedeïoniseerd (DI) water door drie keer water over het weefsel te gieten. Gebruik de tang om het weefsel tussen de wasses handmatig te masseren.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats de weefsels in een voor autoclaven bekerglas met een roerstaaf met de juiste grootte. Bedek weefsels met 60 mL 3% t-octylfenoxypolyethoxyethanol (Zie de tabel met materialen) per 1 g weefsel en roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik minimaal 20 mL.
- Dump weefsel en inhoud in een zeef. Spoel het bekerglas met DI-water en giet op de weefsels. Herhaal twee keer. Gebruik de tang om het weefsel tussen de spossen handmatig te masseren.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats weefsels en roerstaven terug in dezelfde bekerglazen en dek af met 60 mL 4% deoxycholzuur per 1 g weefsel. Roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik minimaal 20 mL.
- Dump weefsel en inhoud in een Maas zeef. Spoel het bekerglas met DI-water en giet op de weefsels. Herhaal twee keer. Gebruik de tang om het weefsel tussen de spossen handmatig te masseren.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg.
- Plaats weefsels in hetzelfde bekerglas met vers DI-water, aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine. Bekleding strak met paraffine folie. Laat u overnachten bij 4 °C.
- Wasdrogers en bekers voor gebruik de volgende dag.
- Op dag 2wordt de inhoud van het bekerglas in een zeef afgevoerd. Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg.
- Plaats Mfp's in hetzelfde bekerglas met een roer stang met de juiste grootte. Afdekking met 60 mL 4% ethanol/0,1% Perazijnzuur oplossing per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 mL. Roer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Stort weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik de tang om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas. Wasweefsel door het te bedekken met 60 mL 1x PBS per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 mL. Roer 15 minuten bij kamertemperatuur. Eenmaal herhalen.
- Stort weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik de tang om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud weer in bekerglas. Wasweefsel door het te bedekken met 60 mL DI water per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 mL. Roer 15 minuten bij kamertemperatuur. Eenmaal herhalen.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Dump weefsel en inhoud in een zeef. Gebruik de tang om het weefsel handmatig te masseren.
- Plaats de inhoud weer in bekerglas. Bedek weefsels met 60 mL 100% n-propanol per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 mL. Roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Stort weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik de tang om het weefsel handmatig te masseren.
- Plaats de inhoud weer in bekerglas. Wasweefsel door het te bedekken met 60 mL DI water per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 mL. Roer 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit drie keer.
- Dump weefsel en inhoud in een zeef. Herhaal stap 2.3 – 2.6 om stukjes weefsel te verzamelen voor de incubatie van sacharose en het invriezen in het cryostaat-insluitings medium.
- Kort droog weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats in een gelabelde tube van 15 mL. Vries bij-80 °C 's nachts.
3. lyofilisatie
- Verwijder de 15 mL buizen van-80 °C en plaats op droogijs. Houd de monsters bevroren op droogijs tot op de lyophilizer.
- Verwijder caps. Gebruik een rubberen band om een delicate taak aan de bovenzijde te bevestigen om de opening te bedekken. Steek gedurende ten minste 2 dagen monsters op de lyofilisator.
- Verwijder de monsters van de lyofilisator en plaats de buisjes op droogijs. Verwijder delicate taak doekjes weeg elk monster op een analytische schaal. Bevestig caps en plaats bij-80 °C 's nachts.
4. frezen
- Vul een ondiepe container met vloeibare stikstof. Verwijder de monsters uit de vriezer-80 °C. Weeg elke gelyofiliseerde MFP af.
- Plaats één monster in de mortel. Gebruik een cryogene handschoen om de mortel in de vloeibare stikstof vast te houden.
- Gebruik een stamper die is bevestigd aan een handheld boor om het monster te frezen. Frees in 1 min intervallen om de voortgang te controleren en de handmatig uit vloeibare stikstof te verwijderen. Molen voor een minimum van 5 min.
- Herhaal dit voor alle samples. Spray en veeg de mortel en stamper met ethanol tussen elk monster.
- Bewaar poeder monsters in buisjes van 15 mL bij-80 °C tot het klaar is voor gebruik.
Opmerking: monsters kunnen onmiddellijk worden gebruikt of 's nachts worden opgeslagen.
5. hydrogel vorming
- Indien bewaard bij-80 °C 's nachts, verwijderen en ontdooien bij kamertemperatuur. Bereken tijdens het ontdooien het benodigde gewicht van pepsine (Zie tabel met materialen) en het volume zoutzuur (HCL) dat nodig is voor elk monster dat resulteert in een oplossing met 1% g/v monster poeder en 0,1% w/v pepsine in 0,01 M HCl. Voeg de pepsine toe aan de HCL-vorm een pepsine-HCl-oplossing.
- Voeg monster poeder en pepsine-HCl-oplossing toe aan een tube van 15 mL. Voeg een kleine roerstaaf toe en roer voor 48 h.
- Plaats de buisjes op ijs gedurende 5 min. Bereken de benodigde hoeveelheid 10x PBS die nodig is voor elk monster dat resulteert in een oplossing met een 1x PBS-concentratie. Voeg het juiste volume van 10x PBS toe aan elke buis.
- Voeg 10% v/v 0,1 M NaOH toe aan elke oplossing om pH 7,4 te bereiken. Gebruik een pH-papier om individueel te testen.
Opmerking: de Geloplossing kan gedurende één week bij 4 °C worden bewaard.
6. inkapende cellen in hydrogels
- Met behulp van GFP-en Luciferase-gelabelde cellen
- Met behulp van de pH 7,4 gel oplossing, respenderen van gepileerde GFP-en Luciferase-gelabelde 4t1 cellen tot een concentratie van 500.000 of 1.000.000 cellen/ml gel oplossing. Voeg 16 μL gel-celoplossing toe aan elke put van een 16-well kamer glijbaan. Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.
- Voeg aan elke put 100 μL complete RPMI-media toe. Ga verder met incubatie voor 48 uur bij 37 °C. De GFP-en Luciferase-gelabelde cellen kunnen worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie op 0 uur, 24 uur en 48 uur na de gelatie.
Opmerking: celproliferatie kan worden gemeten voor de GFP-en Luciferase-gelabelde 4T1-cellen die hier worden gebruikt door toe te voegen (S)-4, 5-dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl) 4-thiazolecarboxylzuur kalium zout (Zie de tafel van de materialen) gedurende 10 en het uitvoeren van bioluminescentie Imaging met behulp van een bioluminescentie beeldvormings systeem (Zie tabel met materialen). Na bioluminescentie Imaging kan het cytoskelet worden gevisualiseerd (zie rubriek 10).
- Niet-gelabelde cellen gebruiken
- Gebruik de pH 7,4 gel-oplossing om de niet-gelabelde 4T1-cellen te hervatten tot een concentratie van 500.000 of 1.000.000 cellen/mL gel-oplossing. Voeg 16 μL gel-celoplossing toe aan elke put van een 16-well kamer glijbaan en een 96-well plate. Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.
- Voeg 100 μL media toe aan elke put. Ga verder met incubatie voor 48 uur bij 37 °C.
Opmerking: de levensvatbaarheid van de cellen kan worden gemeten (zie rubriek 11). De 16-well kamer Slide kan worden gebruikt voorbeeld vorming, en de 96-well plate kan worden gebruikt voor kwantificering.
7. H & E kleuring
- Voor formaline-vast, paraffineingebed weefsel, subsamenvoegings platen met 5 μm secties tweemaal in 100% xyleen (5 – 10 min) voor de-paraffinisatie. Rehydraat door onderdomting in 100%, 95%, 85%, en 70% ethanol voor 5 min elk gevolgd door DI water gedurende 5 min. Ga verder naar stap 7,6.
- Voor bevroren weefsel secties, neem de secties onmiddellijk uit de vriezer en dompel ze in 10% NBF gedurende 10 min. wassen in 1x PBS drie keer gedurende 5 min elk. Spoel gedurende 5 minuten in water.
- Vlek kernen met hematoxyline gedurende 3 min. Spoel in stromend kraanwater.
- Differentiëren door het dippen van 1 – 2 keer in 0,3% zure alcohol (0,3% HCl in 70% ethanol). Spoel in stromend kraanwater gedurende 5 minuten.
- Voeg bluing agent voor 30 s. Spoel in stromend kraanwater gedurende 5 min. onderdompelen in 95% ethanol voor 30 s.
- Incuberen met eosine voor 90 s bij kamertemperatuur. Dehydraat in 3 veranderingen van 100% ethanol voor 5 min elk.
- Submerge tweemaal in 100% xyleen voor 5 min elk. Voeg distyreen-plasticiser-xylene (DPX0 montage media aan de Slide en voeg een dekglaasje toe. Laat het 's nachts genezen voorbeeld vorming.
8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol kleuring
- Bereid 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol oplossing.
- Voeg 0,5 g van 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol poeder toe aan een bekerglas met 100 mL propyleenglycol. Verwarm tot 95 – 100 °C en roer gedurende ten minste 30 min. Voorkom de temperatuur van meer dan 100 °C.
- Verwijder bekerglas van warmte en laat iets afkoelen. Giet de oplossing door grade 4 kwalitatieve filterpapier om eventuele resterende deeltjes te verwijderen.
Opmerking: de oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard en moet onmiddellijk vóór het vlekken worden gefilterd door een spuit filter van 0,45 μm.
- Vlekken bevroren weefsel secties.
- Verwijder de glaasjes uit de-80 °C vriezer en de lucht drogen gedurende 30 min. pre-cool 10% NBF bij-20 °C gedurende 30 minuten in een Coplin jar. Bevestig de dia's bij kamertemperatuur 10 min. wassen in DI water 3 keer voor 5 min elk.
- Verwijder overtollig water met een delicate taak veeg voordat u onderdompelen in propyleenglycol 2 keer voor 5 min elk. Verwijder dia's uit propyleenglycol. Niet uitspoelen.
- Plaats dia's in de spuit gefilterde olie rode O-kleurings oplossing voor 3 uur bij kamertemperatuur.
- Differentiëren door het plaatsen van dia's in 85% propyleenglycol gedurende 5 min. Spoel monsters in PBS tweemaal gedurende 5 minuten per stuk.
- Vlek monsters met hematoxyline gedurende 30 s. was in stromend kraanwater gedurende 5 minuten en plaats de glaasjes in DI water.
- Monteer samples met behulp van een op water gebaseerd montage medium en laat de media 's nachts drogen voorbeeld vorming.
9. reologie
- Breng voorgel-oplossingen van stap 5,4 naar de rheometer op ijs.
- Bevestig een 25 mm arm en plaat aan de reometer. Open de reologie software op de computer die is aangesloten op de rheometer.
- Voer rotatie toewijzing uit en bepaal de nulopening. Hef de arm op als u klaar is.
- Pipetteer 500 μL voorgel op de plaat. Verlaag de arm tot de voorgel oplossing de spleet tussen de plaat en de arm volledig inneemt. Wees conservatief omdat het verlagen van de arm voorbij dit punt zal resulteren in een pre-gel oplossing die uit de zijkant morsen.
- Voer een frequentie sweep uit op de voorgel oplossing van 0,1 – 100 Hz nadat deze gedurende 30 minuten bij 37 °C is gebleven.
- Hef de arm van de rheometer op wanneer deze is voltooid. Veeg de vloeistof af met een delicaat taak doekje. Spoel af met DI-water en veeg met een delicaat taak doekje. Herhaal stap 9.4 – 9.6 met extra voorbeelden.
10. phalloidine geconjugeerde kleuring van F-actin
- Breng phalloidin geconjugeerde oplossing op kamertemperatuur. Centrifugeer kort vóór opening met een lage snelheid. Aliquot voldoende oplossing voor de test en bewaar de rest bij-20 °C.
- Verdun 1000x phalloidin conjugaat stockoplossing tot een 1x werkoplossing door 1 μL stockoplossing toe te voegen aan 1 mL 1x PBS + 1% boviene serumalbumine (BSA). Dit maakt genoeg voor 10 putjes (100 μL/goed).
Opmerking: men kan gewoon 1x PBS gebruiken, maar 1x PBS + BSA heeft de voorkeur om te voorkomen dat phalloidin geconjugeerde aan de buis blijft kleven. Bewaar deze oplossing niet na de test. 1 μL blauwe fluorescerende kleurstof (Zie de tabel van de materialen) werkoplossing kan worden toegevoegd aan vlek voor kernen. De werkoplossing kan worden gemaakt door 1 μL 20 mM blauwe fluorescerende kleurstof te mengen met 11,3 μL 1x PBS. - Aspirate media uit Wells (stap 6,1). Spoel putten met 1x PBS.
- Voeg 10% NBF toe. Incuberen Wells met 10% NBF gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant. Was 3 keer met PBS gedurende 5 minuten per keer.
- Voeg 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol toe in PBS gedurende 5 min. aspirate en was 3 keer met PBS gedurende 5 minuten per keer.
- Voeg 100 μL werkoplossing van stap 10,2 toe aan elke put. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Aspireren en wassen 3 keer met PBS voor 5 min elke keer. Laat in PBS bij 4 °C.
- Aspirate en verwijder putten uit de pakking op de kamer glijbaan. Gebruik naald neus pincet om de pakking van de glijbaan te verwijderen. Monteer en afdek monster met behulp van een op water gebaseerd montage medium. Laat genezen (5 min).
- Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop bij excitatie/emissie van 590/618 nm.
11. bepaling van de levensvatbaarheid
- Spoel de cellen af met de PBS van Dulbecco (DPBS). Voeg aan elk goed 100 μL dpbs toe met 1 μm calceïne am en 2 μM ethidiumbromide homodimeer. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Beeld de 16-well kamer glijbaan door fluorescentiemicroscopie. Calcein acetoxymethyl (calcein AM) kan worden waargenomen bij excitatie/emissie = 494/517 nm. Ethidium homodimeer kan worden waargenomen bij excitatie/emissie = 528/645 nm.
- Lees de 96-put plaat op een plaat lezer met dezelfde golflengten in stap 11,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mfp's werden na bestraling met behulp van de in Figuur 1agetoonde procedure decellularized. MFPs pre-decellularisatie (Figuur 1b) en post-decellularisatie (figuur 1c) worden weergegeven. Decellularisatie werd bevestigd met behulp van hematoxyline en eosine (H & E) kleuring, en 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol-kleuring werd gebruikt om het vetgehalte te evalueren (Figuur 2). De Rheologische eigenschappen van de ECM-hydrogels werden ook beoordeeld op 37 °C (Figuur 3). De opslagmodulus was hoger dan het verlies modulus voor alle omstandigheden, aantonen van stabiele hydrogel vorming.
GFP-en Luciferase-gelabelde 4T1-borstkanker cellen werden ingekapseld in de hydrogels. Celproliferatie werd onderzocht door fluorescentiemicroscopie, bioluminescentie metingen en levensvatbaarheid kleuring 48 h na inkaping (Figuur 4). Bestraalde hydrogels toonden een toenemende trend in tumor celproliferatie. Phalloidin geconjugeerd werd gebruikt om F-actin in de ingekapselde cellen te visualiseren (Figuur 5). Deze techniek kan worden gebruikt om celmorfologie en cytoskelet eigenschappen te onderzoeken.
Figuur 1: experimentele workflow. A) Schematische voorstelling van hydrogel vorming. Digitale camerabeelden werden genomen van Mfp's pre-(B) en post-decellularisatie (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: bevestiging van decellularisatie en de-lipidatie in Mfp's. Hematoxylin en eosine kleuring (H & E) van niet-bestraalde Mfp's die zijn ingebed in paraffine en verdeeld over 5 μm (A) werd vergeleken met mfp's die bevroren waren in cryostaat insluitings medium (5 μm-secties) vóór (B) en na decellularisatie (C), geïnineerd met sucrose vóór het invriezen van het cryostatische medium en een afscheiding van 30 μm (D). 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol kleuring werd gedaan om lipide retentie in Mfp's bevroren in cryostaat insluiten medium (5 μm secties) vóór (E) en na decellularisatie (F) te visualiseren en geïncubeerd met sucrose vóór bevriezing in cryostaat insluitings medium en verdeeld over 30 μm secties (G). Schaal staven vertegenwoordigen 50 μm. Decell = decellularisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bevestiging van de vorming van hydrogel. Reologie werd gebruikt om de opslag en het verlies modulus van controle (a) en bestraalde (B) Voorgel oplossing gemaakt van Mfp's bij 37 °c en 0,5% stam te bepalen. Foutbalken tonen standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: tumor celproliferatie in BESTRAALDE ECM-hydrogels. 4T1 celproliferatie 48 h na inoculatie wordt weergegeven met voorgel afgeleid van controle (a) en bestraalde (B) mfp's.C) bioluminescentie signaal van 4t1-cellen die zijn ingebed in de controle en bestraalde hydrogels. Calcein AM gekleurd levende cellen en ethidiumbromide homodimeer gekleurd dode cellen werden geëvalueerd in controle (D) en bestraalde (E) hydrogels, en de Live/Dead verhouding werd gekwantificeerd (F). Schaal staven vertegenwoordigen 200 μm. Foutbalken geven standaardfout weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: cytoskelet eigenschappen in ECM-hydrogels. Cellen binnen (A) controle en (B) bestraalde ECM-hydrogels worden gekleurd met phalloidin-conjugaat om F-actin (rood) en blauwe fluorescerende kleurstof te visualiseren om kernen (blauw) in bestraalde mfp's te visualiseren. schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Weefsel gewicht (g) | Controle (0 Gy) |
Bestraalde (20 Gy) |
| Eerste MFP-gewicht | 0,461 | 0,457 |
| MFP-gewicht na histologische monster verwijdering | 0,423 | 0,416 |
| MFP gewicht na decellularisatie | 0,025 | 0,025 |
| Met decellularized MFP-gewicht na histologie monster verwijdering | 0,015 | 0,016 |
Tabel 1: weefsel gewichten voor en na decellularisatie. Representatieve weefsel gewichten voor elke aandoening werden gemeten vóór en na de decellularisatie van de MFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode van hydrogel vorming is grotendeels afhankelijk van de hoeveelheid start weefsel. Murine Mfp's zijn klein en het decellularisatie proces resulteert in een significante reductie van materiaal (tabel 1). Het proces kan worden herhaald met meer Mfp's om de uiteindelijke opbrengst te verhogen. Frezen is een andere belangrijke stap die kan leiden tot verlies van materiaal. Anderen hebben succes getoond met een cryogene molen, maar dit protocol is gebaseerd op frezen via een handheld mortel en elektrische boor met een vijzel bijlage8,17. Dit heeft het voordeel van lagere kapitaalkosten en minimaliseert materiaalverlies, maar kan variabiliteit in het eindproduct introduceren.
Een uitdaging voor de bevestiging van decellularisatie en de-lipidatie is in bevriezing vetweefsel in cryostaat inbedding medium. Figuur 2a toont H & E kleuring van een niet-BESTRAALD MFP ingesloten en in paraffine verdeeld. Verschillende kernen zijn zichtbaar op de randen van adipeus cellen in de buurt van knooppunten met andere cellen, en adipocyte morfologie is goed onderhouden. Figuur 2b , C, E, F tonen mfp's voorbereid door het insluiten en bevriezen van mfp's in cryostaat insluitings medium en het snijden van segmenten van 5 μm. Dit proces was niet in staat om de morfologie en vorm van adipocyten te behouden. Echter, decellularisatie werd bevestigd door het verlies van kernen en andere sporen van DNA (figuur 2c), en de-lipidatie werd gevisualiseerd met het verlies van neutrale lipide-Inhoudkleuring (figuur 2F). De morfologie van adipocyten werd gehandhaafd door het inbedden van Mfp's in sucrose, insluiten en invriezen in het cryostatische medium en het snijden van schijfjes van 30 μm (figuur 2D, G). Terwijl de visualisatie van H & E kleuring moeilijk was met deze methode (figuur 2D), 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol kleuring bevestigde de retentie van adipocyte morfologie (figuur 2g).
We hebben een in vitro hydrogel model ontwikkeld dat de in vivo normale weefsel microomgeving en de reactie op stralings schade kan nabootsen. ECM hydrogels zijn vervaardigd in soortgelijke studies, maar de impact van stralings schade op tumor Celgedrag is niet beoordeeld9,12,16,17,18. We verwachten dat bestraling van Mfp's ECM-remodellering en samenstelling zal veranderen, en deze compositorische veranderingen zullen worden gekarakteriseerd in toekomstige studies. We observeerden een toenemende trend in de proliferatie van 4T1-cellen binnen bestraalde ECM-hydrogels met behulp van zowel bioluminescentie beeldvorming als leefbaarheid kleuring (Figuur 4). Daarnaast gebruikten we phalloidin-conjugaat om F-actine-filamenten in ingekapselde tumorcellen te vlekkenen vonden ze een kwalitatieve toename in actine-uitlijning en tumor celverlenging in bestraalde ECM-hydrogels, wat suggereert dat een toename van de adhesie kracht en invasieve capaciteit (Figuur 5)19,20. Toekomstige experimenten zullen de veranderingen in de focale adhesie dynamiek en de door protease gemedieerde remodellering onderzoeken voor de evaluatie van Celmigratie en invasie.
Deze methode werd ontwikkeld met behulp van een Murine TNBC cellijn, maar deze methode kan worden gebruikt als een platform voor het evalueren van de proliferatie en invasiviteit van andere celtypen. Toekomstige studies kunnen immuuncellen bevatten om hun rol te bepalen in reactie op straling en andere vormen van weefselbeschadiging (bijv. chirurgie). Hoewel deze studie ECM-hydrogels evalueerde van MFPs bestraalde ex vivo, zullen aanvullende onderzoeken in vivo straling van Mfp's onderzoeken om het effect van fysiologische stralings respons en infiltrerende immuuncellen op ECM-kenmerken te evalueren. We hebben een methode vastgesteld om ECM-hydrogels te fabriceren van muis Mfp's om het effect van normale weefsel straling op het tumor Celgedrag te bestuderen, en deze techniek kan worden uitgebreid tot menselijk weefsel voor een relevanter hydrogel-model. Over het algemeen kan het onderzoeken van normale weefselschade door middel van ECM-hydrogels leiden tot inzicht in de rol van ECM-veranderingen na stralingstherapie in lokale recidief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Laura L. bronsart voor het leveren van de GFP-en Luciferase-4t1 cellen, Dr. Edward l. lagory voor advies over 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol kleuring, Dr. Craig L. Duvall voor ivis en lyofilisator gebruik, en Dr. Scott A. guelcher voor rheometer Gebruiken. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
